CN117683910B - 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用 - Google Patents

血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117683910B
CN117683910B CN202410137099.3A CN202410137099A CN117683910B CN 117683910 B CN117683910 B CN 117683910B CN 202410137099 A CN202410137099 A CN 202410137099A CN 117683910 B CN117683910 B CN 117683910B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
detection
its1
blood egg
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202410137099.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117683910A (zh
Inventor
谢国驷
黄倢
毕竞男
朱梦婷
杨柳鑫
万晓媛
王海亮
李晨
史成银
张庆利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN202410137099.3A priority Critical patent/CN117683910B/zh
Publication of CN117683910A publication Critical patent/CN117683910A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117683910B publication Critical patent/CN117683910B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用。本发明以血卵涡鞭虫ITS 1(first internal transcribed spacer 1)为靶基因设计出特异性引物组及探针，建立TaqMan‑MGB探针实时荧光定量PCR和等温扩增技术用于血卵涡鞭虫的检测，两种方法特异性强，检测结果重复性好，对目的基因的检测灵敏度分别为5.66和88.9拷贝/反应。等温扩增时，仅需一个水浴锅或金属浴即可在20min内可完成检测，可适用于现场快速检测，具有良好的应用开发前景。

Description

血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及血卵涡鞭虫（Hematodinium perezi）的检测引物组和探针及其应用。
背景技术
血卵涡鞭虫（Hematodiniumspp.）是一类海水甲壳类寄生性甲藻，自1931年首次报道以来，世界范围内40多种甲壳动物有该病原的感染报道，近年来该病原的新宿主也在不断发现和报道中。目前该属仅有两个正式命名的物种，即典型种H.perezi和H.australis。基于血卵涡鞭虫第一内转录间隔区（Internal transcribed spacer 1，ITS 1）基因序列的遗传比对分析，H.perezi被分为三个基因型，中国主要流行株的基因型属于H.pereziII型。血卵涡鞭虫在2004年中国浙江舟山地区养殖的三疣梭子蟹中首次发现，目前该病原已成为三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）、锯缘青蟹（Scylla Serrata）和脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）等重要经济甲壳类的重要病原之一。
血卵涡鞭虫的检测方法可采用传统方法如血涂片法、组织病理分析等，以及免疫学方法如酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和间接荧光抗体检测技术（Indirect fluorescent antibody technique，IFAT）等，但该方法存在如灵敏度低，检测时间长和需要有经验的专业人士参与等问题。随着分子检测技术的发展，目前对血卵涡鞭虫的诊断多采用分子生物学技术，如PCR、套式PCR、环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）和实时荧光定量PCR方法等。
荧光定量PCR检测方法中，Taqman-MGB探针作为新型探针，通过TaqMan探针的3’端加入一个能插入DNA小沟的小沟结合物（MGB），可以大大提高探针的Tm值，提高检测的特异性，并可有效降低荧光背景信号，提高检测的灵敏度。但目前尚没有利用Taqman-MGB探针对血卵涡鞭虫的定量检测方法。鉴于血卵涡鞭虫目前没有有效的防控方法，因此建立一种高灵敏度、特异性强的检测方法对该病原的早期诊断、预警和防控极为重要。
环介导等温扩增技术是Notomi等（2000）发明的一种基因等温扩增技术，该方法中包括有4条引物，即F3、B3、FIP和BIP，其中FIP由引物F1c和F2组成，BIP由引物B1c和B2组成。Nagamine等（2002）进一步发展该等温扩增技术，即在原来4条引物的基础上，另添加一对也可启动链置换DNA合成的LOOP环引物LF和LB，其中LF在引物F1c和F2之间，LB在引物B1c和B2之间，可进一步提高反应速度。但有限的设计序列空间及反应扩增对LOOP环引物的严格设计要求，LOOP环引物并不容易设计得到，或仅能设计其中的1条引物。施慧等（2010）首次报道了血卵涡鞭虫的LAMP的检测方法，所用的4条引物，以重组质粒为模板的检测灵敏度可以达到10-6ng/uL,检测可以45～60min完成。在LAMP反应体系中，加入EvaGreen®染料，随着反应产物量的增加，与其结合的荧光染料也越来越多，相应的荧光信号强度也随之增强，置于荧光定量PCR仪中，不需要荧光基团修饰的探针，即可快速实现对检测靶基因的实时定量检测。目前血卵涡鞭虫的检测中尚没有利用LOOP环引物的等温扩增检测方法（即共使用6条引物）的报道，也没有基于等温扩增技术同时利用EvaGreen®染料来实现该病原定量检测的报道。
发明内容
本发明的目的是提供血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用，本发明针对采集的血卵涡鞭虫样品的ITS1核酸序列得到可用于荧光定量PCR检测的引物2条及探针1条，还提供了可用于等温扩增的引物6条，使用本发明所述引物组和探针检测血卵涡鞭虫，检测时间短、灵敏度高，特异性强。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明所述的血卵涡鞭虫的检测引物组的核苷酸序列如下：
第一套引物组和探针组成及核苷酸序列：
引物1 ITS1F：5’-TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACA-3’，如SEQ ID NO：1所示；
引物2 ITS1R：5’-TAGAGATGTTGTGTTTATGGAAAGCA-3’，如SEQ ID NO：2所示；
还包括探针：ITS1-Probe：5’-CTACCACTGAACTCCT-3’，如SEQ ID NO：3所示，探针5’端和3’端分别修饰荧光报告和荧光淬灭基团。优选，所述的探针可以为Taqman-MGB探针，5’端修饰荧光报告基团6-carboxyfluorescein（6-FAM），3’端修饰MGB（minor groovebinder）-NFQ（nonfluorescent quencher）。
第二套引物组组成及核苷酸序列：
引物1 ITS1-F3：5’-CACACACAAACATTCACCG-3’，如SEQ ID NO：4所示；
引物2 ITS1-B3：5’-GATGGAGGAGTTCAGTGG-3’，如SEQ ID NO：5所示；
引物3 ITS1-FIP：5’-CTGTAGTAACCAACACGCCGTTTTTGAACCTTAGCCATTAGCT-3’，如SEQ ID NO：6所示；
引物4 ITS1-BIP： 5’-GCTTGAACTACACACACTAGTACCTTTTCTACCACCGTACCCTCAC-3’，如SEQ ID NO：7所示；
引物5 ITS1-LF：5’-CAGTAGCTAGCTAGTAGTCGTCG-3’，如SEQ ID NO：8所示；
引物6 ITS1-LB：5’-TGTCTCTTGCTGGTAGGAGAA-3’，如SEQ ID NO：9所示。
第一套引物组及探针是根据血卵涡鞭虫ITS1基因高度保守核苷酸序列设计得到，所述高度保守核苷酸序列为：TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACACGCCTACCACTGAACTCCTCCATCCCACGTTTGCTTTCCATAAACACAACATCTCTA，如SEQ ID NO：10所示。
第一套引物组及探针的检测方法应用于荧光定量PCR检测方法中，使用引物和探针ITS1F、ITS1R、ITS1-Probe，探针5’端和3’端分别修饰荧光报告和荧光淬灭基团。优选，探针可以为5’端修饰荧光报告基团6-FAM，3’端修饰MGB-NFQ；还可以使用引物为ITS1F、ITS1R，并另添加荧光染料。引物1 ITS1F和引物2 ITS1R及探针的终浓度均为0.1-0.5μM，检测反应置于定量PCR仪器中进行。反应程序为：95℃预变性30sec，95℃变性5sec，60℃退火及延伸30sec，共40个循环。
检测结果中，使用引物和探针ITS1F、ITS1R、ITS1-Probe，在阴性对照无污染的情况下，样品有扩增曲线时，视为样品血卵涡鞭虫检测阳性，可以根据模板量与CT值间的线性关系和检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
检测结果中，使用引物为ITS1F、ITS1R，并另添加荧光染料，在阴性对照无污染的情况下，产物的溶解曲线为单峰图时，视为样品血卵涡鞭虫检测阳性。可以根据模板量与CT值间的线性关系和检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
第二套引物组的检测方法为等温扩增技术，使用引物为引物1-4，还可使用引物1-6。反应程序为：60-68℃恒温1min，60个循环，优选65.1-68.0℃，更优选66.7℃；反应结束后体系置于80℃，5min终止反应。
反应体系各组分用量包括：MgSO4的终浓度为4.0-12.0mM，dNTPs的浓度为0.8-1.8mM，Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶的浓度为0.128-0.576U/μL（对应25μL中用量为3.2-14.4U），甜菜碱（Betaine）的浓度为0-1.4mM；优选，MgSO4的终浓度为6.0mM，dNTPs的浓度为1.2mM，Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶的浓度为0.512U/μL，甜菜碱的用量为0.0mM。检测结果通过电泳条带来进行判断分析，在阴性对照无污染的情况下，电泳产物为阶梯状的条带为样品血卵涡鞭虫检测阳性，反之为样品血卵涡鞭虫检测阴性；还可在扩增反应的产物中按2%体积比添加核酸染料GeneFinderTM，加入该核酸染料后阴性对照和阴性样品为橙黄色，扩增反应产物由橙黄色变为荧光绿色为血卵涡鞭虫检测阳性。
第二套引物组的检测方法还可以置于定量PCR仪中对病原进行定量检测，反应体系各组分用量包括：MgSO4的终浓度（包括1×Isothermal amplification buffer中2.0mMMg2+）为4.0-12.0mM，dNTPs的浓度为0.8-1.8mM，Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶的浓度为0.128-0.576U/μL（对应25μL中用量为3.2-14.4U），Betaine的浓度为0-1.4mM，EvaGreen®Dye浓度为0.5-2.5μM。优选，MgSO4的终浓度为6.0mM，dNTPs的浓度为1.2mM，Bst2.0WarmStart®DNA聚合酶的浓度为0.512U/μL，Betaine的用量为0.0mM，EvaGreen®Dye的浓度为0.75μM。检测结果通过扩增曲线进行分析，在阴性对照无污染的情况下，有扩增曲线为样品血卵涡鞭虫检测阳性，无扩增曲线为血卵涡鞭虫检测阴性；还可根据模板量与CT值间的线性关系及检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
本发明的引物组和探针用于非疾病的诊断和治疗目的的血卵涡鞭虫的检测及定量分析，包括用于制作检测试剂或试剂盒产品，用于开展血卵涡鞭虫及其成分存在状况的分析、检疫和流行病学监测，用于进行环境、水体、饲料、工具的检测，用于对非患病动物受精卵、苗种、幼体、成体、亲本中可能存在的血卵涡鞭虫进行检测，用于在饲料销售、药品销售、苗种销售等非疾病诊断目的的服务中附带进行样品检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、检测时间短、灵敏度高
第一套引物组和探针可以1小时内可完成检测，对目的基因的检测灵敏度为5.66拷贝/反应，该灵敏度要优于已报道的血卵涡鞭虫其他定量PCR检测方法的灵敏度，这对该病原的早期诊断、预警和防控极为重要；
第二套引物组用于等温扩增的检测中，较已报道血卵涡鞭虫的LAMP检测方法增加了一对LOOP环引物，其检测灵敏度更高，检测时间更短，可在20min内完成对8.89×101-8.89×108拷贝范围的目的基因完成检测，其检测灵敏度为88.9拷贝/反应。
2、特异性强
针对我们各地收集样品中血卵涡鞭虫ITS1基因核苷酸序列的保守序列，本发明所设计的引物组和探针特异性强，特异性验证中，本发明的引物组和探针对多种甲壳类的其他病原均无交叉反应；
其中第一套引物和探针对应的80bp序列与我们多年流行病学调查所获的41株血卵涡鞭虫的ITS1对应序列完全一致。我们采样的样品来自血卵涡鞭虫阳性的三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）、高野近方蟹（Hemigrapsus takanoi）和短身大眼蟹（Macrophthalmusabbreviates）等。也与尚未报道有血卵涡鞭虫阳性检出的3种野生蟹的该病原的相应序列一致。鉴于高灵敏度和特异性，第一套引物和探针也可应用于血卵涡鞭虫新宿主的诊断及分析中。本发明引物及探针所述的80bp的序列为：
TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACACGCCTACCACTGAACTCCTCCATCCCACGTTTGCTTTCCATAAACACAACATCTCTA。
3、可定量检测和分析
每一套引物组和探针可对血卵涡鞭虫进行定量检测分析，第二套引物组在体系中添加核酸染料EvaGreen®Dye，可在进行等温扩增检测的同时，还可实现对样品的定量检测分析。上述的定量检测中，均具有良好的重复性，可在检测中提供可靠的检测结果。
4、操作简单，仪器设备要求低
第二套引物组在检测过程中仅需提供恒温条件即可完成，可在水浴锅或金属浴中进行检测，并能通过在反应产物中加入核酸荧光染料SYBR Green或GeneFinderTM或金属离子指示染料钙黄绿素等，进行检测结果的现场判断。
总之，本发明所提供的引物组和探针可对血卵涡鞭虫进行快速、灵敏、特异和定量的检测，其应用方法也具有很强的实用性，可适用于基层现场快速诊断，具有商业开发的应用前景。
附图说明
图1、血卵涡鞭虫ITS1重组质粒pMD-ITS1为模板的扩增曲线，1-10：含有ITS1基因为5.66×100-5.66×109拷贝的pMD18-ITS1质粒标准品；11：阴性对照。
图2、血卵涡鞭虫ITS1重组质粒pMD-ITS1为模板的标准曲线。
图3、卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法特异检测，1-29：表2中对应的核酸DNA；30：阴性对照；31-32：阳性对照。
图4、血卵涡鞭虫等温扩增反应温度及体系的优化，A：温度（℃）；B：Mg2+（mM）；C：dNTPs（mM）；D：Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶（U/uL）；E：甜菜碱（mM）；F：EvaGreen®Dye（μM）。
图5、血卵涡鞭虫等温扩增方法对样品的检测，泳道1-5：三疣梭子蟹血淋巴基因组DNA；N：阴性对照。
图6、血卵涡鞭虫等温扩增检测方法的现场应用，检测产物中加入GeneFinderTM核酸染料。管1-7：三疣梭子蟹血淋巴基因组DNA样品；管8：阴性对照。
图7、pMD18-ITS1质粒标准品为模板的血卵涡鞭虫等温扩增曲线，1-8：pMD18-ITS1质粒的拷贝数分别为8.89×108、8.89×107、8.89×106、8.89×105、8.89×104、8.89×103、8.89×102和8.89×101拷贝；9：8.89×100拷贝；10：阴性对照。
图8、pMD18-ITS1质粒标准品为模板的血卵涡鞭虫等温扩增标准曲线。
图9、本发明引物在血卵涡鞭虫等温扩增的特异性检测分析，1-13：表5中1-13的基因组DNA；14：阴性对照；15和16：阳性对照。
具体实施方式
为进一步说明本发明的方法和效果，以下结合实施例对本发明作进一步阐述。下列实施例中所用药品和材料等，除特殊说明，均为市购。
实施例1：血卵涡鞭虫pMD18-ITS1重组质粒标准品的构建
根据Hematodiniumsp（GenBank accession no. JQ692310.1）采用软件primer 5设计一对引物Hp_PS_F/Hp_PS_R，其中Hp_PS_F和Hp_PS_R分别位于18S rRNA和5.8S rRNA基因的核酸序列中。引物序列如下：
Hp_PS_F：5’-CCG TTC TTA GTT GGT GGA-3’
Hp_PS_R：5’-AAT TCG CAT TGC TTA TCG-3’
以血卵涡鞭虫阳性核酸为模板，通过HP-Ps-F/R引物进行PCR扩增获取包括ITS1核酸序列在内的目的片段937bp。PCR产物电泳后进行胶回收，将纯化的目的片段接入pMD18-T载体（TaKaRa,大连,中国），再转化到E.coliDH5α，将含有目标质粒的细菌培养液涂在含Amp的LB固体平板上，37℃过夜培养，用M13引物筛选阳性菌落，部分阳性菌株再送至上海生工生物技术有限公司进行测序验证。
对含有阳性重组质粒pMD18-ITS1的菌液37℃过夜培养后，用质粒小量提取试剂盒（天根，中国）提取pMD18-ITS1质粒，利用NanoDrop 2000c测定质粒浓度，计算目标基因的拷贝数。提取并纯化的pMD18-ITS1质粒DNA置于-20℃保存备用。
实施例2：血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的引物及探针
根据NCBI中39条血卵涡鞭虫ITS 1基因的序列，以及我们收集并测序所获得的41株血卵涡鞭虫样品ITS1基因序列，针对其保守序列采用AlleleID 7软件进行引物及探针的设计。探针5’修饰荧光报告基团6-FAM（6-carboxyfluorescein），3’修饰MGB（minor groovebinder）-NFQ（non-fluorescent quencher），所设计的引物组和探针如下：
引物1 ITS1F:5’-TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACA-3’
引物2 ITS1R:5’-TAGAGATGTTGTGTTTATGGAAAGCA-3’
探针 ITS1-Probe：5’ 6-FAM-CTACCACTGAACTCCT-MGB-NFQ 3’
ITS1F/ITS1R所对应的核苷酸80bp序列如下：
TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACACGCCTACCACTGAACTCCTCCATCCCACGTTTGCTTTCCATAAACACAACATCTCTA。
上述80bp核苷酸序列也与我们收集样品中41株血卵涡鞭虫的该相应序列完全一致，该结果表明该段序列具有高度保守，可用于血卵涡鞭虫的特异性检测。
上述的引物组和探针在检测中，探针5’也可以修饰如TET、JOE、VIC、NED、CY3、HEX等的其他荧光报告基团，3’也可以修饰如TAMRA、BHQ等的荧光淬灭基团。检测结果中，在阴性对照无污染的情况下，样品有扩增曲线时，视为样品血卵涡鞭虫检测阳性，可以根据模板量与CT值间的线性关系和检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
上述的引物ITS1F和ITS1R也可用于染料法荧光定量PCR，添加染料可以为SYBRGreen Ⅰ等核酸荧光染料。检测结果中，在阴性对照无污染的情况下，且产物的溶解曲线为单峰图时，视为样品血卵涡鞭虫检测阳性，可以根据模板量与CT值间的线性关系和检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
实施例3：血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的引物及探针浓度的优化
引物和探针浓度与定量PCR的扩增效果及检测成本密切相关。本发明的引物和探针终浓度按0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM进行评估，通过对检测CT值和荧光强度增加值（ΔRn）等进行检测效果的评估。按照荧光定量Premix Ex Taq™（Probe qPCR）试剂盒（TaKaRa，大连，中国）的说明书进行配制。最终确定引物的探针的终浓度分别为0.3μM和0.2μM。优化后所用的体系是Premix ExTaq（2×）10μL、10μM ITS1F/ITS1R各0.6μL、10μMTaqMan-MGB ITS1-probe 0.4μL、ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2μL、DNA模板1μL，ddH2O7.2μL。
实施例4：血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的标准曲线、检测灵敏度及重复性评估
以优化确定的本发明引物和探针浓度，以含有ITS1基因为5.66×100-5.66×109拷贝/反应的pMD18-ITS1质粒标准品为模板，进行灵敏度的检测，检测结果表明，该方法的检测灵敏度可以对目的基因达到5.66拷贝/反应（图1）。根据质粒核酸拷贝数的对数值（x）与其对应CT值（y）的相关性，可分析得到血卵涡鞭虫ITS1基因的Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的标准曲线：y=-3.2521x+40.265（R2=0.9996），扩增效率为103.385%（图2），CT值是指荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，RFU是relative fluorescence unit的缩写，指的是“相对荧光单位”是在采用荧光检测的分析中使用的测量单位。
本方法的检测灵敏度要优于已报道的血卵涡鞭虫其他定量检测方法的报道，包括13拷贝/反应（Ammar W Hanif;Whitney D Dyson;Holly A Bowers;Joseph S Pitula;Gretchen A Messick;Rosemary Jagus;Eric J Schott.Variation in spatial andtemporal incidence of the crustacean pathogenHematodinium pereziinenvironmental samples from Atlantic Coastal Bays[J].Aquatic biosystems.2013,Vol.9（No.1）：11.）和10拷贝/反应（A.R.Place;E.J.Schott;G. Messick;J.S.Pitula;L.Nagle;R.Jagus.Real-time PCR-based assay for quantitative detectionofHematodiniumsp.in the blue crabCallinectes sapidus.[J].Diseases of AquaticOrganisms.2009,Vol.84（No.1）：79-87）的报道。本发明检测灵敏度的提高可用于低感染水平的血卵涡鞭虫的早期诊断，这对该病原的预警和防控极为重要。
重复性检测评估表明，所检测目的基因在5.66×100-5.66×109拷贝/反应的范围时，本发明引物及探针在定量检测中的批内和批间的CV（%）值为0.11%-2.25%（表1），该结果表明基于本发明引物和探针的定量检测结果具有良好的重复性。
表1 血卵涡鞭虫基于ITS1重组质粒pMD-ITS1标准品的重复性检测评估
实施例5：血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的特异性评估
特异性检测结果表明，本发明的引物及探针在检测中特异性好，对检测中甲壳类及其相关细菌、病毒及寄生虫的核酸均无交叉反应（图3）。所用的蟹类核酸有三疣梭子蟹、短身大眼蟹、日本大眼蟹（M.japonicus）、豆形拳蟹（Pyrhila pisum）和红线黎明蟹（Matuta planipes）基因组DNA；甲壳类寄生病原DNA：Amesonspp、肌孢虫（A.portunus）和虾肝肠胞虫（EHP）；细菌的基因组DNA分别为：螺原体（Spiroplasma eriocheiris）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、坎氏弧菌（V.campbellii）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselaesubsp.damselae）、轮虫弧菌（V.rotiferianus）以及需钠弧菌（V.natriegens）；病毒的基因组DNA分别为白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）和十足类虹彩病毒1（decapod iridescent virus 1, DIV1）（表2）。
表2 血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR方法特异性检测
说明：“─”表示血卵涡鞭虫检测为阴性的野生蟹
实施例6：血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的临床样品检测
本发明对临床样品的血卵涡鞭虫进行了检测，样品为日照和烟台的蟹的血淋巴基因组DNA，定量分析的结果如表3所示。结果表明，可用于临床样品的检测，包括早期的诊断。
另外，我们在临床样品的检测中，还首次在尚没有血卵涡鞭虫阳性检测报道的3种野生蟹中检测到了低载量水平的血卵涡鞭虫，通过核酸测序等方法进一步确定了检测结果即为血卵涡鞭虫。3种野生蟹样品中的血卵涡鞭虫的相应80bp核苷酸序列也与本发明所述的80bp序列完全一致。该结果说明本发明的检测方法具有高特异性和高灵敏度，可用于血卵涡鞭虫新宿主的鉴定和低水平感染的准确诊断，这对该病原的流行病调查、预警及有效防控极为重要。
表3 血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法
实施例7：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的设计
根据血卵涡鞭虫的ITS 1基因保守区域，并分析我们收集并测序的血卵涡鞭虫样品ITS1基因序列分析结果，采用在线软件（http://primerexplorer.jp/e/），设计用于等温扩增检测血卵涡鞭虫的引物组，引物组包括有6条引物，分别计为引物1、2、3、4、5和6如下：
引物1 ITS1-F3: 5’-CACACACAAACATTCACCG-3’，
引物2 ITS1-B3: 5’-GATGGAGGAGTTCAGTGG-3’，
引物3 ITS1-FIP: 5’-CTGTAGTAACCAACACGCCGTTTTTGAACCTTAGCCATTAGCT-3’，
引物4 ITS1-BIP: 5’-GCTTGAACTACACACACTAGTACCTTTTCTACCACCGTACCCTCAC-3’，
引物5 ITS1-LF: 5’-CAGTAGCTAGCTAGTAGTCGTCG-3’，
引物6 ITS1-LB: 5’-TGTCTCTTGCTGGTAGGAGAA-3’。
实施例8：血卵涡鞭虫的等温扩增反应条件和反应体系的优化
等温扩增反应体系的优化对检测效果十分重要，也与检测成本密切相关。以血卵涡鞭虫阳性组织样品的基因组DNA为模板，25μL环介导等温扩增反应（LAMP）的初始反应体系中包含2.5μL 10 × Isothermal amplification buffer、100mM MgSO4 1.5μL、5.0MBetaine 6μL、10mM dNTPs 3.5μL、20μM ITS-FIP/BIP 2μL、10μM ITS-F3/B3 0.5μL、20μMITS-LF/LB 1μL、8000U/mLBst2.0 WarmStart®DNA聚合酶（NewEnglandBioLabs，美国） 1μL、20×EvaGreen®Dye（Biotium）1μL，并补充水至25μL。
实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad,California,美国）中设置8个温度梯度，分别为60.0℃、60.6℃、61.6℃、63.2℃、65.1℃、66.7℃、67.6℃和68.0℃，反应60min（60个循环，每个循环1min）。依据CT值分析，该温度范围中较适的扩增反应温度范围为65.1-68.0℃，其中又以反应温度为66.7℃时的扩增反应效果较好（图4中A）。
等温扩增反应温度为66.7℃，依次对对反应体系中Mg2+、dNTPs、Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶、Betaine和核酸染料EvaGreen®Dye的使用量进行优化。Mg2+终浓度（包括1×Isothermal amplification buffer中2.0mM Mg2+）按照4.0、6.0、8.0、10.0、12.0mM进行反应体系优化，dNTPs浓度按照0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mM进行反应体系优化；Bst2.0WarmStart®DNA聚合酶按0.128、0.192、0.256、0.32、0.384、0.448、0.512、0.576U/uL的酶量进行优化；Betaine浓度按照0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mM进行添加；核酸染料EvaGreen®Dye浓度按照0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5μM的添加量进行优化。反应体系置于荧光定量PCR仪中进行等温扩增检测，反应程序为：66.7℃，反应60min（60个循环，每个循环1min）。各优化组分设置3个平行重复，依据扩增中CT值较小来选出较适反应条件。确定当反应体系中Mg2+的终浓度为6.0mM（图4中B），dNTPs的浓度为1.2mM（图4中C），Bst2.0WarmStart®DNA聚合酶的用量为0.512U/uL（图4中D），Betaine的用量为0.0mM（图4中E）。EvaGreen®Dye的用量为0.75μM时具有较小的CT值（图4中F）。
上述的等温扩增反应中可以为引物1-6，也可以为引物1-4。
上述的反应在检测结果可通过扩增曲线进行分析（见实施例9），在阴性对照无污染的情况下，有扩增曲线视为样品血卵涡鞭虫检测阳性，无扩增曲线视为血卵涡鞭虫检测阴性。也可以根据模板量与CT值间的标准曲线及检测样品的CT值进行样品中血卵涡鞭虫的定量分析。
如图5，上述的反应的检测结果也可通过电泳条带来进行检测结果的判断，在阴性对照污染的情况下，电泳产物为阶梯状的条带视为样品血卵涡鞭虫检测阳性，反之视为样品血卵涡鞭虫检测阴性。
如图6，上述的反应扩增反应的产物中按2%体积比添加核酸染料GeneFinderTM，阴性对照和阴性样品应为加入该染料后的橙黄色，产物管中由橙黄色变为荧光绿色视为样品血卵涡鞭虫检测阳性。
实施例9：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的检测灵敏度
以实施例8优化的反应温度和体系，以8.89×100-8.89×108拷贝/反应的pMD18-ITS1质粒标准品为模板，进行灵敏度的检测，各模板设置3个平行。检测结果表明，该方法的检测灵敏度为8.89×101拷贝/反应（图7），根据质粒核酸拷贝数的对数值（x）与其对应CT值（y）的相关性，可分析得到血卵涡鞭虫ITS1基因的Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的标准曲线：y=-1.511x+19.582，R2=0.9969（图8）。
实施例10：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的检测结果重复性评估
以8.89×101-8.89×108拷贝/反应的pMD18-ITS1质粒标准品为模板，对ITS-LAMP检测方法的可重复性进行评估。结果显示，在起始模板浓度为8.89×101-8.89×108拷贝/反应的范围内，ITS-LAMP检测方法批内和批间检测的变异系数CV分别小于2.08%和1.35%（表4），该说明本发明引物在等温扩增中在8.89×101-8.89×108拷贝/反应范围内检测结果的重要性良好。
表4 血卵涡鞭虫LAMP检测重复性检测评估
实施例11：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的特异性检测
采用本发明第二套引物组的引物1-6，以实施例8优化的反应温度和体系，进行引物在等温扩增中的特异性检测。检测中所用病原有，甲壳类寄生病原的基因组DNA：虾肝肠胞虫（EHP）和肌孢虫（A.portunus）；细菌的基因组DNA分别为：螺原体（S.eriocheiris）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、坎氏弧菌（V.campbellii）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（P.damselaesubsp.damselae）、轮虫弧菌（V. rotiferianus）以及需钠弧菌（V.natriegens）；病毒的基因组DNA分别为白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）、十足类虹彩病毒1（decapod iridescentvirus 1, DIV1）和传染性皮下和造血组织坏死病毒（infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus ，IHHNV）（表5）。
表5 血卵涡鞭虫等温扩增特异性检测中所用的病原
血卵涡鞭虫等温扩增特异性检测结果表明，本发明引物与血卵涡鞭虫外的其他病原均无交叉反应（图9），其检测结果具有可靠的特异性。
实施例12：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的临床样品检测
本发明对临床样品的血卵涡鞭虫进行了检测，样品为潍坊下营的三疣梭子蟹的肝胰腺基因组DNA，定量分析的结果如表6所示。结果表明，可用于临床样品的检测及定量分析。
采用本发明的等温扩增的引物，在临床样品检测中对实施6中提及的没有血卵涡鞭虫阳性检测报道的3种野生蟹的样品检测也呈阳性。该结果也说明基于本发明引物组的等温扩增也可用于低感染水平的血卵涡鞭虫新宿主的鉴定中。
表6 血卵涡鞭虫Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法
实施例13：血卵涡鞭虫的等温扩增引物的现场检测应用方式
本发明的引物组和探针用于非疾病的诊断和治疗目的中的血卵涡鞭虫的检测及定量分析，还可以应用于但不限于以下情况的检测中：
制作检测试剂或试剂盒产品，用于开展血卵涡鞭虫及其成分存在状况的分析、检疫和流行病学监测，用于进行环境、水体、饲料、工具的检测，用于对非患病动物受精卵、苗种、幼体、成体、亲本中可能存在的血卵涡鞭虫进行检测，用于在饲料销售、药品销售、苗种销售等非疾病诊断目的的服务中附带进行样品检测。

Claims (10)

1.一种血卵涡鞭虫的检测引物组和探针，其特征在于：其核苷酸序列如下：
第一套引物组和探针组成及核苷酸序列：
ITS1F：5’-TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACA-3’，
ITS1R：5’-TAGAGATGTTGTGTTTATGGAAAGCA-3’，
ITS1-Probe：5’ -CTACCACTGAACTCCT- 3’，探针5’端和3’端分别修饰荧光报告基团和荧光淬灭基团；
第二套引物组组成及核苷酸序列：
ITS1-F3：5’-CACACACAAACATTCACCG-3’，
ITS1-B3：5’-GATGGAGGAGTTCAGTGG-3’，
ITS1-FIP：5’-CTGTAGTAACCAACACGCCGTTTTTGAACCTTAGCCATTAGCT-3’，
ITS1-BIP：5’-GCTTGAACTACACACACTAGTACCTTTTCTACCACCGTACCCTCAC-3’，
ITS1-LF：5’-CAGTAGCTAGCTAGTAGTCGTCG-3’，
ITS1-LB：5’-TGTCTCTTGCTGGTAGGAGAA-3’；
所述血卵涡鞭虫为血卵涡鞭虫典型种Hematodinium perezi。
2. 如权利要求1所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针，其特征在于：所述第一套引物组和探针是根据血卵涡鞭虫ITS1基因高度保守核苷酸序列设计得到，所述高度保守核苷酸序列为： TGTGAGGGTACGGTGGTAGTACACGCCTACCACTGAACTCCTCCATCCCACGTTTGCTTTCCATAAACACAACATCTCTA。
3.一种权利要求1所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：用于非疾病的诊断和治疗目的的血卵涡鞭虫的检测。
4.如权利要求3所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：使用所述第一套引物组和探针进行定量检测时，使用引物为ITS1F、ITS1R和探针ITS1-Probe或使用引物为ITS1F、ITS1R。
5.如权利要求4所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：所述探针ITS1-Probe为Taqman-MGB探针，探针5’端修饰荧光报告基团6-FAM，3’端修饰MGB-NFQ。
6.如权利要求4所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：使用所述第一套引物组和探针的检测方法为荧光定量PCR时，ITS1F、ITS1R和ITS1-Probe的终浓度均为0.1-0.5μM。
7.如权利要求3所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：使用所述第二套引物组的检测方法为等温扩增或荧光定量PCR时，使用引物为ITS1-F3、ITS1-B3、ITS1-FIP、ITS1-BIP或ITS1-F3、ITS1-B3、ITS1-FIP、ITS1-BIP、ITS1-LF、ITS1-LB。
8.如权利要求7所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：反应温度为60.0℃-68.0℃，反应体系中MgSO4的浓度为4.0-12.0mM，dNTPs的浓度为0.8-1.8mM，Bst2.0 WarmStart®DNA聚合酶的浓度为0.128-0.576 U/μL，甜菜碱的浓度为0.0-1.4 mM。
9.如权利要求8所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：反应体系还包括终浓度为0.5-2.5μM的EvaGreen® Dye。
10.如权利要求3所述的血卵涡鞭虫的检测引物组和探针的应用，其特征在于：包括用于制备检测试剂或试剂盒产品。
CN202410137099.3A 2024-02-01 2024-02-01 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用 Active CN117683910B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410137099.3A CN117683910B (zh) 2024-02-01 2024-02-01 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410137099.3A CN117683910B (zh) 2024-02-01 2024-02-01 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117683910A CN117683910A (zh) 2024-03-12
CN117683910B true CN117683910B (zh) 2024-04-30

Family

ID=90126824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410137099.3A Active CN117683910B (zh) 2024-02-01 2024-02-01 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117683910B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101067154A (zh) * 2007-03-16 2007-11-07 浙江省海洋水产研究所 海产甲壳类寄生血卵涡鞭虫的pcr检测方法
CN101576559A (zh) * 2008-12-25 2009-11-11 浙江省海洋水产研究所 一种血卵涡鞭虫兔抗血清及其应用
CN115820813A (zh) * 2022-12-08 2023-03-21 中国科学院海洋研究所 利用card-fish检测海洋寄生甲藻-血卵涡鞭虫孢子的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101067154A (zh) * 2007-03-16 2007-11-07 浙江省海洋水产研究所 海产甲壳类寄生血卵涡鞭虫的pcr检测方法
CN101576559A (zh) * 2008-12-25 2009-11-11 浙江省海洋水产研究所 一种血卵涡鞭虫兔抗血清及其应用
CN115820813A (zh) * 2022-12-08 2023-03-21 中国科学院海洋研究所 利用card-fish检测海洋寄生甲藻-血卵涡鞭虫孢子的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Caiwen Li等."Detection and quantification of the free-living stage of the parasitic dinoflagellate Hematodinium sp. in laboratory and environmental samples".《Harmful Algae》.2010,第9卷第516段第2.3节. *
Katrina M. Pagenkopp Lohan等."The Role of Alternate Hosts in the Ecology and Life History of Hematodinium sp., a Parasitic Dinoflagellate of the Blue Crab (Callinectes sapidus)".《J. Parasitol》.2012,第98卷(第1期),第75页左栏第3段. *
施慧等."三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立".《上海水产大学学报》.2008,第17卷(第1期),第29页第1.3节. *
施慧等."环介导恒温扩增技术检测血卵涡鞭虫".《中国水产科学》.2010,第17卷(第5期),第1029段第1.4节和表1，第1030页第1.5节. *
李自刚等.《生物检测技术》.中国轻工业出版社,2016,(第2版),第266页. *
谭贵良等.《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》.中山大学出版社,2014,(第1版),第141页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117683910A (zh) 2024-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lo et al. Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot syndrome virus
CN110551846A (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN111020062A (zh) 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN111808989A (zh) 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法
CN110616272B (zh) 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
CN113652505B (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN113046489B (zh) 用于检测猪星状病毒的多重rt-pcr引物组、试剂盒及其应用
CN114645101B (zh) 一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒
CN112921122A (zh) 猫常见病毒多重pcr快速检测试剂盒及其引物组
CN115044710A (zh) 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用
WO2023279042A2 (en) Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants
KR102516022B1 (ko) 아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법
CN117551812A (zh) 用于检测PaBV 2型、4型和5型的组合物及其试剂盒与应用
WO2023121337A1 (ko) 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법
CN117683910B (zh) 血卵涡鞭虫的检测引物组和探针及其应用
CN112280899A (zh) 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN113801966B (zh) 一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量pcr方法及试剂盒
KR102435209B1 (ko) 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
EP1013775A1 (en) Quantitative polymerase chain reaction using a fluorogenic real-time detection system
CN111500774B (zh) 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒
CN110878380B (zh) 一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法
Mackie et al. Experimental parameters affecting quantitative PCR of Artemia franciscana: a model for a marine zooplanktonic target in natural plankton samples
CN1944665B (zh) 用于检测迟缓爱德华氏菌的引物序列及检测试剂盒
CN117987598B (zh) 检测戊型肝炎病毒的引物对、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant