CN110938711A - 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。所述引物的序列为：上游引物：5′‑CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA‑3′；下游引物：5′‑CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC‑3′；所述探针的序列为：5′–AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCT‑THF‑TAGACGTTACTACAAGG‑3′。利用本发明的引物和探针的组合，对鸡传染性喉气管病毒实时荧光RAA检测，兼具特异性高、敏感性好以及准确高效的优点。

Description

一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针、 试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由α-疱疹病毒亚科的鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病，虽然ILT死亡率不高但是该病导致鸡的产蛋率下降，畸形蛋率显著增加，严重降低鸡的生产性能，是危害养殖畜禽业重要的传染病之一。

ILT的临床症状及病变特征与低致病性禽流感、新城疫、传染性支气管炎、粘膜型鸡痘等疾病类似，仅通过临床症状和病理变化中非常容易误诊，造成较大的经济损失或者疫情的扩散等，因此快速、敏感、特异性强的检测方法对于该病防控十分重要。目前，国内外已经建立多种ILTV检测方法，但是都有一定的局限性，如：病毒的分离鉴定，耗时长、分离率低；ELSA检测ILTV血清抗体水平存在非特异性反应问题；PCR-琼脂糖电泳法需要带毒染料；环介导等温技术(LAMP)虽然不需要特殊仪器，但是对引物设计要求高，存在反应非特异性的问题。

重组酶介导扩增技术(Recombinase Add Amplification，RAA)是一种新型的等温核酸扩增技术，具有操作更加简单方便、反应更加快速、同时检测多个目标、能更好的与检测平台结合等优点，目前该技术已被广泛应用在人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业等多个领域中，实时荧光RAA方法(real-time fluorescent quantitative RAA，RFQ-RAA)是在RAA方法的基础上添加一个荧光标记的探针，该探针同时含有荧光基团和淬灭基团，二者被中间的四氢呋喃碱基位点(THF)隔开，探针在扩增过程中结合到扩增子上，核酸外切酶通过识别并切割THF位点，使得荧光基团不受淬灭基团的控制，可以被检测出来，随着扩增的继续，荧光信号的增强和扩增产物的累积成正相关，从而使得扩增产物可以被实时监测，整个反应耗时短、结果直观，可用于定性和定量检测，相对于荧光定量PCR技术，具有耗时短、扩增条件要求低、仪器设备要求低以及方便携带和随地检测的特点。

但是，RFQ-RAA检测前，需要设计和选择扩增目的片段单一的引物，再结合引物设计要求选择合适引物，确定引物后，需要对比其序列，从中挑选出最佳探针，探针的设计需要满足长度46-52bp之间，而且荧光基团(例如/i6FAMdT/)和淬灭基团(例如/iBHQ1dT/)只能修饰到T碱基，且荧光基团和淬灭基团的距离为2-4个碱基，中间的2到4个碱基除去一个修饰THF，探针需要自身互补性不超过三个碱基，与上下游引物的最大连续互补不超过4个碱基，探针的5′端最好不是G碱基，因为G碱基本身有淬灭作用，影响探针效果，确认探针后，需要围绕探针周围设计合适的引物并再次筛选引物，以相同浓度模板和不同上下游引物进行筛选，确定引物扩增效率，优选最佳引物和探针才能保证荧光RAA的敏感性，因此，选择到合适的RFQ-RAA检测引物和探针极为困难，且引物和探针的选择直接影响着检测的效率和准确度。

发明内容

针对现有检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的方法存在检测方法复杂、耗时长、特异性差、准确度低以及检测效率低的问题，本发明提供一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3′；

下游引物：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3′；

所述探针的序列为：5′–AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCT-THF-TAGACGTTACTACAAGG-3′。

相对于现有技术，本发明提供的检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，可以特异性的结合到鸡传染性喉气管炎病毒的DNA上，准确检测出鸡传染性喉气管炎病毒，与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒等与鸡传染性喉气管炎病毒相似的病毒无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到10拷贝/μL，为普通PCR灵敏度的1000倍以上，检测准确率为100％，用于实时荧光RAA检测方法中，恒温条件下仅需要20-30min即可完成反应，对反应条件和设备要求低，因此，上述引物和探针的组合，对鸡传染性喉气管病毒实时荧光RAA检测，兼具特异性高、敏感性好以及准确高效的优点，为鸡传染性喉气管炎病毒的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障。

上述探针的设计满足长度在46-52bp之间的要求，且THF的两侧分别存在符合标记荧光基团和淬灭基团T碱基，使荧光基团和淬灭基团的距离满足2-4个碱基的要求，其自身互补性不超过三个碱基，与上下游引物的最大连续互补不超过4个碱基，完全满足实时荧光RAA对探针的要求，保证了进行实时荧光RAA检测的敏感性。

优选的，在所述探针序列中THF的5′端一侧与其相邻的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其相邻的T碱基上标记淬灭基团。

优选的，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，标记上荧光基团和淬灭基团的探针为5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

本发明还提供一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA试剂盒，包含上述引物和探针。

优选的，还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。

本发明还提供上述试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

上述试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于鸡传染性喉气管炎病毒快速检测。

优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

试剂用量

去离子水补足至50μL。

优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37-41℃，20-30min。

优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：40℃，22min。

上述优选的反应条件可进一步提高鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA检测效率。

附图说明

图1是本发明实施例1中引物ILTV-1-F/ILTV-1-R的RAA反应产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，M为marker，N为阴性对照，1为ILTV-1-F/ILTV-1-R的扩增产物；

图2是本发明实施例1中在37℃进行的实时荧光RAA反应过程的荧光信号检测图谱；

图3是本发明实施例1中在38℃进行的实时荧光RAA反应过程的荧光信号检测图谱；

图4是本发明实施例1中在39℃进行的实时荧光RAA反应过程的荧光信号检测图谱；

图5是本发明实施例1中在40℃进行的实时荧光RAA反应过程的荧光信号检测图谱；

图6是本发明实施例1中在41℃进行的实时荧光RAA反应过程的荧光信号检测图谱；

图7是本发明实施例1中对实时荧光RAA方法的特异性检测图谱；其中，1为检测的ILTV，2-5分别为检测的IBV、AIV、NDV和水；

图8是本发明实施例1中实时荧光RAA检测鸡传染性喉气管炎病毒DNA的敏感性的荧光图谱；其中，1为阴性对照，2-7分别代表标准质粒的拷贝数为10⁰拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10²拷贝/μL、10³拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10⁵拷贝/μL；

图9是本发明实施例1中普通PCR扩增检测鸡传染性喉气管炎病毒DNA的敏感性的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，M为marker，9为阴性对照，1-8分别代表标准质粒的拷贝数为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL；

图10是本发明实施例1中实时荧光定量PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒DNA的敏感性的荧光图谱；其中，1为阴性对照，2-8分别代表标准质粒的拷贝数为10⁰拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10²拷贝/μL、10³拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁶拷贝/μL。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

1.1材料与方法

1.1.1试验材料

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)：标准强毒王岗株(AV195)，由中国兽医药品监察所提供；

传染性支气管炎病毒(IBV)：标准毒株(AV1511)，由中国兽医药品监察所提供；

禽流感(AIV)和鸡新城疫病毒(NDV)均为本实验室临床检测后保存；

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司；

RAA核酸扩增试剂盒：购自江苏奇天生物科技有限公司；

TB Green Premix和T-Vector PmdTM20质粒：购买于Takara公司；

引物和探针：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成标记；

Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪：罗氏公司生产；

ABI2720PCR仪器：美国应用生物系统公司生产。

1.1.2试验方法

病毒DNA/RNA的提取：

按照天根病毒DNA/RNA提取试剂盒使用说明书分别提取ILTV的DNA，IBV、NDV、AIV的RNA并且将其反转录成cDNA，将96份疑似ILT临床样品组织病料提取病毒DNA(RNA)以供后续检测。

引物筛选和探针设计：

根据ILTV基因组中保守稳定的TK序列(KC24814.1)，按照RAA引物设计原则设计引物和探针，引物序列如表1所示，通过BLAST比对确定其特异性后，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1筛选的用于RAA反应的引物

用RAA核酸扩增试剂盒对引物的扩增特性进行检测，扩增体系为：荧光基础缓冲液25μL、纯化水17.3μL、上下游引物各(10μM)2.1μL、提取的ILTV的DNA组1μL、最后加2.5μL的乙酸镁，39℃反应30min，反应产物纯化后，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测RAA反应产物，得到的琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示，表明设计的引物能扩增出单一目的条带；

同时，ILTV-1-F/ILTV-1-R引物完全满足设计要求(引物长度要求为30-35bp，扩增产物最好100bp-200bp之间，引物G和C的含量为30％-70％之间，5′避免重复出现G，最好为C和T，3′最好有G和C，不会出现引物二聚体)，且扩增的到的目的片段大小符合要求，同时ILTV-1-F/ILTV-1-R引物的最大连续互补性与其它三对引物相比最低，故确定ILTV-1-F/ILTV-1-R引物作为实时荧光RAA引物。

在ILTV-1-F和ILTV-1-R之间的序列上设计探针并进行标记，设计得到探针：5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

实时荧光RAA检测：

以上述96份疑似ILT临床样品组织病料提取的病毒DNA(RNA)为模板，进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

配制反应体系：

试剂用量

去离子水补足至50μL。

混合后将反应体系移至8联排反应管，其中醋酸镁在反应开始前再加入，将8联排反应管放入实时荧光定量PCR仪器中；

反应温度和时间筛选：分别设置反应温度为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，反应时间设置为30min，根据增效率(荧光值)确定最佳反应时间，筛选结果如图2-6所示，在反应时间一致情况下，40℃检测到荧光信号最强，因此确定反应温度为40℃，在40℃条件下反应时间为22min扩增效率最高(荧光值为0.4)，因此，最优反应条件选择40℃，22min。

1.2方法考察

1.2.1特异性试验

以ILTV的DNA，IBV、NBV、AIV的cDNA为模板，以水为阴性对照，按照上述实时荧光RAA反应体系和条件进行反应。

结果显示只有以ILTV的DNA为模板时有荧光扩增曲线，其它病毒核酸和阴性对照都没有荧光曲线，表明建立的实时荧光RAA法能对ILTV进行特异性检测，与NDV、AIV、IBV病毒核酸无交叉反应，特异性强，检测结果如图7所示。

1.2.2敏感性测试

标准质粒构建：将ILTV-1-F/ILTV-1-R引物修改(按照普通PCR反应要求)长度，得到序列为ILTV-F：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCAT-3′，ILTV-R：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAAC-3′的引物，以ILTV的DNA为模板，进行PCR扩增反应，设置PCR反应条件为：94℃5min；94℃变性45s；56℃退火45s；72℃延伸60s，35个循环扩增；72℃延伸10min，4℃保存。将反应后的目的产物胶回收并纯化，并且将目的片段连接到pMD20质粒，通过蓝白斑试验筛选出标准质粒后，根据摩尔定律计算单位体积质粒所含DNA拷贝数；

质粒拷贝数(拷贝/L)＝[质粒浓度(g/μL)×6.02×10²³]/[总片段长度(bp)×660g/mol]；

总片段长＝载体长度(bp)+片段长度(bp)。

检测实时荧光RAA敏感性：将构建的标准质粒分别稀释为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL，作为模板，按照上述实时荧光RAA反应体系和条件进行反应，并设置阴性对照，观察其最低检测限度。检测结果如图8所示，其最低检测限浓度为10拷贝/μL；

检测普通PCR敏感性：25μL体系：2×Gflex PCR Buffer(Mg2+,dNTP plus)12.5μL，水10μL，ILTV-F(10μM)0.5μL，ILTV-R(10μM)0.5μL，Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/μL)0.5μL，模板1μL(10⁰-10⁷拷贝/μL的标准质粒)，反应程序按照：94℃1min，98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环后68℃延伸5min，并设置阴性对照，观察其最低检测限度。检测结果如图9所示，其最低检测限浓度为10⁴拷贝/μL；

检测荧光定量PCR敏感性：25μL体系：TB Green Premix DimerEraser(2X)12μL，ILTV-F(10μM)0.75μL，ILTV-R(10μM)0.75μL，模板2μL(10⁰-10⁷的标准质粒)，探针(10μM)0.5μL其余用水补齐，反应程序为：95℃30s，95℃5s，55℃30s，72℃30s，40个循环，并设置阴性对照，观察其最低检测限度。检测结果如图10所示，其最低检测限度为10拷贝/μL.。

说明荧光RAA敏感性较强，与荧光定量PCR的敏感性接近。

1.2.3准确度测试

以提取的96份疑似ILTV感染的待检测临床样品DNA为模板，利用实时荧光RAA检测对待测样品进行检测，同时进行实时实时荧光定量PCR检测。其中用实时荧光RAA检测阳性结果为46份，阴性结果50份，实时荧光定量PCR检测阳性结果也为46份，阴性结果50份。说明实时荧光RAA方法与实时荧光定量PCR符合率达到了100％，可以用于临床检测ILT。

实施例2

一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3′；

下游引物：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3′；

所述探针的序列为：5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

试剂用量

去离子水补足至50μL；

扩增条件为：40℃，22min。

利用上述试剂盒对94份待测疑似ILTV感染的待检测临床样品进行检测，以提取的待检测临床样品的DNA为模板，设置一个阴性对照和一个鸡传染性喉气管病毒阳性对照(实施例1中的标准质粒)，按照本实施例中试剂盒的使用方法进行实时荧光RAA检测。经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度与扩增反应时间成正比，94份待测样品中，阳性结果为32份，阴性结果62份；用实时荧光定量PCR对94份待测样品进行检测，检测结果与时荧光RAA检测完全相同。

实施例3

一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3′；

下游引物：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3′；

所述探针的序列为：5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂、鸡传染性喉气管病毒阳性对照基因和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

试剂用量

去离子水补足至50μL；

扩增条件为：37℃，30min。

利用上述试剂盒对实施例2中的94份待测样品进行检测，以待测样品的DNA为模板，设置一个阴性对照和一个鸡传染性喉气管病毒阳性对照(实施例1中的标准质粒)，按照本实施例中试剂盒的使用方法进行实时荧光RAA检测。经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度与扩增反应时间成正比，94份待测样品中，阳性结果为32份，阴性结果62份。

实施例4

一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3′；

下游引物：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3′；

所述探针的序列为：5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

试剂用量

RAA干粉试剂 2.5m g

荧光基础缓冲液 25μL

10μM的上游引物 2.1μL

10μM的下游引物 2.1μL

10μM的探针 0.6μL

模板 100ng

280mM的醋酸镁 2.5μL

去离子水补足至50μL；

扩增条件为：41℃，20min。

利用上述试剂盒对实施例2中的94份待测样品进行检测，以待测样品的DNA为模板，设置一个阴性对照和一个鸡传染性喉气管病毒阳性对照(实施例1中的标准质粒)，按照本实施例中试剂盒的使用方法进行实时荧光RAA检测。经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度与扩增反应时间成正比，94份待测样品中，阳性结果为32份，阴性结果62份。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使

用方法

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成（ILTV-3-F）

<400> 1

cagtatctgg catcgcctca tttctttcta 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成（ILTV-3-R）

<400> 2

ctcatcacta tcctcctcaa cctcctcctc 30

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成（探针）

<400> 3

agttcccccg gccggaactc ctccacgacc cttagacgtt actacaagg 49

<210> 4

<211> 2622

<212> DNA

<213> ILTV基因组中的TK序列（KC24814.1）

<400> 4

atggctagct tgaaaatgct gatctgcgtg tgcgtggcaa tcctgatccc atctacccta 60

tctcaagatt cacacggaat tgctggaata atagaccctc atgatacagc cagcatggat 120

gctggaaaaa tctctttctc cgaagccatg gggtcggggg caccgaaaga accccagatt 180

agaaacagaa tttttgcgtg ctcatctcca actggcgcca gtgttgcgag gcttgcccag 240

ccacgacatt gtcaccgaca tgccgattcg actaacatga ctgaaggaat tgccgtagtc 300

ttcaagcaaa acattgcccc gtacgtcttt aatgtgactc tatactataa acatataacc 360

acagttacta cgtgggcact attctcaaga ccccaaataa caaatgagta cgtgaccagg 420

gttccaatag actatcatga aattgtcagg attgatcgat cgggagaatg ctcatccaaa 480

gcaacgtatc ataaaaattt catgtttttt gaagcttacg acaatgatga agcagaaaaa 540

aaattgcccc tggttccatc actgttaaga tcaactgtct ccaaggcgtt tcatacaact 600

aactttacta agcgacatca aaccctggga taccgaacgt ctacatcggt cgactgtgtt 660

gtggaatatc tacaggctag atctgtatac ccgtatgatt actttggaat ggcgacaggt 720

gatacagtag aaatttctcc tttttatacc aaaaacacga ccggaccaag gcgtcacagt 780

gtctacagag actatagatt tctcgaaatc gcaaattatc aagtcaggga tttggaaacc 840

ggacaaataa gaccccctaa aaaaagaaac tttctaacag atgaacaatt cactataggc 900

tgggatgcaa tggaagaaaa ggaatctgta tgtactctca gtaaatggat tgaagtcccg 960

gaagcagttc gtgtttcgta caaaaacagt taccactttt cacttaaaga tatgactatg 1020

acgttctcgt ccggaaaaca accttttaac atcagcaggc ttcatttggc tgaatgcgtt 1080

cctaccatag cctcggaggc catagatggc atctttgcca gaaagtatag ttcgactcat 1140

gtccgttctg gggacatcga atactatctc ggtagtggcg gatttctgat cgcatttcag 1200

aaactcatga gccatggctt ggctgaaatg tacctagaag aggcacaaag acaaaatcat 1260

ctcccgagag ggagagagcg tcgccaagcc gcaggtcgcc gcacggcgtc gctgcagtct 1320

ggacctcagg gtgatagaat tactacccac agttctgcaa catttgccat gttacaattt 1380

gcatacgaca aaatccaagc ccatgttaac gagcttatcg gaaatttgtt ggaagcgtgg 1440

tgtgagcttc agaaccgcca actgattgta tggcacgaga tgaagaaact aaacccgaac 1500

tcactgatga catctttgtt cggacaacct gtaagcgcca ggctattggg agacatcgta 1560

gcggtatcaa aatgtataga aattccaatc gaaaatatta ggatgcagga ttccatgcgc 1620

gtgccagggg acccaaccat gtgctatacc agaccagtac ttattttcag gtattcgtcc 1680

tcccctgagt cacagttttc tgcgaactca acagaaaacc acaatcttga catattaggc 1740

caactcggag aacataatga aattttacaa gggcggaatt tgatagaacc atgcatgatc 1800

aatcacagac ggtactttct gttgggagaa aactaccttc tttacgaaga ctatacattt 1860

gttagacaag taaatgcttc cgagatcgaa gaagtgagca cattcatcaa cttggacgcc 1920

actatactag aagatttgga ctttgtgccc gtcgaagtat acactcgcga ggaactcagg 1980

gatactggga ctttaaacta tgatgatgtg gtcagatatc aaaatattta taacaaaagg 2040

ttcagagaca ttgacactgt aatacgtgga gataggggag atgcaatctt tagagcaata 2100

gcagattttt ttggcaacac tcttggagaa gtaggaaagg cattgggaac tgtagtgatg 2160

acagccgcgg cagcagtaat ttctacagta tctggcatcg cctcatttct ttctaacccg 2220

ttcgccgcac tcggaattgg gatagcggtg gtggtgagca ttattttagg actgctggcg 2280

ttcaaatatg taatgaacct gaaatcaaac ccagttcagg ttctgttccc aggcgcagtt 2340

cccccggccg gaactcctcc acgaccctct agacgttact acaaggatga ggaggaggtt 2400

gaggaggata gtgatgagga cgacaggata cttgccacca gagttctgaa aggccttgag 2460

cttctacaca aggatgaaca gaaagctcga agacagaaag cgcggttttc tgcttttgct 2520

aaaaatatga gaaacctatt tcgcagaaaa ccccgaacca aggaagatga ctaccccctg 2580

ctcgaatacc cttcgtgggc agaagaaagc gaagacgaat aa 2622

Claims (9)

1.一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：

上游引物：5′-CAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTA-3′；

下游引物：5′-CTCATCACTATCCTCCTCAACCTCCTCCTC-3′；

所述探针的序列为：5′–AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCT-THF-TAGACGTTACTACAAGG-3′。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：在所述探针序列中THF的5′端一侧与其相邻的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其相邻的T碱基上标记淬灭基团。

3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，标记上荧光基团和淬灭基团的探针为5′-AGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCC/i6FAMdT/-THF-/iBHQ1dT/AGACGTTACTACAAGG-3′。

4.一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光RAA试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。

6.权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

7.如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

试剂用量

去离子水补足至50μL。

8.如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37-41℃，20-30min。

9.如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：40℃，22min。

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