CN111961756A

CN111961756A - 用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN111961756A
Application number: CN202010844841.6A
Authority: CN
Inventors: 梁瑞英; 梁琳; 崔尚金; 翟志安; 赵静杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2020-11-20

Abstract

本发明提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。所述试剂盒中包含扩增目的基因VP2的引物对(SEQ ID NO:1‑2)以及检测目的基因的Taqman探针(SEQ ID NO:3)。本发明还提供猫泛白细胞减少症病毒的实时荧光定量PCR检测方法，该方法能够快速、灵敏地检测出猫泛白细胞减少症病毒，提高了检测结果的准确性，对于临床样品的快速诊断具有重要意义。

Description

用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术，具体地说，涉及一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。

背景技术

猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，FPV)是细小病毒科，细小病毒亚科成员，通常引起幼猫急性且致命的疾病，引起严重的胃肠炎和免疫抑制性疾病，具有高度的传染性，其中幼小易感动物发病率和死亡率高达25～90％，成年猫感染后常常出现免疫应答，无典型临床症状，怀孕母猫感染后，经过血液循环可以扩散至胚胎，造成感染并且导致流产。犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)由FPV进化而来，虽然CPV与FPV基因组序列仅有0.5％的差异，但CPV-2不能在猫体内复制，但其变体(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)能够感染且在猫体内复制，给FPV的诊断带来挑战。

目前，对FPV检测方法主要包括电镜观察法，观察是否符合FPV形态特征、病毒分离培养法、血清学监测法、血凝(HA)和血凝抑制实验(HI)，常见的FPV核酸检测方法包括普通PCR和

Green I实时荧光定量PCR，该方法基于

Green染料与DNA双螺旋小沟结合的原理，实现荧光定量。但这种结合为非特异性的，非特异性产物和引物二聚体的形成，无法达到检测目的。且上述方法存在检测周期较长且敏感性低的问题，不适合临床样品的快速检测和流行病学调查。目前尚无TaqMan qPCR技术检测猫泛白细胞减少症病毒的相关报道，VP2为主要结构蛋白，是猫泛白细胞减少症病毒衣壳的主要成分，暴露于衣壳蛋白表面，是病毒的主要免疫保护性抗原蛋白，本发明针对病毒VP2基因建立快速、敏感的TaqMan qPCR检测试剂盒，用于临床早期诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一对猫泛白细胞减少症病毒检测引物，包括序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

第二方面，本发明提供与所述引物配套使用的探针，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。

第三方面，本发明提供含有SEQ ID NO:1-2所示引物和/或SEQ ID NO:3所示探针的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒，包括SEQ ID NO:1-3所示的引物和探针。

所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、阳性标准质粒等中的至少一种。

第五方面，本发明提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的qPCR反应体系，所述反应体系按20μL计包含：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各0.2～1μl，10μM探针0.4～0.6μl，ddH₂O补齐至20μl。

第六方面，本发明提供猫泛白细胞减少症病毒检测方法(含非诊断目的)，包括如下步骤：

(1)提取待测样品中的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-3所示的引物和探针进行PCR扩增；

(3)分析PCR扩增产物。

优选地，步骤(2)的PCR反应体系为：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各1μl，10μM探针0.4μl，ddH₂O补齐至总体积20μl。

步骤(2)的PCR扩增条件为：93～95℃预变性3～5min；93～95℃变性10～15s，55～65℃退火及延伸30～45s。PCR扩增条件优选为：95℃预变性5min；95℃变性15s，59℃退火及延伸30s，40个循环。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的检测猫泛白细胞减少症病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(TaqManqPCR)检测方法，提高了检测结果的准确性。特异性实验结果显示，本方法可以特异性地扩增出猫泛白细胞减少症病毒的qPCR曲线，具有检测FPV和CPV及其变体的能力，而对感染猫的其他常见病毒均无扩增曲线。重复性实验结果表明，组内和组间Ct值变异系数较低(<1％)并且差异较小，表明该方法重复性较稳定，实验结果可靠。标准曲线显示，该方法具有良好的相关性(R²＝0.9997)和优异的扩增效率(扩增效率在90％～110％之间)。敏感性实验结果显示，qPCR的敏感度是普通PCR的10倍，最低可检测到的质粒浓度为115copies/μL。本发明为临床样品的快速诊断提供有效手段。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1-4：FPV VP2基因；5：阴性对照。

图2为本发明较佳实施例中FPV TaqMan qPCR特异性试验和检测CPV-2变体的能力；其中，A：FPV；B：CPV-2c；C：CPV-2b；D：CPV-2a；E：FHV-1；F：FCV；G：阴性对照。

图3为本发明较佳实施例中FPV TaqMan qPCR敏感性检测实验；其中，1～6：1.15×10²～1.15×10⁷copies/μL质粒。

图4为本发明较佳实施例中FPV TaqMan qPCR标准曲线。

图5为本发明较佳实施例中FPV普通PCR敏感性检测实验；其中，M：DNA分子质量标准；1～6：1.15×10²～1.15×10⁷copies/μL质粒。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及的AceQ qPCR Probe Master Mix来自于南京诺唯赞生物科技有限公司生产的荧光探针PCR试剂盒。

实施例1基于TaqMan qPCR技术建立猫泛白细胞减少症病毒检测方法

1、标准品制备方法

根据GenBank公布的猫泛白细胞减少症病毒VP2基因，利用MEGA5.0软件通过多重比对获得病毒高度保守区域，利用DNAMAN软件，设计一对引物，用于标准品的构建，同时设计一对特异性引物及TaqMan探针，用于病毒TaqMan qPCR扩增。

用于TaqMan qPCR扩增的引物序列(SEQ ID NO:1-3)：

FPV-qPCR-F：5′-TTAATACCATCTCATACTGGAACT-3′(VP2基因位置：652bp～675bp)

FPV-qPCR-R：5′-TTGAACATCATCTGGATCTG-3′(VP2基因位置：707bp～726bp)

TaqMan probe：5′-FAM-TGGCACACCAACAATGTATATCATG-BHQ1-3′(VP2基因位置：678bp～703bp)

用于标准质粒构建的引物序列(SEQ ID NO:4-5)：

FPV-VP2-1-F：5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3′(VP2基因位置：1bp～22bp)

FPV-VP2-1-R：5′-ATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3′(VP2基因位置：1729bp～1752bp)

2、标准品制备方法

为了测定样品准确浓度，扩增FPV VP2基因进行标准品的构建(图1)。VP2基因扩增体系：2×Phanta Max Master Mix 12.5μl、模板DNA 1～2μl、FPV-VP2-1-F(10μmol/mL)1～2μl和FPV-VP2-1-R(10μmol/mL)1～2μl，用ddH₂O补齐至25μl。扩增程序：93～95℃预变性3～5min；93～95℃变性15～20s，55～58℃退火15～20s，72℃延伸90～100s，30～35个循环；72℃延伸5～10min；4℃保存。扩增产物在10g/L的琼脂糖凝胶(30ml 1×TAE，3μl核酸染料，0.3g琼脂粉)中，以110V电泳30min，在紫外凝胶成像分析系统(Tanon-1600)中观察条带位置，切胶回收目的片段并连接pMD18-T载体，16℃连接过夜后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；在含100ng/mL氨苄青霉素的培养板上37℃培养12h，挑取单个菌落摇菌12h后用小量质粒抽提试剂盒提取质粒，进行普通PCR分析鉴定；将筛选的阳性重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序。MegAline软件比对分析标准品测序结果，测序结果与参考毒株(GenBankNo.MH165482)基因的同源性为100％，表明成功构建标准品，将重组质粒命名为pMD18-T-VP2-FPV。标准品经Implen超微量分光光度计测量3次，平均浓度为440.83ng/μL，平均纯度为1.842。换算后浓度为1.15×10¹¹copies/μL。计算公式为：拷贝数＝6.02×10²³(copies/mol)×[标准品浓度(ng/μL)×10^-9]/标准品长度(bp)×660(Dalton/bp)。

3、TaqMan探针qPCR反应条件的优化

采用AceQ qPCR Probe Master Mix试剂盒推荐的20μl体系，以相同浓度的阳性质粒为模板，分别对正、反向游引物(10μM)加入量(0.2～1.0μl)、探针(10μmol/mL)加入量(0.4～0.6μl)、退火温度(55～65℃)重要参数进行优化，通过比较Ct值、荧光强度和扩增效率来判定优化结果，并设无模板对照。通过探索反应条件，最后建立了总体积为20μl的qPCR反应体系，各试剂具体使用量：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μl，样品DNA 1μl，正向引物FPV-VP2-1-F(10μM)1μl，反向引物FPV-VP2-1-R(10μM)1μl，TaqMan探针(10μM)0.4μl，ddH₂O补齐至20μl。

4、TaqMan探针qPCR的特异性以及检测FPV及CPV的能力

用建立的qPCR方法分别对常见感染猫的病毒：猫疱疹毒(FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)、FPV、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)进行检测，验证该方法的特异性以及检测FPV和CPV的能力。检测结果显示，本发明建立的qPCR方法可以特异性地检出FPV、CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，且Ct值均在有效范围内，其他病毒及阴性对照均无扩增。表明这种方法特异性较好并且具有检测FPV及CPV及其突变体的能力(图2)。

5、TaqMan探针qPCR的重复性

为了评估该检测方法的重复性和稳定性，选择高、中、低(1.15×10⁷copies/μL、1.15×10⁵copies/μL、1.15×10³copies/μL)3个不同浓度的标准质粒(pMD18-T-VP2-FPV)为模板进行批内及批间实验，每个样品重复3次。结果显示组内和组间Ct值变异系数均小于1％，表明该方法重复性好，实验结果稳定可靠(表1)。

表1 TaqMan探针qPCR重复实验

注：

表示样本均值，s表示方差的平方根。

6、TaqMan探针qPCR标准曲线建立

将连续梯度倍比稀释好的阳性标准品pMD18-T-VP2-FPV(1.15×10³～1.15×10⁷copies/μL)分别进行TaqMan探针qPCR，每个浓度梯度做3个重复。使用GraphPadPrism5.0(美国GraphPad软件)绘制TaqMan探针qPCR的标准曲线并进行线性回归分析。qPCR的标准曲线线性方程为y＝-3.226x+42.64，相关系数R²值为0.9997，表明qPCR具有良好的线性关系。qPCR的斜率为-3.226，相当于PCR扩增效率为104.2％(图4)。

7、TaqMan探针qPCR与常规PCR敏感性对比分析

将连续梯度倍比稀释好的阳性标准品pMD18-T-VP2-FPV(1.15×10¹～1.15×10⁷copies/μL)分别进行常规PCR，并且与TaqMan探针qPCR比较敏感性。敏感性实验结果显示，qPCR的最低检测限为115copies/μL，相当于DNA浓度为2.2×10^-11μg/μL(图3)，普通PCR最低检测限为1150copies/μL(图5)，qPCR是普通PCR检测灵敏度的10倍。

实施例2引物及探针的优化

本发明根据猫泛白细胞减少症病VP2基因的高度保守片段，遵循荧光定量PCR设计原则，找到大小为100～200bp相对保守的核酸片段设计引物和探针。使用Primer Express3软件进行引物和探针的设计，原则为：探针序列保守，Taqman探针长度最好在25～32bp之间，且Tm值在68～72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值比引物的Tm值高出10℃，保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。挑选出若干条候选引物和探针(表2)。

表2根据猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的高度保守片段设计的3组引物探针

qPCR检测结果显示，组合3引物特异性强、敏感性高，而组合1和组合2特异性差，最终优选将组合3作为最佳的引物和探针。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒

<130> KHP201111385.2

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaataccat ctcatactgg aact 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgaacatca tctggatctg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcacacca acaatgtata tcatg 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagtgatg gagcagttca ac 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atataatttt ctaggtgcta gttg 24

Claims

1.猫泛白细胞减少症病毒检测引物，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。

3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。

4.猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、阳性标准质粒中的至少一种。

6.用于检测猫泛白细胞减少症病毒的qPCR反应体系，其特征在于，所述反应体系按20μL计包含：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各1μl，10μM探针0.4μl，ddH₂O补齐至20μl；

其中，正向引物、反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

7.非诊断目的猫泛白细胞减少症病毒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品中的DNA；

(3)分析PCR扩增产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应体系为：2×AceQ qPCRProbe Master Mix 10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各0.2～1μl，10μM探针0.4～0.6μl，ddH₂O补齐至总体积20μl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR扩增条件为：93～95℃预变性3～5min；93～95℃变性10～15s，55～65℃退火及延伸30～45s，35～40个循环。