CN102002533A

CN102002533A - 同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102002533A
Application number: CN 201010181619
Authority: CN
Inventors: 张伟; 凌宗帅; 李贵玲; 徐怀英; 王友令; 任素芳; 朱小玲; 李明辉; 安静
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2011-04-06

Abstract

本发明是借助分子生物学技术(RT)PCR方法，得到新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，PCR技术扩增出产蛋下降综合征(Egg drop syndrome，EDS)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis，ILT)4种病毒基因的各一段保守序列作为探针，选用纤维素膜作为基质(即检测试剂盒中最为重要的基础平台)从病料中提取目的病原核酸，并在(RT)PCR时加入标记bio-16-dUTP，获得的标记的PCR产物。将标记后的产物放置检测试剂盒进行杂交检测，通过观察杂交颜色的变化来实现对生物样品的快速、高效判断及分析。

Description

同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，尤其涉及采用(RT)PCR扩增标记技术、分子杂交技术、酶联显色技术的基础上，发展的多病原、同步检测技术的同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，在养禽业迅猛发展的同时，混合感染、交叉感染使禽的病毒病更加复杂多变，诊断难度不断增加。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、产蛋下降综合征(Eggdrop syndrome，EDS)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis，ILT)是危害禽类产蛋下降的主要疾病，对养殖户造成了巨大的经济损失，对人民的食品安全也带来了重大的威胁。

其中对于4种病毒特性如下：

(1)新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的一个种，属ssRNA病毒。该病毒主要危害鸡、火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降。

(2)传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属的病毒，其基因组为不分节段的正链单股RNA，所引起的是鸡的一种急性、高度接触性的呼吸道疾病。以咳嗽，喷嚏，雏鸡流鼻液，产蛋鸡产蛋量减少，呼吸道粘膜呈浆液性、卡他性炎症为特征。

(3)鸡减蛋综合征(Egg Drop Syndrome-1976，EDS-76)是一种由腺病毒引起的病毒性传染病，EDS-76的病原是腺病毒属无囊膜的双股DNA病毒，其主要特徵是产蛋量骤然下降，蛋壳异常，蛋体畸形，蛋质低劣。

(4)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis，ILT)是疱疹病毒科属线性双股DNA病毒，可引起的鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。本病对养鸡业危害较大，主要危害育成鸡及产蛋鸡，发病传播快，对易感鸡群的发病率可达90％以上。

现有检测方法，多是分别逐一检测，检测操作手续繁琐，不容易稳定控制检测条件，准确性较差；也曾有类似同时检测多个病原的报道，但仅限于方法研究阶段，而且精密度和灵敏度不高，目前，还没有可以同时检测上述4种病原的试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，本发明还提供了建立一种可同时检测4种病原高效快速、准确性高、价格低廉的检测方法，

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一、同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，该检测试剂盒可同时检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、产蛋下降综合征(EDS)、传染性喉气管炎病毒(ILT)四种病毒。

同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，所述试剂盒为50头份检测剂量，试剂盒包括：

(1)4种标准病毒探针的混合纤维素酯膜小盒；

(2)操作过程中所用到的试剂：

上述检测用组分的具体配方如下：

A预杂交液 B杂交液

预杂交液(4mL量) 杂交液(4mL量)

甲酰胺 2.0 1.8

20×SSC 1.0 1.0

50×Denhartd’s 0.4 80ul

小牛胸腺DNA 0.2 80ul

1MPBSpH7.4 0.2 80ul

100mM EDTA 0.2

20％硫酸葡聚糖钠 1.0

C1洗涤液1

1：20×SSC 20ml

2：10％SDS 2ml

3：加ddH₂O定容至200ml

C2洗涤液2

1：20×SSC 1ml

2：10％SDS 2ml

3：加ddH₂O定容至200ml

注：20×SSC和10％SDS配制见附录G

D洗涤/缓冲液的配制

(规范性附录)

Tris 6.05g

NaCl 29g

MgCl₂ 95mg

Tritonx-100 0.25ml

ddH₂O 400ml

HCl调pH＝7.5 用ddH₂O定容500ml

附录E底物显色液的配制

(规范性附录)

1：称取以下物质

Tris 1.21g

NaCl 0.58g

MgCl2 47.5mg

2：加80mlddH2O溶解。

3：用稀盐酸调pH值至9.5

4：用ddH2O定容至100ml。

二、同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒制备方法：

采用(RT)PCR扩增标记技术扩增出探针、样本组织核酸；在分子杂交技术、酶联显色技术的基础上，利用DNA双螺旋的尖碱基互补配对原理，探索一种反向点杂交的检测条件、方法，创建检测试剂盒和检测常见致鸡产蛋下降疫病的分子检测技术平台。

1.取得4种病原探针：首先要选定4种病原最不容易发生变异的高度保守序列，根据GeneBank中对4种病毒已发表的多条全长序列，选取：NDV融合蛋白基因(F基因)、IBV核蛋白基因(N)、EDS76的hexon区域、传染性喉气管炎病毒TK基因的蛋白编码区域；使用DNAStar软件分析每种病毒的高度保守序列，Oligo6.0软件设计合适的探针引物，选用所设计的引物，分别扩增出保守部分片断；采用无毒的SBS荧光染料替代EB，用凝胶电泳检测后纯化，再与PMD18-T载体连接，随后转化进JM109大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，通过PCR扩增、测序，筛选，随后大量制备探针。

同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒所选用的引物如下：

NDV 引物序列：5’-CTT GAC ACC TCA TAC TGT AT-3’PCR扩增长度(bp)625

5’-CCC AAG CCA TAA TAA GGT CTT-3’

IBV 引物序列：5’-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3’PCR扩增长度(bp)600

5’-TGG TCC TCT TCA AGG TG-3’

EDS76引物序列：5’-AAA CGC CAA ACG GCA ATC A-3’PCR扩增长度(bp)485

5’-GGA ACT GTG CGA GCG AAG AA-3’

ILT 引物序列：5’-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3’PCR扩增长度(bp)621

5’-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3’

2.混合纤维素酯膜小盒的制备：将得到的核酸探针进行纯化，并用核酸定量分析仪将点样前核酸的浓度稀释为100ng/μL，然后通过微量点样器，点在混合纤维素酯膜上，80℃烤膜2h，置4℃保存备用。

三、4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒检测方法：

1、样本要求：(样本制备)

1.1、样本种类：待测样本为病(死)鸡的脏器组织匀浆液、体液(组织渗出液、抽取的血液)，口/鼻腔、泄殖腔棉拭子。

1.2、样本采集：脏器组织匀浆液---采用病变明显的肝、脾、肺、气管、肾、脑、肠等器官，用组织剪备成小块后放入匀浆器中，以6000转/分进行组织匀浆，匀浆后放置-20℃冰箱中反复冻溶3次，以便病毒的释放。直接抽取获得体液(组织渗出液、抽取的血液)。口/鼻腔、泄殖腔棉拭子直则接沾取腔粘膜并用pH7.4的磷酸盐缓冲液1∶2制成混悬液。

1.3、样本存贮：已处理完毕的样本放置4℃冰箱中，当天不处理的样品-20℃保存(组织标本，匀浆标本均可)。

1.4、样品运输：泡沫箱加冰封闭运输。

2、检测样品的制备：

2.1、取按样本要求预处理的液体抽提组织核酸，可参照下述组分先在42℃作用1h：ddH2O 11.5μL，10×PCR Buffer 4μL，dNTP(各10mmol/L)2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，M-MLV 0.5μL，4种探针引物(各20pmol/μL)1.5μL。

2.2、病原核酸的标记，使用生物素Bio-16-dUTP对扩增产物进行标记，反应体系可参照：ddH2O 6μL，10×PCR Buffer 3μL，Mg2+(25mmol/L)4μL，dNTP(各2.5mmol/L)2.5μL，Bio-11-dUTP 8μL，Taq enzyme(5U/μL)0.5μL，4种探针引物(各10pmol/μL)3μL，模板2μL；其中PCR扩增程序：95℃2min，94.5℃30s，55℃40s，72℃1min，30个循环，72℃10min。

3、置于检测试剂盒中进行杂交反应，根据显色变化判断疾病，具体方法可参照：

3.1、预杂交：取450μL预杂交液加入混合纤维素酯膜小盒内，42℃预杂交40min。

3.2、杂交：取20μL PCR产物于1.5mL的离心内，100℃10min，-20℃冷却5min，加入杂交液450μL，振荡离心。然后将含有PCR产物的杂交液加入杂交仪的杂交槽内，42℃杂交1h。

3.3、洗涤：分别用2×SSC，0.1×SDS；0.1×SSC，0.1×SDS各500μL洗膜三次。

3.4、封闭：400μL 3％BSA，42℃封闭30min。

3.5、酶联：450μL缓冲液中加1.6μL AV-AP42℃酶联20min。

3.6、显色：先用洗涤液洗膜400μL三次，然后加入显色液(450μL底物液加BCIP和NBT各1.6μL)，常温或42℃显色5-8min。

3.7、终止显色：倒掉显色液，用水冲洗，以出现蓝紫色显色点为阳性，既有该病原的存在。

本检测方法是在现有的探针反相杂交技术的基础上，根据分子碱基互补配对的原则和酶联显色技术制备而成。在变性后的复性的杂交过程，由于遵守碱基互补配对法则，所以准确性是确定的。选用生物素Biotin-16-dUTP掺入标记，在对待检样品核酸进行反转录或PCR过程中，带有标记物的dUTP或者dCTP，部分替代了核酸合成链中的不带标记物的dCTP或dTTP，从而实现了靶片断的标记。而在杂交时采用NBT/BCIP化学显色法：四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium)(为深蓝色无定形微溶物质)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)，当二者存在时，在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)作用下，NBT被还原形成可见的蓝色或紫色沉淀。

检测方法中4种病毒探针片段具有在PCR扩增时具有高度保守、不干扰保真性。必需具有相似的解链温度，这样才能保证杂交条件的一致性；使正确配对的序列不被遗漏，并使杂交错配降到最低；杂交反应条件及洗涤条件的要求，设计一段寡核苷酸片段长度在100bp～1000bp之间。

本发明的有益效果是：

1、可对常见鸡产蛋下降疾病NDV、IBV、EDS-76、ILT做出迅速、准确、并行的鉴别，其灵敏度远远高于(RT)PCR和病毒分离，为(RT)PCR的100倍，同时由于探针筛选技术，降低了假阳性率，增加了检验结果的准确性。灵敏度：试验结果灵敏度高于(RT)PCR和病毒分离，分别为(RT)PCR和病毒分离的100倍和10000倍。特异性：由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，特异性结果必然遵循碱基互补配对规律。动物试验及临床检测结果：与病毒分离、HI试验、Elisa、PCR试验的结果符合率在95％以上。

2、一次病毒分离试验所需要的试剂费用约是100-150元，如用(RT)PCR检测一种病原需30-50元，而使用本方法检测4个病原只需50元，这充分体现了此试剂盒的特性，所用检测方法的优点。

具体实施方式

一、4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，所述试剂盒为50头份检测剂量，试剂盒包括：

(1)4种标准病毒探针的混合纤维素酯膜小盒；

(2)操作过程中所用到的试剂：

二、4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒的检测方法

<一>标记核酸

1.病原核酸的提取(使用硫氰酸胍和柠檬酸三钠相结合的方法，仅需4h就可获得高纯度的病毒基因组)

取组织匀浆液400ul，置于1.5mL离心管中，加入600μL TriZol剧烈振荡混匀，15-30℃孵育2-5min；加入450μL氯仿，剧烈振荡15s，-20℃沉淀10min，12000rpm离心10min；取上清移入另一个离心管中，加等体积的异丙醇颠倒混匀，-20℃沉淀0.5h；12000rpm，10min离心弃上清，向核酸沉淀中加入75％的乙醇1mL，12000rpm离心5min；弃上清，将核酸沉淀吹干，接下一步试验。(注：不能完全干燥否则RNA不能溶解)

2.NDV、IBV的反转录过程(参用20ul体系) 单位：ul

RT-PCR用水 11.5

5×Buffer 4

dNTP(10mM) 2

M-MLV 0.5

HPR I 0.5

引物液 1.5

混匀后，溶解上步所提的核酸，42℃水浴锅内反转录1h，反转录产物放冰箱冷却，待用。

3.核酸扩增(参用50ul体系) 单位：ul

RT-PCR用水 24

10×Buffer 6

Mgcl₂ 5

dNTP(2.5mM) 4

Bio-11-dUTP 4

Taq酶 0.5

引物液 5

模板(即反转录产物) 2

进行以下循环参数：(35个循环)

94℃(预变性) 2min

94℃(变性) 30s

55℃(退火) 40s

72℃(延伸) 60s

72℃(终延伸) 9min

<二>杂交显色(检测)过程4.1预杂交：取450μL预杂交液加入脂膜盒内，42℃预杂交40min。

1.杂交：取20μL PCR产物于1.5mL的离心内，100℃10min，-20℃冷却5min，加入杂交液450μL，振荡离心。然后将含有PCR产物的杂交液加入杂交仪的杂交槽内，42℃杂交1h。

2.洗涤分别用2×SSC，0.1×SDS；0.1×SSC，0.1×SDS各500μL洗膜三次。

3.封闭：400μL 3％BSA，42℃封闭30min。

4.酶联：450μL缓冲液中加1.6μL AV-AP42℃酶联20min。

5.显色：先用洗涤液洗膜400μL三次，然后加入显色液(450μL底物液加BCIP 和NBT各1.6μL)，常温或42℃显色5-8min。

6.终止显色：倒掉显色液，用水冲洗，以出现蓝紫色显色点为阳性，既有该病毒的存在。

注意事项：

1.样品处理液有很强的腐蚀性，操作时注意安全。

2.核酸提取步骤中离心后溶液应分三层，只取水相层，不要取到中间蛋白层

3.加75％的冷乙醇后颠倒混匀，不能用振荡器混匀。离心时，离心管放置的方向和前次最好相同，避免RNA丢失。

4.RT-PCR过程中注意不要有气泡，以免影响酶的活性。

5.杂交后洗膜前溶液C1应42℃预热，以便沉淀溶解

6.酶联时加入SV-AP后要注意溶液混匀。

7.配制显色液要先加入BCIP，并混匀后再加NBT，两者顺序不可颠倒，配置完后要尽快放入42℃进行显色。

8.显色完后要尽快用水终止，避免本底颜色太深，如长久保存试剂盒的标本可置于TE中可长期保存颜色不变。

储存条件：试剂盒4℃。

序列表

<110>：东省农业科学院畜牧兽医研究所

-------------------

<120>：同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒及检测方法

--------

<213>：NDV 引物序列

<400>：

cttgacacct catactgtat cccaagccat aataaggtct t 41

<212>：DNA

<211>：41

：NDV 引物序列

--------

<213>：IBV 引物序列

<400>：

cataactaac ataagggcaa tggtcctctt caaggtg 37

<212>：DNA

<211>：37

：IBV 引物序列

--------

<213>：EDS76 引物序列

<400>：

aaacgccaaa cggcaatcag gaactgtgcg agcgaagaa 39

<212>：DNA

<211>：39

：EDS76引物序列

--------

<213>：ILT 引物序列

<400>：

acgatgactc cgactttccg ttggaggtag gtggta 36

<212>：DNA

<211>：36

：ILT 引物序列

Claims

1.同时可检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒可同时检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、产蛋下降综合征(EDS)、传染性喉气管炎病毒(ILT)4种病毒。

2.根据权利要求1所述同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病的检测试剂盒，其特征：引物如下

NDV 引物序列：5’-CTT GACACC TCA TAC TGT AT-3’PCR扩增长度(bp)625

5’-CCC AAG CCA TAA TAA GGT CTT-3’

IBV 引物序列：5’-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3’PCR扩增长度(bp)600

5’-TGG TCC TCT TCA AGG TG-3’

EDS76引物序列：5’-AAA CGC CAA ACG GCA ATC A-3’PCR扩增长度(bp)485

5’-GGA ACT GTG CGA GCG AAG AA-3’

ILT 引物序列：5’-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3’PCR扩增长度(bp)621

5’-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3’

3.根据权利要求1所述的同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为50头份检测剂量，试剂盒包括：

(1)4种标准病毒探针的混合纤维素酯膜小盒；

(2)检测操作过程中所用到的试剂：标记用组分和检测用组分。

4.根据权利要求3所述的同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒，其特征在于：所述的标记用组分包括：buffer、dNTP、Mgcl ₂、HPR I、M-MLV、Bio-16-dUTP、Taq酶、4种引物；所述的检测用组分包括：SV-AP、BCIP、NBT、预杂交液、杂交液、洗涤液、缓冲液和显色液。

5.同时检测4种常见致鸡产蛋下降疫病检测试剂盒的检测方法，其特征在于：

(1)检测样品的制备：

①取按样本要求预处理的液体抽提组织核酸，可参照下述组分先在42℃作用1h：ddH2O 11.5μL，10×PCR Buffer 4μL，dNTP(各10mmol/L)2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，M-MLV 0.5μL，4种探针引物(各20pmol/μL)1.5μL；

②病原核酸的标记，使用生物素Bio-16-dUTP对扩增产物进行标记，反应体系可参照：ddH2O 6μL，10×PCR Buffer 3μL，Mg2+(25mmo l/L)4μL，dNTP(各2.5mmol/L)2.5μL，Bi o-11-dUTP 8μL，Taq enzyme(5U/μL)0.5μL，4种探针引物(各10pmo l/μL)3μL，模板2μL；

其中PCR扩增程序：95℃2mi n，94.5℃30s，55℃40s，72℃1min，30个循环，72℃10min；

(2)置于检测试剂盒中进行杂交反应，根据显色变化判断疾病，以出现蓝紫色显色点为阳性，既有该病原的存在。