CN117551812A - 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 - Google Patents
用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117551812A CN117551812A CN202311346518.6A CN202311346518A CN117551812A CN 117551812 A CN117551812 A CN 117551812A CN 202311346518 A CN202311346518 A CN 202311346518A CN 117551812 A CN117551812 A CN 117551812A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pabv
- type
- detecting
- sequence
- complement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 68
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 10
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- -1 MGB Chemical compound 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 241001611293 Parrot bornavirus 2 Species 0.000 claims 11
- 241000488204 Parrot bornavirus 5 Species 0.000 claims 11
- 241001611290 Parrot bornavirus 4 Species 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 claims 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 abstract description 43
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 19
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 241001115070 Bornavirus Species 0.000 abstract description 7
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102220566182 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-7_H27N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001611294 Parrot bornavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001611289 Parrot bornavirus 7 Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于病毒检测技术领域，公开了用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用。具体公开了一种试剂，包括引物组和/或探针组。本发明提供的试剂可用于对PaBV高度保守的P基因片段进行检测，可同时快速检测鉴定导致鹦鹉腺胃扩张症的博尔纳病毒2型、4型和5型三种基因型，且具备极高的检测敏感性与特异性，检测结果准确可靠。实现了在一管反应中只进行1次PCR扩增即可对鹦鹉博尔纳病毒3种基因型的病原进行检测。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用。
背景技术
鹦鹉博尔纳病毒(Parrot Bornavirus，PaBV)是指导致鹦鹉腺胃扩张症(Proventricular Dilatation Disease，PDD)的一种博尔纳病毒科成员。PDD是一种致命的传染病，能导致圈养鹦鹉的大规模死亡。由于其持续性感染的特点和缺乏抗病毒药物，PaBV一旦在鸟舍中传播就难以根除，对全球鹦鹉养殖业造成极大威胁。一方面由于鹦鹉的羽毛艳丽、善学人语等原因，很多国家都将其作为宠物饲养和观赏鸟饲养，鹦鹉的国际贸易逐年增多；另一方面，由于无症状的鹦鹉中观察到PaBV感染和检出后至少需要2个月才能显示临床症状，因此，建立高度灵敏的PaBV感染检测方法对于在病毒传播之前隔离受感染的鸟类是必要的。已有研究者开发出被用于检测PaBV RNA的RT-PCR和RT-qPCR检测方法，且后者灵敏度更高。
PaBV共有7个基因型，其中PaBV-4型是全球鹦鹉感染的主要基因型，近年关于在玄凤鹦鹉中发现的PaBV-2型和凤头鹦鹉中发现的PaBV-5型的研究报道也逐渐增多，但针对PaBV-5型的研究还不多见。不同基因型对鹦鹉造成的临床症状和流行特点都很相似，如若不加以区分，很容易造成圈养鹦鹉群体的交叉感染和病毒的变异，引起更大的经济损失和公共安全危害，鉴于此，有必要开发一种可用于临床预防和区分PaBV三种基因型(PaBV-2、PaBV-4和PaBV-5)的快速检测方法。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种试剂。
本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种同时检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的三重荧光PCR检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种试剂，包括引物组和/或探针组，所述引物组和探针组的核苷酸序列如下所示：
所述引物组用于检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
其中，所述检测PaBV-2型的引物为：
PaBV-2-F1：5’-GAACGAAACTATGAAGATGA-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-2-R1：5’-GTTGGGTAAATTCTAGAAGG-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-4型的引物为：
PaBV-4-F1：5’-GAGCAAGTCAAGAAGAAC-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-4-R1：5’-CCGAATTAGGTCATCATTC-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-5型的引物为：
PaBV-5-F1：5’-AGACCATCAAGAAGAACC-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-5-R1：5’-CCTCTTAATCCTTCATTCTC-3’，或为该序列的互补序列；
所述探针组用于检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
其中，所述检测PaBV-2型的探针为：
PaBV-2-P1：5’-TCTTCTCTATTCGGCGATGGCAA-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-4型的探针为：
PaBV-4-P1：5’-TCCATGATCTCAGACCAAGAGCC-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-5型的探针为：
PaBV-5-P1：5’-CTCCGCCAATTCAGTTACGAGC-3’，或为该序列的互补序列。
在本发明一些实施方式中，所述探针序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，各探针序列之间标记的荧光基团不同。
在本发明一些实施方式中，所述荧光基团为FAM、Hex、VIC、TAMRA、ROX、Texas-Red和CY5中的至少一种。
在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种。
在本发明一些实施方式中，所述荧光基团连接在探针的5’端。
在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团连接在探针的3’端。
在本发明一些优选实施方式中，所述PaBV-2-P的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接淬灭基团BHQ1
在本发明一些优选实施方式中，所述PaBV-4-P的5’端连接荧光基团Hex，3’端连接淬灭基团BHQ1。
在本发明一些优选实施方式中，所述PaBV-5-P的5’端连接荧光基团Texas-Red，3’端连接淬灭基团BHQ1。
本发明的第二个方面，提供一种包含本发明第一方面的试剂的试剂盒。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应液和阳性参考品。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
(1)鉴别PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(2)制备检测或辅助检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
(3)检测待测样品是否为PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(4)制备检测或辅助检测待测样品是否为PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
(5)检测待测样品是否感染PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
上述应用用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的第四个方面，提供一种同时检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的三重荧光PCR检测方法，包括使用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
在本发明一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：
1)从待测样品中提取核酸；
2)以步骤1)的核酸为模板，用所述试剂或所述试剂盒进行三重荧光PCR扩增反应，收集荧光信号；
3)根据荧光信号判定样品中是否含有PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中多重荧光PCR扩增反应体系为：
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中三重荧光PCR扩增反应程序为：35～40℃，2～3min；94～96℃，4～6min；90～95℃8～10s，50～62℃30～35s，40～45个循环
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中三重荧光PCR扩增反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。
在本发明一些实施方式中，PCR反应液为AceQ Universal U+Probe Master MixV2。
在本发明一些实施方式中，所述检测方法的结果判定方法为：在实验成立的基础上，如果待测样本检测结果在FAM通道Ct值≤37.01且有扩增曲线，则判断为PaBV2型阳性；如果在Hex通道Ct值≤36.64且有扩增曲线，则判为PaBV4型阳性；如果在Texas-Red通道Ct值≤35.29且有扩增曲线，则判为PaBV5型阳性；如果在三个通道检测无Ct值或Ct值＞37.01，则判为PaBV2型、PaBV4型和PaBV5型阴性；如果待测样本在任意通道35.29＜Ct值≤37.01，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测，重复检测结果无Ct值则为阴性，否则阳性。
本发明的有益效果是：
本发明提供的试剂可用于对PaBV高度保守的P基因片段进行检测，可同时快速检测鉴定导致鹦鹉腺胃扩张症的博尔纳病毒2型、4型和5型三种基因型，且具备极高的检测敏感性与特异性，检测结果准确可靠。实现了在一管反应中只进行1次PCR扩增即可对鹦鹉博尔纳病毒3种基因型的病原进行检测。
本发明提供的检测试剂盒突破了单重荧光PCR检测的限制，可同时实时检测样品中鹦鹉博尔纳病毒2型、4型和5型三种基因型的含量，灵敏度高、特异性强、重复性好，成本低，可同时检测大量样本，且与其它禽类病毒无交叉反应，非常适合大量临床样品的检测和疫情监控，为导致鹦鹉腺胃扩张症的病原微生物鉴定和降低养殖经济损失提供科学可靠的方法。
附图说明
图1为实施例3检测方法检测质粒标准品时的扩增曲线。
图2为实施例3检测方法检测质粒标准品(PaBV-2)的标准曲线。
图3为实施例3检测方法检测质粒标准品(PaBV-4)的标准曲线。
图4为实施例3检测方法检测质粒标准品(PaBV-5)的标准曲线。
图5为实施例5的检测方法敏感性检测结果。
图6为实施例7的检测方法特异性检测结果。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1靶标选择、引物及探针的筛选及优化
在美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)上下载鹦鹉博尔纳病毒2型(PaBV-2)、鹦鹉博尔纳病毒4型(PaBV-4)和鹦鹉博尔纳病毒5型(PaBV-5)的全基因序列，使用MEGA 11.0进行保守序列的筛选，针对PaBV的P基因片段，用Primer Premier 6.0与Oliogo 7进行引物及探针的设计与筛选，初步筛选得到的引物如表1所示。进一步经过BLAST比对验证后，确定引物与探针的特异性，最终筛选出的引物探针组合的核酸序列分别为PaBV-2-F1(SEQ ID NO:1)、PaBV-2-R1(SEQ IDNO:2)、PaBV-2-P1(SEQ ID NO:3)；PaBV-4-F1(SEQ ID NO:6)、PaBV-4-R1(SEQ ID NO:7)、PaBV-4-P1(SEQ ID NO:8)；PaBV-5-F1(SEQ ID NO:11)、PaBV-5-R1(SEQ ID NO:12)、PaBV-5-P1(SEQ ID NO:13)。
表1引物及探针序列
其中，PaBV2型检测探针的5’端进行羧基荧光素FAM标记，3’端进行淬灭基团BHQ1标记；
PaBV4型检测探针的5’端进行羧基荧光素Hex标记，3’端进行淬灭基团BHQ1标记；
PaBV5型检测探针的5’端进行羧基荧光素Texas-Red标记，3’端进行淬灭基团BHQ2标记。
实施例2质粒标准品构建
使用MEGA 11.0对三种基因型的PaBV进行同源比对，进化树分析，筛选出保守序列，为使后续的三种病毒优化时质粒浓度可以均一化，将PaBV-2、PaBV-4、PaBV-5的病毒保守序列分别合成基于pET-23a-PaBV的质粒标准品。质粒由上海生工生物工程基因股份有限公司进行合成。据公式(浓度ng/μL×6.02×1023×10-9)/(DNA长度×660)计算各质粒标准品的拷贝数并稀释成合适的拷贝数。
实施例3三重荧光PCR检测方法建立并优化
一种用于检测PaBV三种基因型的三重实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)获得待测样品的核酸；
(2)以步骤(1)中的核酸为模板，使用实施例1设计筛选出来的引物、探针组合进行三重实时荧光定量PCR。其中，三重实时荧光定量PCR扩增条件为：2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 10μL；鹦鹉博尔纳病毒2型(PaBV-2)上/下游引物10μM各0.4μL、鹦鹉博尔纳病毒2型(PaBV-2)探针10μM 0.2μL；鹦鹉博尔纳病毒4型(PaBV-4)上/下游引物10μM各0.6μL、鹦鹉博尔纳病毒4型(PaBV-4)探针10μM 0.2μL；鹦鹉博尔纳病毒5型(PaBV-5)上/下游引物10μM各0.3μL、鹦鹉博尔纳病毒5型(PaBV-5)探针10μM 0.2μL；模板为2μL；补充灭菌去离子水至终体积为20μL。反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。
(3)用上述反应条件和体系进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品(由实施例2制得)起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)，获得其敏感性试验数据。
结果判定：在实验成立的基础上，如果待测样本检测结果在FAM通道Ct值≤37.01且有扩增曲线，则判断为PaBV2型阳性；如果在Hex通道Ct值≤36.64且有扩增曲线，则判为PaBV4型阳性；如果在Texas-Red通道Ct值≤35.29且有扩增曲线，则判为PaBV5型阳性；如果在三个通道检测无Ct值或Ct值＞37.01，则判为PaBV2型、PaBV4型和PaBV5型阴性；如果待测样本在任意通道35.29＜Ct值≤37.01，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测，重复检测结果无Ct值则为阴性，否则阳性。
使用矩阵法进行TaqMan三重qPCR反应体系优化，PaBV-2、PaBV-4和PaBV-5的优化使用单一重组质粒pET-23a-PaBV为模板，具体如下表2。
表2Taqman反应体系
退火温度的优化：分别在50℃、55℃与60℃三个温度梯度进行体系优化，通过计算扩增效率，确定最佳退火温度为60℃。优化结果见表3。
表3退火温度的优化结果
引物和探针浓度的优化：将表1中筛选出来的qPCR引物分别稀释至20μmol/L，各上下游引物等份混合均匀后，混合引物按照50μL/管分装，引物添加量由0.2μL～0.8μL共7个梯度进行qPCR扩增，确定最佳引物浓度；qPCR探针分别稀释至10μmol/L，分装后，探针添加量由0.1μL～0.4μL共4个梯度进行qPCR扩增，确定最佳探针添加量均为0.2μL。优化结果见表4～表6。
表4PaBV-2引物的优化结果
表5PaBV-4引物的优化结果
表6PaBV-5引物的优化结果
体系经过优化后，三重实时荧光定量PCR扩增条件为：2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 10μL；鹦鹉博尔纳病毒2型(PaBV-2)上/下游引物10μM各0.4μL、鹦鹉博尔纳病毒2型(PaBV-2)探针10μM 0.2μL；鹦鹉博尔纳病毒4型(PaBV-4)上/下游引物10μM各0.6μL、鹦鹉博尔纳病毒4型(PaBV-4)探针10μM 0.2μL；鹦鹉博尔纳病毒5型(PaBV-5)上/下游引物10μM各0.3μL、鹦鹉博尔纳病毒5型(PaBV-5)探针10μM 0.2μL；模板为2μL。补充灭菌去离子水至终体积为20μL。
反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。
实施例4标准曲线建立
以质粒标准品(实施例2)为模板，按10倍梯度稀释为：3.483×106copies/μL、3.483×105copies/μL、3.483×104copies/μL、3.483×103copies/μL、3.483×102copies/μL、3.483×101copies/μL，然后分装并于-20℃保存；使用实施例3中的反应体系对稀释后的质粒进行扩增检测。扩增结果如图1所示，获得模板拷贝数与循环数(Ct值)，检测结束后，以各标准品的浓度lg值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，结果见图2～图4。
根据公式：扩增效率E＝10-1/斜率-1，由图2～图4可知，PaBV-2、PaBV-4和PaBV-5的斜率分别是：-3.250、-3.200、和-3.310，计算可得PaBV-2、PaBV-4和PaBV-5的扩增效率分别是：103.09％、105.35％和100.50％，证明实施例3构建的三重荧光定量PCR扩增效率高。
实施例5敏感性试验
将在上海生工生物工程合成的重组标准质粒(pET-23a-PaBV，实施例2)干粉加适当的无菌水稀释到100ng/μL，据公式(浓度ng/μL×6.02×1023×10-9)/(质粒长度×660)计算返还各质粒的拷贝数并梯度稀释(按10倍梯度稀释)，将稀释后的标准质粒做模板进行敏感性试验。
使用实施例3的检测方法进行三重实时荧光定量PCR检测。结果见图5，PaBV-2、PaBV-4、PaBV-5的检测下限均为：34.8copies/μL，分别对应的循环数：37.01、36.64和35.29，证明建立的方法具有良好的灵敏性。
实施例6重复性试验
以10倍梯度稀释的定量PCR质粒标准品(实施例2)为模板，按10倍梯度稀释为：3.483×106copies/μL、3.483×105copies/μL、3.483×104copies/μL、3.483×103copies/μL，使用实施例3的检测方法进行三重实时荧光定量PCR检测，每次三个重复，进行三次，分别计算循环数均值、标准差和变异系数；结果见表7，组内以及组间的变异系数均小于0.76％，证明建立的方法重复性好。
表7三重荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果
实施例7特异性检测
将实施例3的检测方法用于检测常见禽类病毒及PaBV其他基因型，使用商品化的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N2 rFJ56株+H7N9 rGD76株)、鸡新城疫活疫苗(La Sota株)、禽传染性支气管炎H120株疫苗作为禽流感病毒、鸡新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒的阳性对照，PaBV-1、PaBV-3、PaBV-7型的阳性质粒通过上海生工生物工程股份有限公司合成。
实验结果见图6(图中出现的扩增曲线为质粒标准品扩增曲线)。检测结果表明禽流感病毒、鸡新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒等常见禽类病毒以及PaBV其他基因型的检测结果均为阴性，质粒标准品正常检出，表明实施例3的检测方法特异性良好。
实施例8临床样本的检测
对来自动物园和野生动物救护中心的380份临床样本进行检测。分别使用传统的单重RT-PCR检测方法(翟俊琼等，2021)和实施例3的检测方法进行检测。结果显示，使用实施例3的检测方法检出的PaBV-2阳性率为3.16％(12/380)、PaBV-4阳性率为11.05％(42/380)、PaBV-5阳性率为(24/380)，单重RT-PCR检出的PaBV-2阳性率为3.42％(13/380)、PaBV-4阳性率为11.84％(45/380)、PaBV-5阳性率为6.31％(25/380)。两种方法共同确定的阳性样品和阴性样品数量具体见表8，根据公式计算结果可知，使用实施例3的检测方法的样品阳性符合率在84％～88.89％、阴性符合率在99.15％～99.73％、总符合率在98.06～99.21％。表明实施例3的检测方法能够快速、准确、可靠地检测鉴别临床样品中鹦鹉博尔纳病毒2型、4型和5型。
表8临床样品对比检测试验
注:总符合率＝(真阳性+真阴性)/(真阳性+真阴性+假阳性+假阴性)*100％；阳性符合率＝真阳性/(真阳性+假阴性)*100％；阴性符合率＝真阴性/(真阴性+假阳性)*100％。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种试剂，包括引物组和/或探针组，所述引物组和探针组的核苷酸序列如下所示：所述引物组用于检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
其中，所述检测PaBV-2型的引物为：
PaBV-2-F1：5’-GAACGAAACTATGAAGATGA-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-2-R1：5’-GTTGGGTAAATTCTAGAAGG-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-4型的引物为：
PaBV-4-F1：5’-GAGCAAGTCAAGAAGAAC-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-4-R1：5’-CCGAATTAGGTCATCATTC-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-5型的引物为：
PaBV-5-F1：5’-AGACCATCAAGAAGAACC-3’，或为该序列的互补序列；
PaBV-5-R1：5’-CCTCTTAATCCTTCATTCTC-3’，或为该序列的互补序列；
所述探针组用于检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
其中，所述检测PaBV-2型的探针为：
PaBV-2-P：5’-TCTTCTCTATTCGGCGATGGCAA-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-4型的探针为：
PaBV-4-P：5’-TCCATGATCTCAGACCAAGAGCC-3’，或为该序列的互补序列；
所述检测PaBV-5型的探针为：
PaBV-5-P：5’-CTCCGCCAATTCAGTTACGAGC-3’，或为该序列的互补序列。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，各探针序列之间标记的荧光基团不同。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光基团为FAM、Hex、VIC、TAMRA、ROX、Texas-Red和CY5中的至少一种；和/或，所述淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3中任一项所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、酶和阳性参考品。
6.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用；
(1)鉴别PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(2)制备检测或辅助检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
(3)检测待测样品是否为PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(4)制备检测或辅助检测待测样品是否为PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
(5)检测待测样品是否感染PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型；
(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的产品；
上述应用用于非疾病的诊断和治疗。
7.一种同时检测PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型的三重荧光PCR检测方法，包括使用权利要求1～3中任一项所述的试剂和/或权利要求4或5所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
1)从待测样品中提取核酸；
2)以步骤1)的核酸为模板，用所述试剂或所述试剂盒进行三重荧光PCR扩增反应，收集荧光信号；
3)根据荧光信号判定样品中是否含有PaBV-2型、PaBV-4型和/或PaBV-5型。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中多重荧光PCR扩增反应体系为：
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中三重荧光PCR扩增反应程序为：35～40℃，2～3min；94～96℃，4～6min；90～95℃8～10s，50～62℃30～35s，40～45个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311346518.6A CN117551812A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311346518.6A CN117551812A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117551812A true CN117551812A (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=89822285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311346518.6A Pending CN117551812A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117551812A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028544A (zh) * | 2024-04-11 | 2024-05-14 | 广东华南珍稀野生动物物种保护中心 | 一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒n基因的引物对及其应用 |
-
2023
- 2023-10-17 CN CN202311346518.6A patent/CN117551812A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028544A (zh) * | 2024-04-11 | 2024-05-14 | 广东华南珍稀野生动物物种保护中心 | 一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒n基因的引物对及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114752711B (zh) | 检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN107299155B (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
| CN110760620A (zh) | 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法 | |
| CN110872637A (zh) | 一种鉴别非洲猪瘟基因缺失疫苗的试剂、检测方法及应用 | |
| CN113652505B (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| CN113005226A (zh) | 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒 | |
| CN117551812A (zh) | 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用 | |
| CN114634996B (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| WO2023279042A2 (en) | Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants | |
| CN113481325B (zh) | 检测新型冠状病毒b.1.1.7突变株的方法和试剂盒 | |
| CN109439801A (zh) | 一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN106282176A (zh) | 一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用 | |
| KR20220112623A (ko) | 아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 | |
| CN116162734B (zh) | 一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒 | |
| CN114480726B (zh) | 非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法 | |
| CN111719020B (zh) | 一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针 | |
| CN112266978A (zh) | 引物探针组合、检测试剂盒及其应用 | |
| CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
| CN112126713A (zh) | 一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途 | |
| CN111549175A (zh) | 一种检测口岸输入2019新型冠状病毒多重荧光rt-pcr检测试剂 | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| CN117683910B (zh) | 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用 | |
| CN112126714B (zh) | 一种冠状病毒检测产品及其用途 | |
| CN113584231B (zh) | 鉴定i群禽腺病毒血清8型的方法 | |
| KR102499185B1 (ko) | TaqMan 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 COVID-19 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |