CN112575119A

CN112575119A - 快速检测禽白血病毒j亚群的rpa引物和探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112575119A
Application number: CN202011162977.5A
Authority: CN
Inventors: 曲光刚; 沈志强; 李芸; 姚永秀; 苗立中; 唐娜; 成子强
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-03-30

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。该快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示、反向引物序列如SEQ ID No.2所示；探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明所建立的RPA方法可实现对ALV‑J亚群的快速检测，RPA检测限为10copies/μL；RPA仅特异性扩增禽白血病病毒J亚群GP85基因。采用本发明的引物和探针及检测方法具有优异的特异性、敏感性，简便、快速，实现了禽白血病毒J亚群现场快速检测；为禽白血病J亚群的临床快速检测提供了一种新的可靠的快速检测工具。

Description

快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽C型反录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，分为11个亚群，又分为内源性病毒和外源性病毒，其中外源性病毒J亚群是危害最大的病毒亚群。该病毒可导致脏器肿瘤生长、体重增长缓慢、性成熟推迟、产蛋率大幅下降、畸形蛋增多、免疫应答功能降低或消失；该病的传播途径包括垂直传播和水平传播，且至今无可供使用的疫苗和药物对鸡群进行预防和治疗，给养禽业造成了巨大经济损失，严重阻碍了养禽业的健康发展。ALV的病毒粒子基因组为单股正链RNA病毒，每个基因组分子有三个编码基因分别为gag-pol-env,不同亚群的生物特性与病毒的囊膜蛋白GP85的特性相关，从而判断亚群。

目前检测ALV J亚群的现有实验室方法包括传统的病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、RT-RCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光检测技术(IFA/FA)等。传统的病毒分离鉴定方法，不仅周期长，而且操作复杂、费用高，费时费力不适用病毒的快速检测，更无法在临床上实现高通量检测；目前常用的ELISA病毒检测方法适合大规模检测，但假阳性高，仍需进一步确定病毒是否为ALV J；IFA检测准确性高，但是需要荧光显微镜等实验器材限制了在实际生产中的检测，费时费力。分子生物学方法如PCR技术能够节省时间，但其反应时间仍然较长，而RT-PCR敏感性特异性强，但是需要昂贵试验仪器，且两种方法均不适合现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)，该技术是一种在常温下可以使核酸快速扩增的方法。在37-42℃范围内的等温条件下，重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single stranded protein，SSP)的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，结合荧光探针，恒温条件下20至30min即可获得检测结果，适合于现场快速检测。目前，ALV有A亚群、B亚群、C亚群、K亚群、J亚群等多个亚群，建立以GP85基因为靶基因，特异敏感检测ALVJ亚群RPA快速检测方法在ALV J亚群现场快速检测中具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法，引物和探针设计独特，具有优异的特异性、敏感性，灵敏度可达10copies/μL，简便、快速，实现了禽白血病毒J亚群现场快速检测，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案之一是：

一种快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示、反向引物序列如SEQ ID No.2所示；探针序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.1：TTCCATTTTKCTATGAAGTCACGCAAYTCT；

SEQ ID No.2：CAAGCCCTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA；

SEQ ID No.3：

TAGATATTGTGGATTCACCAGYAACGAGACGTAYTATMGAGGGRAC。

进一步的，探针序列中荧光报告基团、荧光淬灭基团、四氢呋喃位点的具体位置如下：

TAGATATTGTGGATTCACCAGYAACGAGAC[FAM-DT][THF]G[BJQ1-DT]TAYTATMGAGGGRAC-C3 SPACER。

本发明所采用的技术方案之二是：

如上所述的RPA引物和探针在制备快速检测禽白血病毒J亚群的试剂中的应用。

本发明所采用的技术方案之三是：

一种快速检测禽白血病毒J亚群的试剂盒，包括如上所述的RPA引物和探针。

进一步的，所述的快速检测禽白血病毒J亚群的试剂盒，试剂盒中RPA引物和探针的终浓度为10μM。

本发明所采用的技术方案之四是：

所述的试剂盒在快速检测禽白血病毒J亚群中的应用。

进一步的，所述禽白血病毒J亚群选取禽白血病毒J亚群GP85基因。

本发明所采用的技术方案之五是：

一种快速检测禽白血病毒J亚群GP85基因的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA作为模板；

(2)针对待测样品的特定基因GP85基因设计引物和探针；

(3)采用设计的引物及探针组合，对模板DNA进行快速RPA扩增及实时荧光检测。

进一步的，所述RPA扩增反应体系为50μL:2×Recation Buffer 25μL加入配套PCR反应管中，再加入1.8mMdNTP Mix 8.2μL、10×Probe Mix 5μL、10μmol/L的引物各2.1μL，10μmol/L的探针0.6μL，20×Core Recation Mix,50×Exo 1μL，模板DNA lμL，最后加入280mmol/L的醋酸镁溶液1.25μL；扩增程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于38℃恒温反应20min。

本发明的有益效果：

本发明通过参考Genbank中已公布的禽白血病J亚群GP85基因序列，利用DNAstar分子生物学软件的MegAlign功能，分析GP85基因序列的保守区，以引物的长度控制在30-36bp，引物的TM值控制在50-100℃，引物的GC％控制在20-70％的原则，设计多套RPA简并引物及探针，从中筛选出可快速有效检测禽白血病病毒J亚群GP85基因成分的通用引物及探针组合。利用该对引物进行快速实时荧光检测，以ALV A亚群、B亚群、C亚群、K亚群、J亚群及其它禽源传染病鸡新城疫(NDV)、禽流感病毒(AIV-H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)病毒核酸为模板，验证该方法的特异性，结果只有禽白血病J亚群为阳性，说明该方法具有良好的特异性。敏感性结果证明该方法可检测到的最低限值10copies/μL，相比通常RPA检测方法灵敏度在100copies/ul左右，提升显著，证明该方法具有较高的灵敏度。

本发明建立的禽白血病J亚群的RPA荧光等温扩增方法具有灵敏度高、检测时间短等优势，其灵敏度高于常规PCR、ELISA方法，检测限值为10copies/μL；其检测时间为20min，只有ELISA检测方法的一半、普通PCR方法的四分之一。

本发明高灵敏性的引物和探针，阴性对照平稳，反应线一直呈直线，无抬头现象。

附图说明

图1为标准质粒的构建、对构建的阳性标准品进行PCR鉴定图；

图2为本发明禽白血病病毒J亚群荧光RPA方法特异性检测；其中，1:J亚群核酸；2-9：A、B、C、K、亚群核酸、IBDV、HLTV、IBV、NDV及H9核酸；N：阴性对照；

图3为本发明禽白血病病毒J亚群荧光RPA方法灵敏度检测；其中，N：阴性对照；1：10⁶copies/μL；2：10⁵copies/μL；3：10⁴copies/μL；4：10³copies/μL；5：10²copies/μL；6：10¹copies/μL；

图4为本发明禽白血病病毒J亚群荧光RPA方法重复性检测；其中，1-3：ALV-A102copies；4-6：ALV-A 104copies；7-9：ALV-A 106copies；N：阴性对照；

图5为禽用冻干疫苗PCR检测ALV J亚群病毒污染电泳凝胶结果；其中，M：MarkeDL2000；N：阴性对照；P阳性对照；1-12泳道：鸡新城疫传支二联苗007、152、063、142，鸡新城疫活疫苗145、179，鸡痘活疫苗134、147，IBDV、HLTV、IBV、NDV、H9，鸡传染性法氏囊124，鸭瘟活疫苗153，鸡传染性法氏囊118，鸭瘟活疫苗177；

图6为禽用冻干疫苗及毒种荧光RPA检测APV J亚群病毒污染结果；其中，N：阴性对照；P阳性对照；1-12：鸡新城疫传支二联苗007、152、063、142，鸡新城疫活疫苗145、179，鸡痘活疫苗134、147、IBDV、HLTV、IBV、NDV、H9、鸡传染性法氏囊124，鸭瘟活疫苗153、鸡传染性法氏囊118、鸭瘟活疫苗177。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中：TwistAmp^TMDNA amplification kit购自英国Twi stDx公司；病毒DNA快提试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒，均购自Omega生物工程有限公司；pMD-18T载体购自TaKaPa有限公司；核酸快速提取液购自中科芯瑞生物科技有限公司。

实施例1病毒核酸的提取

在提取病毒核酸时使用快速提取试剂，从样品处理到获取样品核酸需要10min，液体病料包括血液和血清处理为：取10μL血液加入90μL PBS混匀，加入100μL裂解液，金属浴100℃5-10min，处理好的样品核酸可直接用于RPA检测；组织病料处理为：取0.05g到1.5ul离心管，加200ul PBS用研磨器混匀成匀浆液(做好防污染工作，争取做到一病料一研磨头)；取100ul组织匀浆液加入100ul裂解液，充分混匀，将处理好的病料金属浴，100℃5-10min，处理好的样品核酸可直接用于RPA检测，或于-80℃中保存备用。

实施例2荧光RPA引物和探针设计合成

参考Genbank公布禽白血病J亚群病毒GP85基因序列，选择特异性保守区域，利用Primer5.0软件分析设计RPA扩增引物和探针，根据禽白血病J亚群的GP85基因保守序列，与A、B、C、E、K亚群基因序列进行比对，设计多套RPA引物及探针，从中筛选出一套可快速有效检测出禽白血病J亚群病毒GP85基因成分、且特异性及灵敏度最佳的引物及探针组合。

注:C3 Spacer代表3’端的C3间臂；FAMdT代表FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶；THF代表四氢呋喃分子；BHQl-dT代表荧光淬灭基团BHQl标记的胸腺嘧啶。

实施例3构建标准阳性质粒

本实验所用的标准阳性对照为实验室构建的含有gp85基因序列的质粒。将本实验保存的禽白血病J亚群核酸作为模板，F1/R1特异性引物扩增目的基因片段，扩增体系为95℃5min；94℃40s,57℃40s，72℃40s，共30个循环；72℃5min延伸。琼脂糖电泳检测。纯化PCR产物，克隆到pMD-18T载体上，采用PCR验证阳性克隆，然后进行测序，命名为pMD18T-ALV。将阳性克隆用LB培养基(含100ug/ml氨苄霉素)增殖，采用质粒纯化试剂盒提取重组质粒进行PCR和测序鉴定。测定浓度并测定其拷贝数，按照文献方法计算其拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝6.02×IO23×质粒浓度(ng/μL)×10—V(质粒碱基数×660)，作为阳性标准品。保存于-80℃备用。

采用F1/R1特异性引物,对禽白血病J亚群gp85基因进行PCR扩增，获得片段与预期大小一致的(1548bp)；对构建的阳性标准品进行PCR鉴定，也获得了预期目的片段(图1)，测序结果显示插入片段正确，标准品成功构建。

实施例4荧光RPA反应条件的优化

针对不同浓度的阳性标准品，以出现的最小CP值、最大荧光值为指标，分别对反应温度及引物浓度进行了优化，获得最佳温度反应条件为38℃，最佳反应体系为40个循环、30s读一次，如下表1。

表1 RPA反应体系

荧光RPA扩增程序：温度37℃-42℃，反应时间15-20min。自左至右一次为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，其中37℃和38℃均可扩增，38℃最佳，荧光RPA在罗氏480荧光检测仪中进行，见表2。

表2荧光RPA反应温度优化

实施例5检测禽白血病J亚群的实时荧光RPA方法

禽白血病J亚群的实时荧光RPA检测方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)将从(1)中提取的DNA进行等温扩增：

RPA反应体系(50μL):2×Recation Buffer 25μL加入配套PCR反应管中，再加入1.8mMdNTP Mix 8.2μL、10×Probe Mix 5μL、10μmol/L的引物各2.1μL，10μmol/L的探针0.6μL，20×Core Recation Mix,50×Exo 1μL，模板DNA lμL，最后加入280mmol/L的醋酸镁溶液1.25μL；

(3)反应结束后，阳性样品将会出现明显的S型扩增曲线，而阴性对照样品则无扩增曲线。

实施例6特异性、敏感性、重复性、稳定性试验分析

1.特异性试验

以禽白血病J亚群标准质粒、ALV-A质粒、ALV-B质粒、ALV-C质粒、ALV-K质粒、NDV、IBDV、H9、IB、ILTV病原的核酸为模板，利用建立的禽白血病J亚群荧光RPA方法进行检测，结果只有禽白血病J亚群出现特异性扩增，而对其他病原和阴性对照均无扩增，表明建立的荧光RPA方法具有高度的特异性(图2)。

2.敏感性试验

以已知拷贝数的阳性质粒为模板进行10倍倍比稀释，制备成1copies/μL到10⁷copies/μL的8个稀释度，取每个稀释度的质粒为模板，结果显示RPA检测方法灵敏度良好，检测限值为10copies/μL(图3)。

重复性试验

以10²、10⁴、10⁶copies/μL标准阳性质粒为模板，进行荧光RPA的重复性检测。批内重复：3个模板在一次实验分别设置三个重复孔进行检测；批间重复：3个模板在不同时间同时进行检测，过Ct值计算荧光RPA的变异系数，分析该方法的批间重复性。批内重复性试验变异系数0.59％-3.82％，批间重复性试验变异系数0.64％-4.61％，结果表明该方法重复性良好(图4，表3)。

表3荧光RPA批内实验和批间实验的变异系数

3.稳定性试验

将荧光ERA恒温快速检测试剂放置于-20℃保存0个月、4个月、8个月、12个月、14个月、16个月后取出，观察在整个保存期各组分的性状，并对阳性标准品(1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL)进行检测，结果证明该方法的稳定性达到12个月。

实施例7临床样品检测

1.在临床检验中的应用

在病鸡临床用检验中的应50份疑似ALV感染的病料，分别使用普通PCR方法和本试验建立的荧光RPA方法检测。结果如表所示，本发明的RPA检测比普通PCR多检测出4个阳性样本，四个RPA检测阳性样品的核酸产物经测序分析，得出四个序列均为ALV-J亚群，两种方法的符合率为92％。证明本发明的荧光RPA检测方法敏感性显著提高，可以作为临床检测禽白血病病毒J亚群的有效工具(表4),避免假阴性漏检。

表4普通PCR与荧光RPA检测符合率

*四个RPA检测阳性样品的核酸产物经测序分析，得出四个序列均为ALV-J亚群。

2.在禽用冻干疫苗中的应用

市场随机购买12份不同批次禽用冻干疫苗进行普通PCR检测和本发明的荧光RPA检测，包括鸡新城疫传支二联苗007、152、063、142，鸡新城疫活疫苗145、179，鸡痘活疫苗134、147，鸡传染性法氏囊118、124，鸭瘟活疫苗153、177。9泳道的124批次鸡传染性法氏囊疫苗和10泳道的153批次鸭瘟活疫苗PCR结果为J亚群阳性，其他疫苗检测结果均为阴性。本发明的RPA检测和普通PCR检测方法的检测结果完全一致(图5，图6)。

本发明中所建立的ALV J亚群荧光RPA方法，基于物美价廉的便携式等温荧光仪，可用于疫情现场的ALV J亚群快速检测；荧光RPA检测方法整个反应都在密闭系统内进行，避免了RPA产物造成产生的气溶胶污染。另外，RPA试剂不需要冷链运输，在一定程度上能够耐受临床样品中常见的PCR抑制剂，同时，本发明实时荧光RPA反应迅速，一般情况下能够在15-20min实现对病原的检测，上述特点使得所建立的ALV J荧光RPA方法非常适用于现场快速检测应用。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

山东农业大学

<120> 快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法<140>2020111629775

<141> 2020-10-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttccattttk ctatgaagtc acgcaaytct 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caagccctgt ccccacaaat caagaaaata 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tagatattgt ggattcacca gyaacgagac gtaytatmga gggrac 46

Claims

1.一种快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针，其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示、反向引物序列如SEQ ID No.2所示；探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的快速检测禽白血病毒J亚群的RPA引物和探针，其特征在于，探针序列中荧光报告基团、荧光淬灭基团、四氢呋喃位点的具体位置如下：

TAGATATTGTGGATTCACCAGYAACGAGAC[FAM-DT][THF]G[BJQ1-DT]TAYTATMGAGGGRAC-C3SPACER。

3.如权利要求1或2所述的RPA引物和探针在制备快速检测禽白血病毒J亚群的试剂中的应用。

4.一种快速检测禽白血病毒J亚群的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的RPA引物和探针。

5.根据权利要求4所述的快速检测禽白血病毒J亚群的试剂盒，其特征在于，所述RPA引物和探针的终浓度为10μM。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒在快速检测禽白血病毒J亚群中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述禽白血病毒J亚群选取禽白血病毒J亚群GP85基因。

8.一种快速检测禽白血病毒J亚群GP85基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA作为模板；

(2)针对待测样品特定基因GP85基因设计引物和探针；

9.根据权利要求8所述的快速检测禽白血病毒J亚群GP85基因的检测方法，其特征在于，步骤(3)RPA扩增反应体系为50μL:2×Recation Buffer 25μL加入配套PCR反应管中，再加入1.8mMdNTP Mix 8.2μL、10×Probe Mix 5μL、10μmol/L的引物各2.1μL，10μmol/L的探针0.6μL，20×Core Recation Mix,50×Exo 1μL，模板DNAlμL，最后加入280mmol/L的醋酸镁溶液1.25μL；扩增程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于38℃恒温反应20min。

10.根据权利要求8或9所述的快速检测禽白血病毒J亚群GP85基因的检测方法，其特征在于，所述引物序列为：正向引物序列如SEQ ID No.1所示、反向引物序列如SEQ ID No.2所示；所述探针序列如SEQ ID No.3所示。