CN115044710A

CN115044710A - 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN115044710A
Application number: CN202210651053.4A
Authority: CN
Inventors: 翟俊琼; 陈武; 单芬; 沈永义; 周妞; 李婉萍
Original assignee: Guang Zhoudongwuyuan
Current assignee: Guang Zhoudongwuyuan
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN115044710B

Abstract

本发明提供一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用，涉及动物病毒检测技术领域。本发明的检测穿山甲β冠状病毒的引物组包括外引物和内引物，各引物的序列如SEQID No.1～SEQ ID No.4下所示。本发明的环介导等温扩增试剂、试剂盒包括上述引物组。本发明的检测方法采用上述引物组、环介导等温扩增试剂或试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增。本发明的产品和检测方法具有特异性高、灵敏度高、重复性好等优点。

Description

一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及动物病毒检测技术领域，特别是涉及一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用。

背景技术

冠状病毒是一种具有囊膜的单股正链非节段的RNA病毒。根据国际病毒分类委员会当前的命名法则，冠状病毒科分为4个属，即Alpha、Beta、Gamma和Delta冠状病毒属，其中Alpha，Beta，Gamma冠状病毒属分别分别对应于以前的1、2和3群。同时，Beta冠状病毒属在进化上又可进一步分为A、B、C和D四个不同的群(或谱系)。

穿山甲是穴居动物，免疫系统较特殊，易感染多种病原微生物，其所居住或觅食的洞穴不仅有穿山甲活动，也可能有蝙蝠、豪猪、黄腹鼬、果子狸、竹鼠、蛇等动物的活动，因此穿山甲有可能感染或传播多种病原微生物，从而成为疫病的中间宿主，甚至是某些具有重大公共卫生风险的病原微生物携带者。现有的研究表明，穿山甲可以感染BETA冠状病毒，且谱系复杂，不仅有B谱系，还有A谱系。其中B谱系与人SARS-Cov-2具有一定的相关性，对于研究SARS-Cov-2的溯源、进化、变异与跨物种传播等研究具有极其重要的价值。而通过对穿山甲冠状病毒的报道分析，推断穿山甲的携带的BETA冠状病毒种类更多，传播地区比目前所检测到地区更广，因此需要更快速、更简便的方法进行更多地区和更多穿山甲及相关物种的检测。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等人发展起来的技术。LAMP具有较高的特异性和灵敏度，操作简单，不需要专门的设备。LAMP是用具有链置换活性的BstDNA聚合酶(即来自嗜热脂肪芽胞杆菌的修饰DNA聚合酶)进行的。温度从61℃到69℃，在等温条件下在30-60min内完成检测。最终的扩增产物是带有不同茎的茎环DNA的混合物，可以通过直接观察或通过琼脂糖凝胶进行分析。LAMP方法已被开发用于检测多种病毒，包括口蹄疫病毒、登革热病毒、风疹病毒和西尼罗河病毒，但尚未应用于检测穿山甲源BETA冠状病毒(Pan-β-Cov)。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

本发明提供的检测穿山甲β冠状病毒的引物组，包括外引物和内引物，各引物的序列如下：

上游外引物F3：

5’-CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT-3’(SEQ ID No.1)

下游外引物B3：

5’-AGGTACCTTCTAAATCTGTGC-3’(SEQ ID No.2)

上游内引物FIP：

5’-ACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT-3’(SEQ ID No.3)

下游内引物BIP：

5’-AGACTATGACTGTGTCTCTTTTTGCCCGCATGTACTCCTGTTG-3’(SEQ ID No.4)。

上述引物组是针对Pan-β-Cov基因组相对保守的靶基因(ORF-1ab)序列设计，Pan-β-Cov病毒已公布的基因组序列中ORF1ab基因序列较长且保守性较好，利用该序列设计的引物，用于检测穿山甲β冠状病毒具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

在其中一个实施例中，所述引物组还包括环引物，所述环引物的序列如下：

环引物LB：5’-TACATGCATCACATGGAACTTC-3’(SEQ ID No.5)。

在其中一个实施例中，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为(3～5)：1：(1～3)。

在其中一个实施例中，所述外引物、内引物与环引物的摩尔比为4：1：2。

本发明还提供一种检测穿山甲β冠状病毒的环介导等温扩增试剂，包括本发明所述的引物组。

本发明还提供一种检测穿山甲β冠状病毒的试剂盒，包括本发明所述的引物组或环介导等温扩增试剂。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括荧光目视检测试剂、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、水、阳性标准品。

在其中一个实施例中，所述DNA聚合酶为BstⅡDNA聚合酶。

本发明还提供一种穿山甲β冠状病毒的检测方法，采用本发明所述的引物组，或本发明所述的环介导等温扩增试剂，或本发明所述的试剂盒，对待测样品进行环介导等温扩增。

上述检测方法，操作简便、无需复杂昂贵仪器，检测快速高效；从提取样品到结果判定可在60min内完成，时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当；反应结果判定方法简单，不仅可以通过琼脂糖凝胶核酸电泳判断结果，还可以通过荧光染料在紫外光照射下肉眼判断结果。

本发明的检测方法可以实现Pan-β-Cov的快速、即时检测，从而解决Pan-β-Cov检测耗时、费力、高成本的问题，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期。

在其中一个实施例中，所述环介导等温扩增的反应体系包括：10×反应缓冲液2.5μL，40μM FIP、40μM BIP、10μM F3、10μM B3、20μM LB各1μL，8000U/mL BstⅡDNA聚合酶1μL，HNB 21μL，100mM MgSO₄ 2.5μL，10mM dNTP 3.5μL，10mM甜菜碱(betaine)2μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用水补足至25μL

荧光目视试剂(HNB)在反应前加入，污染小，Mg²⁺与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg²⁺与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg²⁺使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判断LAMP反应结果。实时肉眼监测，不需要开盖，不需要电泳，非常方便。

在其中一个实施例中，所述环介导等温扩增的反应条件为：在61～69℃下恒温水浴55～65min，再置于75～85℃下使酶失活。

在其中一个实施例中，所述环介导等温扩增的反应条件为：再65℃下恒温水浴60min，再置于80℃下5min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的引物组、环介导等温扩增试剂和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本发明的检测方法可实现Pan-β-Cov的快速、即时检测，从而解决Pan-β-Cov检测耗时、费力、高成本的问题，使检测灵敏度和特异性得到提高，降低人工和器材成本，缩短检测周期。实验结果表明，采用本发明的产品和方法灵敏度高，对Pan-β-Cov的检测下限低至7.98×10⁰copy/μL；特异性强，对猪流行性腹泻病毒、犬冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、鸟GAMMA冠状病毒的检测均未发现阳性结果。本发明的产品和检测方法可推广应用于Pan-β-Cov的流行病学调查和疫情监控中，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例中检测Pan-β-Cov的LAMP方法的琼脂糖电泳图。

其中，M为DL2000(DNA分子量标准2000)，1为阳性对照，NC为阴性对照。

图2为实施例中不同反应温度下的凝胶电泳图。

其中，M为DL2000，1为61℃，2为63℃，3为65℃，4为67℃，5为69℃，NC为阴性对照。

图3为LAMP方法检测Pan-β-Cov的灵敏度试验结果。

其中，M为DL2000，1为3×10⁸copy/μL，2为3×10⁷copy/μL，3为3×10⁶copy/μL，4为3×10⁵copy/μL，5为3×10⁴copy/μL，6为3×10³copy/μL，7为3×10²copy/μL，8为3×10¹copy/μL，9为3×10⁰copy/μL NC为阴性对照。

图4为LAMP方法检测an-β-Cov的特异性试验结果。

其中，1为猪流行性腹泻病毒核酸，2为犬冠状病毒核酸，3为猫传染性腹膜炎病毒核酸，4为鸟GAMMA冠状病毒核酸，5为穿山甲β冠状病毒核酸，6为阴性对照。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例和对比例中，除非特殊说明，试剂、材料、设备为市售购得，实验方法为本领域的常规实验方法。

实施例1

引物设计及LAMP方法的建立

1.Pan-β-Cov阳性标准品的制备

从Genbank数据库中检索获得所有穿山甲BETA冠状病毒(Pan-β-Cov)的全基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到Pan-β-Cov基因组相对保守的靶基因(ORF-1ab)序列，根据所得靶基因序列，通过生物公司进行合成目的片段，同时连接载体，构建阳性标准品。

2.LAMP引物组合物的设计和合成

利用PrimerExplorerV4软件针对靶基因序列设计出LAMP引物组合物，并进行引物合成。对所合成的引物进行筛选，即将合成的引物稀释后进行引物筛选，通过常规PCR扩增。经筛选后最终得到了一套可特异、灵敏的检测Pan-β-Cov的引物组合物。

所述引物组合物由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LB组成，所述的引物序列如下所示：

F3：CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT(SEQ ID No.1)

B3：AGGTACCTTCTAAATCTGTGC(SEQ ID No.2)

FIP：TACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT(SEQ ID No.3)

BIP：AGACTATGACTGTGTCTCTTTTTGCCCGCATGTACTCCTGTTG(SEQ ID No.4)

LB：TACATGCATCACATGGAACTTC(SEQ ID No.5)

3.LAMP方法的建立和优化

(1)待检样品核酸抽提：按照TIANGEN公司的Magnetic Viral DNA/RNAKit核酸提取试剂盒的说明书抽提穿山甲血液样品的RNA，反转录之后进行LAMP方法的检测。

(2)进行LAMP反应

LAMP反应体系包含10×反应缓冲液2.5μL，40μM FIP、40μM BIP、10μM F3、10μMB3、20μM LB各1μL，BstⅡDNA Polymerase(8000U/mL)1μL，HNB 21μL，100mM MgSO₄ 2.5μL，10mM dNTP 3.5μL，10mM betaine 2μL，1.0μL靶cDNA和5.5μL无核酸酶超纯水。

将混合物分别在61℃、63℃、65℃、67℃和69℃下孵育60min，以确定最佳反应温度。反应在80℃热失活5min后终止反应。用无菌水代替模板cDNA作为阴性对照。

结果验证：LAMP产物(10μL)经2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色紫外可见结果。

结果判定：如图1所示，LAMP扩增Pan-β-Cov琼脂糖凝胶电泳的DNA产物显示出特征的梯形条带，具有多条带的片段，表明最终的LAMP产物是不同茎长的茎环DNA的混合物(图1)。相反，阴性对照缺乏这种特有的多带阶梯模式。而且，反应体系从初始的紫色变化为反应后的蓝色。

LAMP检测Pan-β-Cov的佳反应温度和时间优化：对Pan-β-Cov-LAMP检测的最佳反应温度和时间进行了研究。图2显示，在该反应体系中，61℃即有目的基因被扩增，在63℃～67℃时扩增出的条带清晰易观察，65℃条件下条带最清晰，可确定本次检测的最佳反应温度设定为65℃，同时显示过高的温度会抑制酶的活性。由于在65℃下的LAMP反应产生了比在其他温度下更强的带强度(图2)，LAMP检测Pan-β-Cov的最佳反应条件为65℃反应60minLAMP试验的特异性检测。

实验例1

LAMP法检测Pan-β-Cov的灵敏度试验。

采用实施例1所述的方法进行检测，将实施例1制备得到的Pan-β-Cov阳性标准品做10倍梯度稀释后作为模板进行结合LAMP检测，共9个梯度(3×10⁸-3×10⁰copy/μL)，以确定最低检出限度。

结果：Pan-β-Cov阳性质粒的10倍系列稀释度(从10⁸到10⁰copy/μL)用于测定灵敏度，阳性反应混合物呈现典型的梯形图案。在三次重复中，100％检测到含有300copy/μLLAMP阳质粒的样品(图3)。

实验例2

LAMP法检测Pan-β-Cov的特异性试验。

本实验所用的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的核酸、犬冠状病毒(CCov)的核酸、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)核酸、鸟GAMMA冠状病毒(BGCov)核酸由广州动物园野生动物微生物实验室所鉴定和保存。

采用实施例1所述的方法进行特异性检测，待测样本包括猪流行性腹泻病毒的核酸、犬冠状病毒的核酸、猫传染性腹膜炎病毒核酸、鸟GAMMA冠状病毒核酸，Pan-β-Cov阳性标准品和阴性对照，检测结果如图4。

LAMP特异性分析结果表明：在含有PEDV、CCov、FIPV、BGCov、cDNA模板的反应混合物中没有观察到扩增产物，表明本发明建立的LAMP对Pan-β-Cov具有高度的特异性(图4)。

实验例3

针对采自罚没36份穿山甲抗凝血液样品，按照商品化试剂盒进行提取核酸和反转录，根据Pan-β-Cov的ORF-1ab设计q-PCR上游引物Pan-β-Cov-F(5'-TCAGGTGTTTACCAGTGTGCT-3')(SEQ ID No.6)和下游引物Pan-β-Cov-R(5'-ATCTGTGCCCGCATGTACTC-3')(SEQ IDNo.7)，进行q-PCR方法的检测与实施例1的LAMP方法进行比较。结果实施例1的LAMP方法检测有5份为阳性，阳性率为13.89％，后经病毒分离培养鉴定证实这5份样品均为阳性样品。而q-PCR方法检测有3份阳性样品，阳性率为8.33％，从而证实了实施例1的LAMP检测方法具有更高的灵敏度和准确性。

对比例1

一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组，包括外引物F3/B3和内引物FIP/BIP，引物序列如下所示：

CoV-F3-1：

GTTACTTGTGGAACAACTACA(SEQ ID No.8)

CoV-B3-1：

GTCAACTTTCAACTTAAGAACAC(SEQ ID No.9)

CoV-FIP-1：

TTCAGCTGTGCAGATCACATGTCTTAATGGTCTTTGGCTTGATG(SEQ ID No.10)

CoV-BIP-1：

CCATAATTTTCTGGTACAAGCTGGTAATTTTGCATAGAATGTCCGATA(SEQ ID No.11)

经检测该引物组扩增效果不佳，特异性、灵敏度均不及实施例1中的引物组。

以上实施例和实验例的结果表明，用于采用本发明的Pan-β-Cov检测的引物组及试剂盒，结合LAMP技术，可快速、准确地检测出Pan-β-Cov，弥补了现有的Pan-β-Cov检测技术存在的费时、费力的缺陷，降低检测成本和劳动强度，提高检测灵敏性和特异性，缩短检测周期。本发明在科学研究和生产实践中具有快速、简易的操作特点，适用于现场的即时检测。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州动物园

<120> 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagacttttt cagtattagc ttgtt 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtaccttc taaatctgtg c 21

<210> 3

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaagaacca ttaaggaatg atcctccatc aggtgtttac cagt 44

<210> 4

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agactatgac tgtgtctctt tttgcccgca tgtactcctg ttg 43

<210> 5

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacatgcatc acatggaact tc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaggtgttt accagtgtgc t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctgtgccc gcatgtactc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttacttgtg gaacaactac a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcaactttc aacttaagaa cac 23

<210> 10

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcagctgtg cagatcacat gtcttaatgg tctttggctt gatg 44

<210> 11

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccataatttt ctggtacaag ctggtaattt tgcatagaat gtccgata 48

Claims

1.一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组，其特征在于，包括外引物和内引物，各引物的序列如下：

上游外引物F3：

5’-CAGACTTTTTCAGTATTAGCTTGTT-3’(SEQ ID No.1)

下游外引物B3：

5’-AGGTACCTTCTAAATCTGTGC-3’(SEQ ID No.2)

上游内引物FIP：

5’-ACAAGAACCATTAAGGAATGATCCTCCATCAGGTGTTTACCAGT-3’(SEQ ID No.3)

下游内引物BIP：

5’-AGACTATGACTGTGTCTCTTTTTGCCCGCATGTACTCCTGTTG-3’(SEQ ID No.4)。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括环引物，所述环引物的序列如下：

环引物LB：5’-TACATGCATCACATGGAACTTC-3’(SEQ ID No.5)。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为(3～5)：1：(1～3)。

4.一种检测穿山甲β冠状病毒的环介导等温扩增试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物组。

5.一种检测穿山甲β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物组或权利要求4所述的环介导等温扩增试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光目视检测试剂、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、水、阳性标准品。

7.一种穿山甲β冠状病毒的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的引物组，或权利要求4所述的环介导等温扩增试剂，或权利要求5～6任一项所述的试剂盒，对待测样品进行环介导等温扩增。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应体系为：10×反应缓冲液2.5μL，40μM FIP、40μM BIP、10μM F3、10μM B3、20μM LB各1μL，8000U/mLBstⅡDNA聚合酶1μL，HNB 21μL，100mM MgSO₄ 2.5μL，10mM dNTP 3.5μL，10mM甜菜碱2μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用水补足至25μL。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应条件为：在61～69℃下恒温水浴55～65min，再置于75～85℃下使酶失活。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应条件为：再65℃下恒温水浴60min，再置于80℃下5min。