CN109554507B

CN109554507B - 一种h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法

Info

Publication number: CN109554507B
Application number: CN201910057664.4A
Authority: CN
Inventors: 蒋文明; 刘华雷
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109554507A

Abstract

本发明提供一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法，分别比对了近年来分离到的H5亚型高致病性禽流感病毒和H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光定量RT‑PCR核酸快速检测方法。本发明所提供的H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT‑PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节，只需一台荧光PCR仪即可在一个密闭反应管中完成两种亚型禽流感病毒的检测，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。

Description

一种H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法。

背景技术

禽流感病毒根据对家禽致病性的不同，可以分为高致病性和低致病性禽流感病毒。其中，高致病性禽流感病毒包括H5和H7亚型的部分毒株。

1996年，我国首次从广东的鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。从2003年末开始，H5N1亚型高致病性禽流感在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。2004年至2015年，我国的多个省份暴发了疫情，超过2千万只禽类被扑杀，给养禽业造成了巨大的经济损失。2005年底开始，我国针对H5亚型高致病性禽流感病毒实行大规模强制免疫政策，疫情开始得到了有效控制。实践证明，在禽流感防控方面，疫苗免疫发挥了巨大的作用。

但是，在养殖过程中发现，疫苗免疫加快了病毒变异，使得疫苗必须加快更新换代。随着病毒的进化，H5亚型禽流感病毒一直在发生较快的变异；从最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12。病毒变异是由于其血凝素基因(HA)中核苷酸的变异引起的。目前，全球H5亚型禽流感病毒共存在10个分支。我国存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4个分支，均为高致病性病毒。我国现在流行的毒株与1996年最初分离的病毒A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1)的HA核苷酸同源性仅为90.6％(Re-11)和91.2％(Re-12)。以Re-11和Re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性仅为88.5％。HA核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因的检测方法的难度，导致以HA基因为靶基因的检测方法的特异性、敏感性下降，造成假阴性的结果。

2013年我国从人群病例和家禽中检测到H7N9病毒，动物试验证明从家禽中分离到的H7N9病毒对家禽是无致病力或低致病力的。但随着H7N9病毒的演变，在经历了三年多时间之后，2016年底以来，H7N9禽流感病毒从弱毒株突变为强毒株，并在某些地区暴发了H7N9高致病性禽流感疫情。

H7N9病毒突变为高致病性毒株之后，对家禽业造成巨大的经济损失。其感染发病症状与H5亚型高致病性禽流感病毒极为相似，临床上难以区分。因此，检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒对于疾病的诊断与防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法，分别比对了近年来分离到的H5亚型高致病性禽流感病毒和H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR核酸快速检测方法。

本发明首先提供一种用于检测H5亚型高致病性禽流感病毒的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ ID NO：1)，

下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ ID NO：2)；

探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ ID NO：3)，

其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

其次，本发明提供一种用于H7N9亚型高致病性禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATG(SEQ ID NO：4)，

下游引物序列为CTTCCCATCCATTTTCAATGAAAC(SEQ ID NO：5)；

探针序列如下：

CGGAMTRMDACCAAAGRGAAAACGGAMTRMDAGAGGCCT(SEQ ID NO：6)，

其中探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2；

本发明的引物组和探针用于制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种检测H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的方法，包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、水1.5μl、浓度为10μmol/L上游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物2.0μl、浓度为10μmol/L的探针1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果FAM通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为H5亚型高致病性禽流感病毒阳性；

如果Cy5通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为H7N9亚型高致病性禽流感病毒阳性。

本发明所提供的H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节(易造成环境污染)，只需一台荧光PCR仪即可在一个密闭反应管中完成两种亚型禽流感病毒的检测，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求(高致病性禽流感病毒需要在生物安全三级实验室完成)。

附图说明

图1:H5亚型禽流感病毒HA序列比对图，

图2:H7N9亚型禽流感病毒HA序列比对图，

图3:本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感性试验图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明进行详细的描述。

实施例1：保守序列区域的确定及引物探针的筛选

申请人通过分子生物学方法研究了H5亚型流感病毒的不同NA亚型、不同分支的HA核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的H5毒株HA序列进行比对，确定其保守区域(图1)。序列比对发现，H5亚型流感病毒的HA序列在nt106–nt174区域，该区域的序列如下：

ATGGAAAARAACGTYACTGTWACRCATGCYMAAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGARGCTYTG；

nt210–nt242区域，序列为ATTGYAGTGTRGCWGGATGGCTHCTYGGRAAYCC的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝或C，W＝A或T。

表1：本发明中引物和探针设计使用到的H5病毒株信息表

按照荧光定量RT-PCR引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于H5亚型禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ ID NO：1)，

下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ ID NO：2)；

探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ ID NO：3)，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

申请人通过分子生物学方法研究了H7N9亚型禽流感病毒强毒和弱毒的HA核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的H7N9毒株HA序列进行比对，确定其保守区域(图2)。序列比对发现，H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的HA序列在nt907–nt956区域，该区域的序列如下：

TTTCAGAACATWGAYAGCAGRRCARTTGGAAAATGYCCRAGATAKGTTAA；

nt964–nt995区域，序列为AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATGAAGAATGT；

nt1028–nt1076区域，序列为GAGGCCTRTTTGGTGCTATAGCDGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGG的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，W＝A或T，K＝G或T。

比对H7N9亚型禽流感病毒高致病性毒株与低致病性毒株的HA序列，显示高致病性毒株主要是在nt1016–nt1027区域插入了12个碱基，序列为AACGGAMTRMDA；其中，R＝A或G，M＝A或C，D＝G，A或T。

表2：本发明中引物和探针设计使用到的H7N9病毒株信息表

按照荧光定量RT-PCR引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于H7N9亚型高致病性禽流感病毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中H7上游引物序列为AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATG(SEQ ID NO：4)，

H7下游引物序列为CTTCCCATCCATTTTCAATGAAAC(SEQ ID NO：5)；

探针序列为CGGAMTRMDACCAAAGRGAAAACGGAMTRMDAGAGGCCT(SEQ ID NO：6)，其中探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2；

实施例2：建立检测方法

确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入2×RT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、水1.5μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将反应体系密闭，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

用实时荧光定量RT-PCR技术，对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：

第一步(合成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)，人工合成扩增反应所需要的上下游引物和探针；

第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入2×qRT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、水1.5μl、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；

第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。

第四步(结果检测)：如果FAM通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为H5亚型高致病性禽流感病毒阳性；如果Cy5通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为H7N9亚型高致病性禽流感病毒阳性。

实施例3：引物和探针的效果检测

1、采用上述筛选建立的引物探针和方法对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒进行了敏感性测试，包括如下步骤：

第一步：提取病毒RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍比稀释，取10.0μl稀释后的RNA模板，加入到40.0μl qRT-PCR预混液中；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其灵敏度；

结果表明，本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，可以检测到0.1fg的H5病毒RNA模板，可以检测到0.004fg H7N9强毒RNA模板(图3)。

2、对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法进行了特异性测试，包括如下步骤：

第一步：选取本室保存的H1-H16亚型的禽流感病毒，包括H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、H4N4亚型、H5N1亚型、H5N2亚型、H5N3亚型、H5N6亚型、H5N8亚型、H6N8亚型、H7N9亚型、H8N6亚型、H9N2亚型、H10N8亚型、H11N2亚型、H12N2亚型、H13N1亚型、H14N4亚型、H15N1亚型、H16N1亚型。其中，H5亚型禽流感病毒，包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的病毒株；H7N9亚型包括H7N9高致病性毒株和H7N9低致病性毒株。同时选取其他禽类病毒，包括新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒。提取RNA作为模板；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其特异性；

第三步：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，H5引物探针组合可以检测出第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支、第7.2分支共4个分支的H5亚型禽流感病毒，对其他亚型的禽流感病毒及其他禽类病毒均无检出；H7N9引物探针组合可以检出H7N9高致病性毒株，其他亚型的禽流感病毒(包括H7N9低致病性毒株)及其他禽类病毒均无检出(表3)。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

表3：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性试验结果表

实施例4：临床样品的应用检测。

对2014～2018年收集临床疑似H5和H7N9亚型高致病性禽流感发病家禽样品100份，主要包括肺脏、肝脏、脾脏、气管、直肠等组织。取少量组织样品，剪碎后加入5～10倍体积的PBS缓冲液，进行匀浆或震荡破碎。冻融3次后，10000rpm离心5分钟，取上清备用。一部分上清直接提取RNA，用上述H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测；另一部分上清接种10日龄鸡胚，进行病毒分离，比较两种方法的符合率。

结果显示：对100份临床发病组织样品进行检测，用上述H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测，有76份为H5病毒阳性，15份H7N9强毒阳性。病毒分离结果也显示为91份为阳性，测序结果显示RT-PCR方法与病毒分离结果一致且为对应关系，符合率100％。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaara acgtyactgt 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccatccwg cyacactrca at 22

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagacatact ggaraagaca cayaayggga 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtctkctgc tkgcwacagg ratg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttcccatcc attttcaatg aaac 24

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggamtrmda ccaaagrgaa aacggamtrm dagaggcct 39

Claims

1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含用于检测H5亚型高致病性禽流感病毒的引物组和探针，和用于H7N9亚型高致病性禽流感病毒检测的引物组和探针；其中检测H5亚型高致病性禽流感病毒的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组和探针的序列信息如下：

上游引物的序列为SEQ ID NO：1，

下游引物的序列为SEQ ID NO：2；

探针的序列为SEQ ID NO：3；

用于H7N9亚型高致病性禽流感病毒检测的引物组和探针，其中上游引物的序列为SEQID NO：4，下游引物序列为SEQ ID NO：5；探针的序列为SEQ ID NO：6。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。