CN108486279A - 一种基于荧光定量pcr技术检测鸽新城疫病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法。本发明所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，利用荧光定量PCR技术对鸽NDV VI型进行特异性检测，而鸡新城疫强毒株和经典的LaSota疫苗毒株检测结果为阴性，为鸽NDV的临床检测提供了一种快速、准确、高通量的方法。

Description

一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒VI型的方法。
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的一种高度接触性、急性败血性传染病，其宿主范围非常广泛，可以感染鸡、鸽、鹅、鹌鹑等多种禽类，是影响养禽业发展最重要的疫病之一。NDV的基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，其可编码基质蛋白、融合蛋白等6种结构蛋白。研究表明，F蛋白在NDV致病过程中具有重要作用，其中，根据F蛋白裂解区域112-117位氨基酸序列差异将NDV分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。根据F基因47-420位核苷酸的遗传进化分析，发现鸽NDV区别于其他基因型的NDV，单独处于一个分支，并将其归为基因VIb亚型。因此，鸽新城疫病毒被认为是鸡源NDV的一种变异株，但与经典的鸡源NDV相比，其在致病性上存在很大差异，它只引起鸽子发病，而对鸡的致病力非常温和。
虽然当前养鸡场新城疫得到了有效预防控制，但由于缺乏防控鸽新城疫的专用疫苗，鸽新城疫仍在一些养鸽场爆发流行，给养鸽业造成了较大的经济损失。因此，能否及时、准确、快速进行确诊，对于鸽新城疫的有效控制具有重大意义。当前新城疫的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验等经典方法和RT-PCR等分子诊断技术。但经典的检测方法则需耗费较长时间，易耽误临床诊断；更重要的是，经典的检测方法虽然能检测出NDV，但较难区分出鸡源NDV和鸽源NDV，这对于新城疫的诊断及预防都会造成一定的影响。
荧光定量PCR技术(realtimefluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。RT-PCR检测技术具有特异性好、灵敏度高、高通量等优点，荧光定量PCR在RT-PCR基础上通过荧光染料及探针具有更高的灵敏性和特异性，并对扩增过程进行实时监测，可直接对病料组织进行快速、准确诊断。本发明研究了基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，为实际生产中尽早防控鸽新城疫病症提供一种新的技术手段。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，所述方法能更为准确的鉴定出鸽新城疫病毒。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；
(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；
(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；
(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。
所述步骤(1)中，所述用于进行荧光定量扩增的引物包括：
上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；
下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。
所述步骤(1)中，所述荧光探针(probe)的序列为：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。
所述步骤(1)中，所述提取病毒总RNA的步骤包括：取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mL Trizol，使其充分混匀后静置，并加入0.2mL氯仿，振荡后室温静置，离心取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，室温静置闭关离心弃上清，向沉淀中加入1mL 70％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，离心并室温干燥，并加入14μL DEPC水RNA充分溶解，即得。
所述步骤(1)中，所述反转录步骤中，所述反转录体系包括：dNTPs 2.5mM、反转录酶M-MLV、5×反转录酶缓冲液，以及RNA抑制剂。
所述步骤(2)中，所述扩增NDV F基因步骤中，所用引物包括：
上游引物(pF3)：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；
下游引物(pR1)：5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。
所述步骤(3)中，所述RT-PCR反应体系包括：
2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL；
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl；
Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl；
模板2μL(50ng)；
Probe 0.3uL；
正链引物0.4μL；
负链引物0.4μL；
补加ddH2O至20μL。
所述步骤(3)中，所述荧光PCR测定步骤中，循环参数为：经95℃10s、60℃15s、95℃20s共40个循环分析熔解曲线。
所述步骤(3)中，所述PCR扩增反应的退火温度为58℃。
本发明还公开了所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法在鸽新城疫病毒检测领域中的应用。
本发明所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，利用荧光定量PCR技术对鸽NDV VI型进行特异性检测，而鸡新城疫强毒株和经典的La Sota疫苗毒株检测结果为阴性，可有效避免其他新城疫病毒的影响，为鸽NDV的临床检测提供了一种快速、准确、高通量的方法。
本发明所述方法的检测极限达0.1EID50鸽新城疫病毒，比传统RT-PCR方法提高100倍，可一步完成荧光定量PCR检测，可大大提高检测速度和检测周期。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是鸽新城疫病毒F基因的PCR扩增结果；其中M泳道为DNA marker DL 2000、第1泳道为F基因；
图2是pMD18T-F质粒标准曲线建立结果；
图3是是荧光定量PCR特异性检测结果，其中1泳道为鸡NDV强毒CN1204，2泳道为鸡NDV弱毒LaSota，3泳道为鸡NDV强毒I系毒，4泳道为鸽NDV YCE3株，5泳道为鸽NDV CQE3株，6泳道为鸽NDV LCE4株，7泳道为阴性对照；
图4为RT-PCR特异性检测结果，其中M泳道为DNA marker DL 2000，第1泳道为鸡NDV强毒CN1204，第2泳道为鸡NDV弱毒LaSota，第3泳道为鸡NDV强毒I系毒，第4泳道为鸽NDVYCE3株，第5泳道为鸽NDV CQE3株，第6泳道为鸽NDV LCE4株，第7泳道为阴性对照；
图5是荧光定量PCR敏感性检测结果，其中，1为104EID50/0.1mL，2为103EID50/0.1mL，3为102EID50/0.1mL，4为101EID50/0.1mL，5为100EID50/0.1mL，6为10-1EID50/0.1mL，7为阴性对照；
图6是RT-PCR敏感性检测结果，其中，1为105EID50/0.1mL，2为104EID50/0.1mL，3为103EID50/0.1mL，4为102EID50/0.1mL，5为101EID50/0.1mL，6为100EID50/0.1mL，7为10-1EID50/0.1mL，8为10-2EID50/0.1mL，9为阴性对照；
图7临床样品的荧光定量PCR检测结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中涉及的试剂及材料包括：
鸽新城疫病毒CQE3株、宿主菌DH5α由山东省禽病诊断与免疫重点实验室保存；
无特定病原(SPF)鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所提供；
pMD18-T vector购自宝生物工程(大连)有限公司；
限制性内切酶，T4DNA Polyermase，T4DNA Ligase，dNTP，和ExTaqTM均购自宝生物工程(大连)有限公司；
质粒小提试剂盒和UniQ-10柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司。
实施例1引物设计
根据分离的鸽新城疫病毒CQE3株，使用Primer Primier5软件设计1对引物和1条探针，具体包括：
上游引物(pF1)序列为：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；
下游引物(pR1)序列为5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'；
荧光探针(probe)序列为：
5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。
上述引物和探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成，用DEPC处理水稀释到20μmol/L，引物pF1和pR1用于荧光定量扩增，目的片断长82bp。
实施例2鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录
采用Trizol试剂法提取病毒总RNA，取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mLTrizol，使其充分混匀后静置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2-3min，随后12,000×g离心(4℃)15min，吸取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，室温静置10min，12,000×g离心(4℃)15min，弃上清，并向沉淀中加入1mL 70％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，7,500×g离心(4℃)5min，室温干燥10min，加入14μL DEPC水RNA充分溶解备用。
加入1μL随机引物primer 9，75℃作用5min，并冰浴2min。然后按照现有技术方案配制反转录体系15μL，其中包括dNTPs(2.5mM)，反转录酶(M-MLV)，5×反转录酶缓冲液，RNA抑制剂混合。将其全部加入引物与RNA的混合液中，42℃作用1h，95℃、5min或75℃、15min使反转录酶失活。
实施例3pMD18T-F质粒构建
设计如下引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因：
上游引物(pF3)序列为：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；
下游引物(pR1)序列为5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。
目的片段长为1687bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。按照常规方法将PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞中。PCR鉴定阳性质粒可获得1687bp目的片段，将阳性克隆送样测序，PCR结果见图1所示。
实施例4荧光定量PCR反应条件
以构建的质粒pMD18T-F为模板，采用一步法RT-PCR反应体系。
20μl反应体系组成如下：2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl，Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl，模板2μL(50ng)，Probe 0.3uL，正链引物和负链引物各0.4μL，补加ddH2O至20μL。
加样于96孔PCR反应板，在ABI7900型荧光PCR测定仪中进行。循环参数为：经95℃、10s，60℃、15s，95℃、20s共40个循环分析熔解曲线。
实施例5PCR反应条件的优化
按照实施例4中PCR反应操作进行PCR反应，以10μL的反应体系，分别设置退火温度梯度为56.0℃，57.0℃，58.0℃，59.0℃，60.0℃，在梯度PCR仪上进行PCR反应。分析熔解曲线及Ct值选择特异性强、Ct值最小的58.0℃作为最佳退火温度。
随后在58℃作为PCR扩增退火温度，进行引物浓度的优化，保持反应体系其他各项不变，调整引物终浓度为0.1-0.8uM，选取得到平均最低CT值时的引物浓度为0.4umol/L，探针为0.2umol/L作为引物终浓度。
实施例6标准曲线建立
以构建的pMD18T-F质粒为阳性标准品，测定质粒的浓度90ng/uL，根据公式计算出拷贝数为1.86×1010个。
将质粒进行10倍梯度稀释后选择109、108、107、106、105、104、103copies/mL的稀释度作为模板，同时每个稀释度设定3个重复，使用引物pF1、pR1进行荧光定量PCR扩增。绘制标准曲线见图2所示，其循环阈值(Ct值)与质粒拷贝数(copies)在稀释范围内呈现良好的线性关系，r2值均大于0.9。确定Ct值33作为临界值，能够检测出的基因拷贝数为1.86×103个。
实施例7特异性试验
分别提取鸡NDV强毒CN1204、鸡NDV弱毒Lasota、鸡NDV强毒I系毒、鸽NDV YCE3株、鸽NDV CQE3株、鸽NDV LCE4株总RNA(各50ng)进行荧光定量PCR检测，同时设定空白对照。
其中20μl反应体系组成如下：2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex TaqHS(5U/μl)0.4μl，Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl，模板2μL(50ng)，Probe 0.3uL，正链引物和负链引物各0.4μL，补加ddH2O至20μL。
加样于96孔PCR反应板，在ABI7900型荧光PCR测定仪中进行。循环参数为：经95℃、10s，60℃、15s，95℃、20s共40个循环，结果分离的鸽源新城疫为阳性，鸡源新城疫强、弱毒均阴性，空白对照为阴性。荧光定量PCR及RT-PCR特异性检测结果分别见图3、图4所示。
实施例8敏感性试验
取新鲜的鸽NDV鸡胚尿囊液，用ddH2O以1：10系列稀释，取100μl提取RNA分别进行荧光定量PCR及RT-PCR试验，每个稀释度做4个重复，荧光定量PCR及RT-PCR敏感性检测结果分别见图5和图6所示。结果探针检测质粒拷贝数与Ct值具有良好的线性关系和扩增效率，而且荧光定量PCR检测敏感性较RT-PCR高100倍。
实施例9重复性试验
选取3个不同浓度的标准品为模板，在一次PCR反应中，进行多管同时PCR扩增，配置2％琼脂糖凝胶，电泳加样时尽量使每孔的加样量保持一致，计算变异系数在0.1-3％之间，对该方法的重复性进行检验，本发明方法重复性较好。
实施例10临床样品检测
选取206份临床采集样品，各取5g待检的鸭肉和鸡肉组织，捣碎，加10ml PBS(0.01mol/L pH7.2)，以5000g离心20min，吸取上清。取一部分(200μl)按照实施例1-3进行提取RNA及实时荧光RT-PCR检测。另一部按照现有技术方法分用于病毒分离，加入青链霉素各100IU(μg)于4℃作用2h后，按0.2ml/枚接种10日龄SPF鸡胚，每个样品接种3个SPF鸡胚，观察96h，记录鸡胚死亡情况，并收集死胚或活胚尿囊液，进行HA测定，部分检测结果见图7。
将病毒分离鉴定结果与荧光定量PCR法的检测结果相比较比，结果发现，206份样品中共同阳性数为137份，共同阴性数为69份，总符合率为100％。因此，本发明方法可有效用于鸽新城疫病毒的检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；
(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；
(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；
(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。
2.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述用于进行荧光定量扩增的引物包括：
上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；
下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。
3.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述荧光探针(probe)的序列为：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。
4.根据权利要求1-3任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述提取病毒总RNA的步骤包括：取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mL Trizol，使其充分混匀后静置，并加入0.2mL氯仿，振荡后室温静置，离心取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，室温静置闭关离心弃上清，向沉淀中加入1mL 70％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，离心并室温干燥，并加入14μL DEPC水RNA充分溶解，即得。
5.根据权利要求4所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反转录步骤中，所述反转录体系包括：dNTPs 2.5mM、反转录酶M-MLV、5×反转录酶缓冲液，以及RNA抑制剂。
6.根据权利要求1-3任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述扩增NDV F基因步骤中，所用引物包括：
上游引物(pF3)：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；
下游引物(pR1)：5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。
7.根据权利要求1-6任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述RT-PCR反应体系包括：
2×OneStep RT-PCR BufferⅢ10μL；
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl；
Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μl；
模板2μL(50ng)；
Probe 0.3uL；
正链引物0.4μL；
负链引物0.4μL；
补加ddH2O至20μL。
8.根据权利要求7所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述荧光PCR测定步骤中，循环参数为：经95℃10s、60℃15s、95℃20s共40个循环分析熔解曲线。
9.根据权利要求7或8所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述PCR扩增反应的退火温度为58℃。
10.权利要求1-9任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法在鸽新城疫病毒检测领域中的应用。
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