CN115181803A

CN115181803A - 检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用

Info

Publication number: CN115181803A
Application number: CN202110373822.4A
Authority: CN
Inventors: 张其中; 郭书权; 付耀武
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-10-14

Abstract

本发明公开一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用，属于寄生虫检测领域。本发明根据多子小瓜虫的靶标分子组织蛋白酶L基因序列，设计一对特异引物和一条探针。该引物和探针对多子小瓜虫亲缘关系较近的四膜虫、草履虫以及养殖水体水样和底泥均无扩增，特异性强；检测灵敏度高，检测下限为5.4拷贝/μL，约为1只多子小瓜虫，重复性好(该技术的变异系数低于5％)；方法检测方便，省去了常规PCR方法中的电泳步骤以及杜绝了传统PCR的气溶胶污染，大大节约时间和提高检测准确性；可应用于水体环境中和鱼体上的多子小瓜虫检测，为预防多子小瓜虫病，提供技术支持。

Description

检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用

技术领域

本发明属于寄生虫检测领域，具体涉及一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用。

背景技术

多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是世界上淡水和咸淡水鱼类的重要寄生纤毛虫，主要寄生于鱼类的鳃和皮肤，形成白点，又称白点病，该病危害大，病鱼死亡率高，造成严重经济损失。因此，防治小瓜虫病是水产养殖中的重要工作，而及时发现水体中存在多子小瓜虫是防治小瓜虫病的关键，这就需要检测水体中多子小瓜虫的检测技术。目前，国内外检测多子小瓜虫的方法主要是显微镜检查、常规PCR、荧光定量PCR，但是，这些现有检测方法要么应用范围受限，要么检测灵敏低，无法满足需求。Taqman探针荧光定量PCR技术特异性强、灵敏度高，更适合用于定量检测。因此，寻找新的靶标分子建立一种重现性好、特异性强、灵敏度高的Taqman探针荧光定量PCR方法，检测水体环境中和鱼体上的多子小瓜虫就十分必要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种组织蛋白酶L基因在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组。

本发明的另一目的在于提供一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述引物组或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种定量检测样品中多子小瓜虫的方法。

本发明提供一种Taqman探针荧光定量PCR检测多子小瓜虫的试剂盒及检测方法，特别提供一对针对多子小瓜虫的特异性引物Cathepsin F和Cathepsin R以及一条特异性探针Cathepsin-Probe，使用该试剂盒和检测方法可快速检测水环境和鱼体上的多子小瓜虫。

本发明以组织蛋白酶L(Cathepsin L，CTSL)基因为新靶标分子建立了特异灵敏的Taqman探针实时荧光定量PCR技术，并组配了该技术配套使用的试剂盒。组织蛋白酶L基因在不同物种间的相似度低，与多子小瓜虫相似度最高的嗜热四膜虫在51％的覆盖率下也只有65.07％的相似度，但多子小瓜虫之间的组织蛋白酶L基因相似度高达99.64％，这说明该基因具有种间变异大，种内保守的特点，适合用作检测靶标。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

组织蛋白酶L基因作为分子靶点在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用。

优选的，所述的组织蛋白酶L基因的GenBank：XM_004039979.1。

所述的组织蛋白酶L的GenBank：XP_004040027.1。

一种用于检测多子小瓜虫的试剂，包含能够检测多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因的引物；

具体的，以Taqman探针荧光定量PCR法为基础，针对多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因，设计一对特异引物和Taqman探针，序列如下：

Cathepsin F：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；

Cathepsin R：5’-CTCCTTTAATTCTTTATAAGTTTTC-3’；

Cathepsin-Probe：5’-FAM-TTTCTCACCATAAAGCTCCTACACATG-BHQ-3’；

其中，Cathepsin-Probe的5’端采用荧光基团FAM标记，3’端为淬灭基团BHQ标记，扩增得到的多子小瓜虫组织蛋白酶L基因长度为192bp。

上述用于检测多子小瓜虫的试剂在检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂盒中的应用。

一种用于检测多子小瓜虫的试剂盒，含有上述用于检测多子小瓜虫的试剂。

所述的试剂盒还包括qPCR反应试剂。

所述引物浓度为10μmol/L，探针浓度为10μmol/L。

反应试剂：10×PCR缓冲液(不含MgCl₂)、氯化镁(MgCl₂)、四种脱氧核苷酸的混合物(dNTPs)、Taq酶(5个单位/μL)。

一种定量检测多子小瓜虫的方法，包括如下步骤：所述方法为非疾病诊断方法；

(1)提取待测样品DNA；

(2)PCR扩增组织蛋白酶L基因，构建重组质粒，以其为模板建立qPCR反应体系以及用不同拷贝数(Sq)的重组质粒的对数值及其Ct值的关系绘制标准曲线；其中，拷贝数Sq与Ct值的关系为Ct＝-3.164×lg(Sq)+36.848，相关系数R²＝0.993；

(3)利用建立好的检测方法，加入上述用于检测多子小瓜虫的试剂和待测样品DNA，配成qPCR反应体系，进行qPCR反应，得到待测样品的Ct值；

(4)多子小瓜虫定量检测

qPCR完成后，根据Ct值判断：若无扩增，则判断该样品中无多子小瓜虫；若有扩增，则根据建立好的标准曲线计算相应的组织蛋白酶L基因拷贝数，阴性对照的Ct值应无扩增。

其中，每只多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因拷贝数约为7个拷贝数。

优选的，步骤(1)中，待测样品为水体、底泥或鱼体组织；

优选的，步骤(2)、(3)中，qPCR反应体系，为：10×PCR缓冲液2.5μL，氯化镁(25mmol·mL^-1)3.2μL，四种脱氧核苷酸的混合物(2.5mM)2μL，上下游引物(10μM)各1μL，特异性探针(10μM)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL；模板DNA 1μL，灭菌双蒸水12.55μL；反应体系总体积为24μL。

qPCR反应条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性15s，58℃退火30s；72℃延伸20s，如此40个循环。每次都在58℃退火结束时收集荧光信号；阴性对照的Ct值应不显示。

优选的，步骤(3)中，以不同拷贝数(Sq)的重组质粒是拷贝数为5.4×10⁰～5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒；具体为5.4×10⁰、5.4×10¹、5.4×10²、5.4×10³、5.4×10⁴、5.4×10⁵、5.4×10⁶、5.4×10⁷、5.4×10⁸、5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒。

本发明的主要原理为：根据多子小瓜虫的靶标分子组织蛋白酶L基因序列，设计一对特异引物和一条探针，探针的5’带有荧光基团(如：FAM)，3’端带有淬灭基团(BHQ)，当荧光探针处于完整状态时受到淬灭基团限制，不能激发荧光，然而当探针被Taq酶降解后，5’端荧光基团便会游离出来，发出荧光，从而检测出样品中靶基因的拷贝数。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明方法检测方便，省去了常规PCR方法中的电泳步骤以及杜绝了传统PCR的气溶胶污染，大大节约时间和提高检测准确性；

(2)本发明检测灵敏度高，检测下限为5.4拷贝/μL，约为1只多子小瓜虫，重复性好(该技术的变异系数低于5％)；

(3)本发明提供的引物和探针对多子小瓜虫亲缘关系较近的四膜虫、草履虫以及养殖水体水样和底泥均无扩增，特异性强；

(4)本发明可应用于水体环境中和鱼体上的多子小瓜虫检测，为预防多子小瓜虫病，提供技术支持。

附图说明

图1是提取的总DNA电泳图；其中，泳道1为多子小瓜虫幼虫DNA，泳道2为嗜热四膜虫DNA，泳道3为尾草履虫DNA，泳道4为养殖水体混合浮游生物总DNA，泳道5为非养殖水体混合浮游生物总DNA，泳道6为养殖池塘底泥混合生物总DNA，M为标准分子量DL10000。

图2是不同退火温度PCR产物电泳结果；其中，泳道1为54℃、泳道2为58℃、泳道3为60℃、泳道4为阴性对照、M为标准分子量DL500。

图3是不同DNA模板的PCR产物电泳结果；其中，泳道1和2为多子小瓜虫幼虫DNA扩增产物、泳道3和4为嗜热四膜虫DNA扩增产物、泳道5和6为尾草履虫DNA扩增产物、泳道7和8为非养殖水体混合浮游生物DNA扩增产物，泳道9和10为一个养殖水体混合浮游生物DNA扩增产物、泳道11和12为另外一个养殖水体混合浮游生物DNA扩增产物、泳道13和14为养殖水体底泥混合生物DNA扩增产物、泳道15为阴性对照、M为标准分子量DL500。

图4是TaqMan探针实时荧光定量PCR重组质粒的标准曲线；其中，Cq为反应循环数。

图5是TaqMan探针实时荧光定量PCR检测重组质粒的动力学曲线；其中，图中从左到右的模板浓度依次为：5.4×10⁹拷贝/μL，5.4×10⁸拷贝/μL，5.4×10⁷拷贝/μL，5.4×10⁶拷贝/μL，5.4×10⁵拷贝/μL，5.4×10⁴拷贝/μL，5.4×10³拷贝/μL，5.4×10²拷贝/μL，5.4×10¹拷贝/μL，5.4×10⁰拷贝/μL，NTC为阴性对照。

图6是TaqMan探针荧光定量PCR灵敏度试验扩增曲线；其中，1-10分别表示：5.4×10⁹拷贝/μL，5.4×10⁸拷贝/μL，5.4×10⁷拷贝/μL，5.4×10⁶拷贝/μL，5.4×10⁵拷贝/μL，5.4×10⁴拷贝/μL，5.4×10³拷贝/μL，5.4×10²拷贝/μL，5.4×10¹拷贝/μL，5.4×10⁰拷贝/μL，11为阴性对照。

图7是不同浓度模板的PCR扩增产物电泳结果；其中，泳道1-10分别为5.4×10⁹～5.4×10⁰拷贝/μL模板扩增产物，泳道11为阴性对照，M为标准分子量DL2000。

图8是多子小瓜虫DNA模板扩增不受其它生物DNA干扰的荧光定量PCR扩增曲线，其中，图中的1-2代表稀释的纯重组质粒扩增曲线，3-4代表重组质粒与各样品模板混匀后的扩增曲线，5-6代表多子小瓜虫DNA扩增曲线，7-8代表多子小瓜虫DNA模板与其它样品模板混匀后扩增曲线，9-11代表阴性对照和未加入多子小瓜虫DNA模板和质粒的混合样品。

图9是Taqman探针荧光定量PCR特异性扩增曲线，其中，1,2是多子小瓜虫幼虫DNA和多子小瓜虫包囊DNA扩增曲线，3-8为嗜热四膜虫DNA、尾草履虫DNA、养殖水体混合浮游生物DNA、非养殖水体混合浮游生物DNA、养殖池塘底泥混合生物DNA和阴性对照扩增曲线。

图10是多子小瓜虫个数与基因拷贝数的线性关系；其中，1只虫子对应的组织基因拷贝数约为7个拷贝数。

图11是不同地区养殖水体样本DNA的扩增曲线；其中，A：1为阳性对照，2-3为花都水体阳性样本，4-14为花都其它水体样本及阴性对照；B：1,2为阳性对照，3-31为番禺、中山市养殖水体样本及阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用的多子小瓜虫、嗜热四膜虫、尾草履虫，均为常规病原体。

实施例1：按以下配方制作多子小瓜虫的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒：

(a)引物和探针试剂：包括上游引物(Cathepsin F)，下游引物(Cathepsin R)和探针(Cathepsin-Probe)反应液。

根据已公开的多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因(CTSL基因)(登录号为XM_004039979.1)进行分析，设计一对特异引物和Taqman探针，具体序列如下：

上游引物(Cathepsin F)：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；(SEQ ID NO：1)

下游引物(Cathepsin R)：5’-CTCCTTTAATTCTTTATAAGTTTTC-3’；(SEQ ID NO：2)

Taqman探针序列为(Cathepsin-Probe)：

5’-FAM-TTTCTCACCATAAAGCTCCTACACATG-BHQ-3’；(SEQ ID NO：3)

其中，探针序列的5’端采用荧光基团FAM标记，3’端为淬灭基团BHQ标记，扩增得到的多子小瓜虫组织蛋白酶基因长度为192bp。

(b)聚合酶链式反应试剂：含有10×PCR缓冲液(不含MgCl₂)、MgCl₂(25mmol·mL^-1)、四种脱氧核苷酸的混合物(2.5mM)、Taq酶(5个单位/μL)、灭菌双蒸水。

按照以下步骤建立检测多子小瓜虫的方法：

1.DNA的提取

提取多子小瓜虫幼虫、嗜热四膜虫、尾草履虫、水体混合浮游生物以及养殖池塘底泥总DNA，-20℃保存备用。阴性对照模板为无菌水。

提取的总DNA电泳图，如图1所示，可知，提取的总DNA完整性好，可满足后续实验。

2.Taqman探针引物合适退火温度的确定

以多子小瓜虫幼虫DNA为模板，进行常规PCR扩增，退火温度设置为54、58、60℃，实验结束后通过3％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，确定合适退火温度为58℃(图2所示)。

3.常规PCR检测引物特异性

以提取的多子小瓜虫幼虫DNA、嗜热四膜虫DNA、尾草履虫DNA、水体混合浮游生物DNA、底泥混合生物DNA为模板，退火温度58℃，常规PCR扩增，分析引物的特异性，扩增产物电泳图表明只有多子小瓜虫幼虫模板中有扩增，其它模板没有扩增(图3)，说明该引物特异性良好，能够满足后续检测需要。

4.重组靶标质粒构建及标准品制备

采用CTSL基因引物(Cathepsin F/Cathepsin R)，以多子小瓜虫幼虫DNA为模板，用高保真酶对组织蛋白酶L(CTSL)基因目的片段进行PCR扩增，获得片段长度为192bp的目标条带(PCR产物经纯化回收、连接、转化等步骤构建重组靶标基因片段质粒)，将重组靶标质粒菌株进行阳性克隆筛选，再送去华大基因测序，结果与原序列相符，与多子小瓜虫相应蛋白酶序列的同源性高达99％，得到重组质粒。然后采用生工质粒提取试剂盒提取重组质粒，通过BioTek Epoch微型核酸定量仪测得浓度为170.5ng/μL，按照公式：拷贝/μL＝6.02×10²³×(ng/μL×10^-9)/(DNAlength×660)，计算其拷贝数为：5.4×10¹⁰拷贝/μL，按照10倍梯度稀释，保存于-20℃备用。

5.荧光定量PCR反应体系优化

用稀释的质粒标准品5.4×10⁵拷贝/μL为模板，在最佳退火温度条件下，采用梯度实验优化荧光定量PCR引物、探针和Taq酶浓度以及反应体系中的四种脱氧核苷酸的混合物、镁离子浓度和缓冲液含量，综合考虑CT值、荧光强度和重复性，确定最佳的荧光定量PCR反应条件。

优化得到的反应体系为：总体积24μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL，氯化镁(25mmol·mL^-1)3.2μL，四种脱氧核苷酸的混合物(2.5mM)2μL，上下游引物(10μM)各1μL，特异性探针(10μM)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL，质粒标准品1μL，去离子水12.55μL。

荧光定量PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性15s；58℃退火30s；72℃延伸20s；如此40个循环。每次都在58℃退火结束时收集荧光信号；阴性对照的Ct值应不显示。

6.荧光定量PCR标准曲线的建立

以重组质粒为阳性模板进行荧光定量PCR反应，按照10倍梯度稀释得到5.4×10⁹～5.4×10⁰拷贝/μL的质粒，在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪器上进行检测，得到检测重组质粒的扩增动力学曲线(图5)，计算出扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始拷贝数(Sq)的对数值的标准曲线(图4)，由图4所知荧光定量PCR标准品的浓度在5.4×10⁹～5.4×10⁰拷贝/μL范围内具有良好线性关系，Ct＝-3.164×lg(Sq)+36.848，R²＝0.993，扩增效率E＝107％。

7.荧光定量PCR灵敏度试验

将阳性质粒以5.4×10¹⁰拷贝/μL为原始浓度经10倍梯度稀释，得到5.4×10⁹～5.4×10⁰拷贝/μL的质粒为模板，进行荧光定量PCR反应，得到灵敏度动力学扩增曲线(图6)，当标准品的拷贝数为5.4×10⁰拷贝/μL时仍能检测到，而阴性对照无扩增，说明该检测方法的最低检测限度可达5.4拷贝/μL。另外，常规PCR只能检测到5.4×10⁴拷贝/μL(图7)，因此，Taqman探针荧光定量PCR的检测灵敏度要比常规PCR的灵敏度要高10000倍。

8.荧光定量PCR特异性及其抗其它DNA对特异扩增的干扰

为验证本实验建立的荧光定量PCR引物的特异性以及抗其它DNA对特异扩增的干扰，以嗜热四膜虫DNA、尾草履虫DNA、水体混合浮游生物DNA、底泥生物混合DNA以及混合DNA(每种DNA取2μL混合)为模板。阳性对照为多子小瓜虫DNA，阴性对照为无菌水，用本研究建立的Taqman探针荧光定量PCR反应体系检测，分析引物的特异性及其抗其它DNA对特异扩增的干扰。结果显示该引物只能扩增多子小瓜虫DNA模板(图9)，其它DNA不抑制特异引物扩增小瓜虫幼虫DNA(图8)，表明该技术适合用于水体、底泥和鱼体的多子小瓜虫检测。

9.荧光定量PCR的重复性和稳定性

重复性分析包括组内重复和组间重复。选取5.4×10⁸拷贝/μL～5.4×10¹拷贝/μL8个不同浓度的质粒为阳性模板，在最优反应体系条件下进行3次重复试验，每隔1天进行一次，重复三次，将得到的CT值进行分析，计算其变异系数，结果(如表1，表2)显示组内变异系数都小于5％，而且最大的组内变异系数为4.6％，组间变异系数为0.9％。

表1不同天数荧光定量PCR Ct值组内重复性试验数据

表2三次荧光定量PCR Ct值组间重复性试验数据

10.多子小瓜虫个数与基因拷贝数间的线性关系

在光学显微镜下分别计数收集100和200只多子小瓜虫幼虫，然后分别提取总DNA。将提取的100只幼虫的总DNA稀释至10，8，6，4，2，1只幼虫总DNA量，200只幼虫总DNA稀释至200，20，2只幼虫总DNA量，进行荧光定量PCR检测，结果如表3和表4所示，得到线性回归直线方程(图10所示)。根据表3和4可得1只虫子的基因拷贝数约为7个拷贝数。

表3虫子个数对应的基因拷贝数

虫子个数	10	8	6	4	2	1	0
								基因拷贝数	87.09	67.61	46.77	33.88	13.49	7.24	0

表4虫子个数对应的基因拷贝数

虫子个数	0	2	20	200
					基因拷贝数	0	14.13	123.03	1000

实施例2养殖水体样本检测

从广州花都、番禺以及广东中山市的草鱼养殖池塘分别采集1L水体样品，抽滤浓缩水样，提取水样DNA，然后用本发明所建立的检测方法对养殖水体40份样品进行TaqMan探针荧光定量PCR方法检测，同时设置阳性样品组和阴性样品组，其检测结果如表5和图11所示。

表5 TaqMan探针荧光定量PCR对养殖水体的检测结果

采样地点	池塘数量	阳性样品数量	阳性检出率(％)
				花都	12	2	16.7
番禺	12	0	0
				中山市	16	0	0

由表5和图11可以看出，花都地区水样的检出率为16.7％，正是养草鱼苗患过多子小瓜虫病的池塘。番禺和中山市池塘水体没检出多子小瓜虫，可能与其所养为大个体的脆肉鲩有关，一般为2-3龄，难感染小瓜虫。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cathepsin F

<400> 1

caggagttgc tttctttg 18

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cathepsin R

<400> 2

ctcctttaat tctttataag ttttc 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cathepsin-Probe

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (27)..(27)

<223> BHQ修饰

<400> 3

tttctcacca taaagctcct acacatg 27

Claims

1.组织蛋白酶L基因作为分子靶点在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用，其特征在于：

所述的组织蛋白酶L基因的GenBank：XM_004039979.1。

2.一种用于检测多子小瓜虫的试剂，其特征在于：包含能够检测多子小瓜虫的权利要求1中所述的组织蛋白酶L基因的引物。

3.根据权利要求2所述的用于检测多子小瓜虫的试剂，其特征在于：

能够检测多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因的引物，序列如下：

Cathepsin F：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；

Cathepsin R：5’-CTCCTTTAATTCTTTATAAGTTTTC-3’；

Cathepsin-Probe：5’-FAM-TTTCTCACCATAAAGCTCCTACACATG-BHQ3’。

4.权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂在检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂盒中的应用。

5.一种用于检测多子小瓜虫的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂。

6.一种定量检测多子小瓜虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：所述方法为非疾病诊断方法；

(1)提取待测样品DNA；

(3)利用建立好的检测方法，加入权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂和待测样品DNA，配成qPCR反应体系，进行qPCR反应，得到待测样品的Ct值；

(4)多子小瓜虫定量检测

7.权利要求6所述的方法，其特征在于：

每只多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因拷贝数为7个拷贝数；

步骤(1)中，待测样品为水体、底泥或鱼体组织。

8.权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤(2)、(3)中，qPCR反应体系，为：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol·mL^-1的氯化镁3.2μL，2.5mM四种脱氧核苷酸的混合物2μL，10μM的Cathepsin F/R各1μL，10μM的Cathepsin-Probe 0.5μL，5U/μL的Taq酶0.25μL；模板DNA 1μL，灭菌双蒸水12.55μL；反应体系总体积为24μL。

9.权利要求6所述的方法，其特征在于：

qPCR反应条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性15s，58℃退火30s；72℃延伸20s，如此40个循环；每次都在58℃退火结束时收集荧光信号；阴性对照的Ct值应不显示。

10.权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中，以不同拷贝数(Sq)的重组质粒是拷贝数为5.4×10⁰～5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒；具体为5.4×10⁰、5.4×10¹、5.4×10²、5.4×10³、5.4×10⁴、5.4×10⁵、5.4×10⁶、5.4×10⁷、5.4×10⁸、5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒。