CN104232798B - 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明针对于DHAV 3D区域设计一对保守扩增引物（SEQ ID NO:1和2）和一条保守探针（SEQ ID NO:5），用于检测不同基因型的鸭甲型肝炎病毒；针对于DHAV 5’UTR设计一对特异性引物（SEQ ID NO:3和4）和两条特异性探针（SEQ ID NO:6和7），用于鉴别检测DHAV-A和DHAV-C。本发明具有良好的特异性、重复性和敏感性，操作方便、简单、快速，可用于科研及临床中DHAV的感染以及DHAV-A和DHAV-C 鉴别诊断，也可用于DHAV病原流行病学调查。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型鸭甲型肝炎病毒和基因C型鸭甲型肝炎病毒鉴别的多重荧光定量PCR方法及试剂盒。
背景技术
鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的一种重要传染病，其主要致病因子是小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲型肝炎病毒(duckhepatitisAvirus,DHAV)。根据全基因组序列分析，鸭甲型肝炎病毒又可分为3个独立的基因型，基因A型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-A)、基因B型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-B)和基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)；根据血清学中和试验，这3个基因型，由于并无血清交叉，故分别对应3个不同的血清型，血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、血清2型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-2)、血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)。DHAV-A代表传统的流行毒株，全球范围内广泛流行，也是我国鸭肝炎病毒的主要流行毒株。DHAV-B代表台湾新型病毒株，DHAV-C代表近年来我国和韩国等国家和地区新出现的流行毒株。该3个基因型病毒所引起的疾病在临床症状、病理变化上较为相似，给鉴别诊断带来很大的困难。特别是DHAV-C在我国诸多地区的暴发和流行，由于目前还没有开发出相关的DHAV-C疫苗和抗体投入到实际生产中，所以对于DHAV-C的快速准确检测对于鸭病毒性肝炎的预防与控制具有重要意义。
关于DHAV的分子快速检测方法，目前国内外报道较多的主要是针对DHAV-A进行检测，对DHAV-C以及与DHAV-A进行鉴别检测方法并不多见，尤其是实时荧光定量PCR方法鉴别检测DHAV-C与DHAV-A鲜有报道。实时荧光定量PCR技术凭借其操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好及病原定量等优势，近年来在动物疫病检测中得以广泛应用。因此建立该多重荧光定量PCR方法，不仅为确定鸭病毒性肝炎致病因素提供了一种鉴别检测方法，同时也为DHAV-A与DHAV-C的流行病学调查提供了一种重要技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法，该方法利用TaqMan探针技术，不仅能够实现DHAV的快速检测，还能够快速准确对DHAV-A和DHAV-C的核酸进行定量检测。
本发明的目的还在于提供一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法，包括样品核酸的提取、cDNA模板的制备和多重荧光定量PCR扩增步骤，所述的多重荧光定量PCR扩增步骤中采用了以下引物：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’(SEQIDNO:1)，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’(SEQIDNO:2)；
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’(SEQIDNO:3)，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’(SEQIDNO:4)；
所述的多重荧光定量PCR扩增步骤还采用了如下荧光标记的探针：
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’(SEQIDNO:5)，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’(SEQIDNO:6)，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’(SEQIDNO:7)；
其中，DHAVPF、DHAVPR和DHAV荧光探针PB0为针对于DHAV3D区域设计的一对保守扩增引物和一条保守探针，用于检测不同基因型的鸭甲型肝炎病毒；DHAV-A-CPF、DHAV-A-CPR和DHAV-A荧光探针PB1、DHAV-C荧光探针PB3为针对于DHAV5’UTR设计的一对特异性引物和两条特异性探针，用于鉴别检测DHAV-A和DHAV-C。
上述引物与探针序列中，W代表碱基A或T，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G。
所述的cDNA模板的制备的反应体系和反应条件优选如下：
反应体系：RNA5.0μL，随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(10.0μM)1.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV(TAKARA)0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL。
反应条件：42℃保温1h，70℃作用10min。
所述的多重荧光定量PCR扩增的的反应体系和反应条件优选如下：
反应体系：2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix(Qiagen)12.5μL，2对引物混合液3.0μL(各10μM)，混合荧光探针2.0μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL)，cDNA检测模板为5.0μL，余下补足DEPC-H2O至50μL体系。
反应条件：92℃预变性2min，进行循环阶段，94℃变性10s，60℃退火30s，退火过程中收集荧光，40个循环。
一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，包含检测DHAV通用引物、DHAV-A与DHAV-C检测引物及TaqMan荧光探针。
所述的检测DHAV通用引物为：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’(SEQIDNO:1)，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’(SEQIDNO:2)；
所述的DHAV-A与DHAV-C检测引物为：
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’(SEQIDNO:3)，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’(SEQIDNO:4)；
所述的TaqMan荧光探针为：
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’(SEQIDNO:5)，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’(SEQIDNO:6)，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’(SEQIDNO:7)。
所述的试剂盒还包含阳性标准品，阳性标准品优选通过包括如下步骤的方法制备得到：以DHAV基因组RNA为模板，反转录后用检测DHAV通用引物进行PCR扩增，以扩增产物为模板用T7RNA聚合酶进行体外转录得到cRNA，即是阳性标准品。
所述的试剂盒还包含反转录试剂和荧光定量PCR试剂。
本发明可用于科研及临床中DHAV的感染以及DHAV-A和DHAV-C鉴别诊断，也可用于DHAV病原流行病学调查。
本发明的优点：
(1)本发明使用两对特异性引物和三条高特异性的TaqMan荧光探针，减少了多对引物之间的干扰，具有很高的准确性，特异性良好，假阳性率极低。
(2)本发明可检测低至72copies的核酸量，说明检测灵敏度较高。
(3)本发明对其他病毒，鸭瘟疫苗毒(DPVCVCCAV1222株)、新城疫疫苗毒(NDVHB1株)、禽流感疫苗毒(AIVH9)、禽呼肠孤病毒(ARV)、传染性支气管炎疫苗毒(IBVH120株)的检测结果皆为阴性，具有良好的特异性。
(4)本发明在一次反应中，不仅可检测出是否是DHAV，以及对病毒含量进行定量分析，而且还可同时鉴别出DHAV-A和DHAV-C，本发明操作方便、快捷，对临床样本中鸭肝炎病毒鉴别诊断具有重要价值。
(5)整个扩增和检测过程均在同一个封闭管内进行，有效避免了气溶胶污染而造成的假阳性。操作简单、自动化，与常规PCR方法相比，大大提高了检测时间和效率。
附图说明
图1是本发明对DHAV进行定量标准曲线的绘制，扩增效率为99.0％，标准曲线相关系数R2＝1.0，表明误差小，可信度高。
图2是本发明敏感性试验结果，1-5分别是7.2×103、7.2×102、7.2×10、7.2、7.2×10-1copies/μL的标准品的扩散曲线，根据扩散曲线可以看出最低检测灵敏度为72拷贝RNA量。
图3是本发明对基因A型DHAV检测特异性试验结果，曲线1为DHAV通用探针扩增曲线，曲线2为DHAV-A特异性探针扩增曲线，曲线3为其他病毒(DPV、NDV、AIV、ARV、IBV)及阴性对照扩增曲线。
图4是本发明对基因C型DHAV检测特异性试验结果，曲线1为DHAV通用探针扩增曲线，曲线2为DHAV-C特异性探针扩增曲线，曲线3为其他病毒(DPV、NDV、AIV、ARV、IBV)及阴性对照扩增曲线。
图5是本发明对基因C型和A型DHAV混合样本检测特异性试验结果，曲线1为DHAV通用探针扩增曲线，曲线2为DHAV-A扩增曲线，曲线3为DHAV-C扩增曲线，曲线4为其他病毒(DPV、NDV、AIV、ARV、IBV)及阴性对照扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法的建立
(1)引物探针设计
从GenBank数据库下载所有目前已知的不同基因型DHAV全基因组序列，利用BioEdit软件进行同源性排序分析比较，确定在DHAV3D区域作为检测DHAV通用引物与探针的设计区域；分别选择DHAV-A与DHAV-C的5’UTR序列中保守区，作为DHAV-A与DHAV-C检测引物与探针的设计区域，最后利用BeaconDesigner7.0生物软件对以上区域设计出符合荧光定量PCR要求的多组引物与探针，先进行BLAST理论分析其特异性，然后进一步通过实验筛选出最佳引物和探针组合，确定为本方法中所使用的引物和探针。其中引物、探针序列如下：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’(SEQIDNO:1)，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’(SEQIDNO:2)；
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’(SEQIDNO:3)，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’(SEQIDNO:4)；
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’(SEQIDNO:5)，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’(SEQIDNO:6)，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’(SEQIDNO:7)。
上述引物与探针序列中，W代表碱基A或T，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G。
其中，引物对DHAVPF、DHAVPR和DHAV荧光探针PB0针对于DHAV3D区域设计，用于检测不同基因型的鸭甲型肝炎病毒；引物对DHAV-A-CPF、DHAV-A-CPR和DHAV-A荧光探针PB1、DHAV-C荧光探针PB3针对于DHAV5’UTR设计，用于鉴别检测DHAV-A和DHAV-C。
(2)病毒核酸RNA的提取
1)分离培养的病毒：将鸡胚或鸭胚培养得到的胚尿囊液，加入5倍体积Trizol液，充分混匀；室温放置5分钟，然后以每1mLTrizol液加入0.2mL的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层水相于一新的离心管，按每1mLTrizol液加0.5mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；弃去上清液，按每1mLTrizol液加入至少1mL的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；然后将RNA溶于水中，放置10分钟。
2)组织病料：将采集的肝组织约50～100mg于研磨罐中，在液氮中研磨组织成细粉后，加入Trizol试剂2mL，充分匀浆，室温放置10分钟。吸入到1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清。加入氯仿0.2mL，剧烈震荡15s，4℃放置10min，12000rpm离心15min，取上清。氯仿的主要作用是将酚从溶液中萃取出来。离心后溶液分为三相，即上层的水相，下层的有机相以及中间的变性蛋白，小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。加入异丙醇0.5mL，震荡混匀，4℃放置10min，12000rpm离心10min，弃上清。加入50％的异丙醇可以导致核酸沉淀，1mL75％乙醇洗涤沉淀，并8000rpm离心5min(若管壁仍有残留液体，继续离心，吸取残留液体)。乙醇洗涤的目的是去除沉淀中残留的盐分。沉淀空气干燥5min，溶解于50μLDEPC-H2O，-70℃保存备用。
(3)cDNA模板的制备
取上述制备的RNA5.0μL，加入PCR反应管中，再分别加随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(10.0μM)1.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV(TAKARA)0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL。将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶，将制备的反转录模板于4℃保存备用。
(4)多重荧光定量PCR反应
荧光定量PCR的反应体系为(总反应体系为50μL)：2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix(Qiagen)12.5μL，4条引物混合液2.0μL(10μM)，混合荧光探针3.0μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL)，cDNA检测模板为4μL，余下补足DEPC-H2O至50μL体系。反应在ABISteponePlus荧光定量PCR仪上进行，第一步：92℃，2min，1cycle；第二步：94℃，10s，60℃，30s(收集荧光信号)，40cycles。
(5)结果判定
结果分析条件设定：点击分析界面，取3～10或3～15个循环的荧光信号确定基线(baseLine)。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品及阴性样本的扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，不出现Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。
结果判定：检测样本Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长期，测定结果有效，可直接报告样本阳性；检测样本35.0＜Ct值＜38.0时，需重复一次，如果Ct值仍小于38.0，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性；检测不到样本Ct值或Ct值≥38.0，报告样本阴性。
(6)阳性标准品的构建
阳性标准品的构建有两个目的，一是加入反应体系中，检验扩增体系是否有效，二是用于模板中鸭甲型肝炎病毒拷贝数准确定量。故以DHAV-C基因组RNA为模板，按照上述方法进行反转录，用鸭甲型肝炎病毒检测通用引物DHAVPF/PR按常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pEASY-T1载体上，转化，提取质粒DNA，进行酶切线性化，胶回收纯化后，然后对纯化产物用T7RNA聚合酶进行体外转录，合成cRNA，将合成产物进行DNA消化以及酚/氯仿/异戊醇纯化后，再用分光光度计测浓度，按照公式，计算出拷贝数。用构建的标准品10倍系列稀释，建立标准曲线，用以对待检样本进行定量。
(7)待检样本的定量
通过比较待检样本和标准品的阈值循环数对待检标本的起始拷贝数进行定量。
本发明的引物与探针特征表现：本反应体系共设计了两个引物组对，分别针对鸭甲型肝炎病毒基因组的两个区域，非结构蛋白3D和5’UTR序列保守区，所以对于任何基因型鸭甲型肝炎病毒，这两对引物均可以扩增出靶基因片段。另外还设计了不同荧光标记的TaqMan探针，其中DHAV荧光探针PB0序列位于3D区，高度保守，对于不同基因型鸭肝炎病毒均可以识别；DHAV-A荧光探针PB1和DHAV-C荧光探针PB3位于5’UTR序列保守区，分别识别A型和C型鸭甲型肝炎病毒。因此要对检测体系中的鸭甲型肝炎病毒进行定量，只需设置一种类型的标准品，即位于3D区的靶基因片段。
因此，在实际定量检测中，将已知拷贝数的标准品，进行10倍梯度稀释，与待检测样品进行同步检测，根据标准品绘制的标准曲线方程，就可以推算出待检样品中鸭甲型肝炎病毒的相对拷贝数。对DHAV进行定量标准曲线的绘制，扩增效率为99.0％，标准曲线相关系数R2＝1，表明误差小，可信度高(图1)。
(8)敏感性检测
将已建立的标准品(7.2×108copies/μL)，进行10倍梯度稀释，选择7.2×103、7.2×102、7.2×10、7.2、7.2×10-1copies/μL的标准品进行检测，其Ct值分别为33.71、34.58、36.62、38.45、39.23，阴性水对照无Ct值。根据扩增曲线可得出，本方法最低可检测到72拷贝数的目标RNA量(图2)。
(9)特异性检验
分别提取DHAV-A鸡胚尿囊液病毒、DHAV-C鸭胚尿囊液病毒及DHAV-A鸡胚尿囊液和DHAV-C鸭胚尿囊液混合物，以及其他病毒(NDV、AIV、ARV、IBV)的RNA，进行逆转录，制备cDNA模板，另外提取DPV的核酸DNA，以建立的多重荧光PCR方法进行获得的cDNA模板和DNA进行检测。检测结果为，对DHAV-A进行检测，仅DHAV通用探针(曲线1)和DHAV-A特异性探针(曲线2)呈现明显的扩增曲线，其他病毒及阴性对照无扩增曲线(曲线3)(图3)；对DHAV-C进行检测，仅DHAV通用探针(曲线1)和DHAV-C特异性探针(曲线2)呈现明显的扩增曲线，其他病毒及阴性对照无扩增曲线(曲线3)(图4)；对DHAV-A和DHAV-C的混合样本进行检测，DHAV通用探针(曲线1)和DHAV-A(曲线2)、DHAV-C特异性探针(曲线3)均呈现出明显的扩增曲线，其他病毒及阴性对照无扩增曲线(曲线4)(图5)。结果表明，该方法可鉴别检测DHAV-A与DHAV-C，与其他病毒DPV、NDV、AIV、ARV、IBV无交叉反应。
基于上述构建的方法，本发明还提供了一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，该试剂盒包含检测DHAV通用引物、DHAV-A与DHAV-C检测引物及TaqMan荧光探针。
其中，检测DHAV通用引物为：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’(SEQIDNO:1)，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’(SEQIDNO:2)；
DHAV-A与DHAV-C检测引物为：
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’(SEQIDNO:3)，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’(SEQIDNO:4)；
TaqMan荧光探针为：
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’(SEQIDNO:5)，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’(SEQIDNO:6)，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’(SEQIDNO:7)。
该试剂盒还包含阳性标准品，阳性标准品优选通过包括如下步骤的方法制备得到：以DHAV基因组RNA为模板，反转录后用检测DHAV通用引物进行PCR扩增，以扩增产物为模板用T7RNA聚合酶进行体外转录得到cRNA即是阳性标准品。
该试剂盒还包含反转录试剂和荧光定量PCR试剂。
实施例2检测基因A型鸭甲肝病毒感染
(1)检测样本
所选择的检测样品有A型鸭甲肝病毒感染病死鸭肝组织(S1)，健康鸭肝组织(S2)，A型鸭甲肝病毒鸡胚组织毒(S3)、健康鸡胚组织(S4)，A型鸭甲肝病毒鸡胚致弱尿囊液病毒(S5)，阳性标准品(P)。
(2)病毒RNA的提取
病毒RNA的提取方法参照上述方法，对于组织病毒均采用液氮法研磨，以防止研磨过程中产生的热量，造成病毒RNA的降解。研磨后的组织匀浆液核酸提取方法同鸡胚尿囊液病毒，均为传统Trizol法提取RNA。
(3)反转录及多重荧光定量PCR检测
先将随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(2.5μM)4.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV(TAKARA)0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL，根据检测样本的数量配成大体系，然后再平均分装到0.5mLPCR反应管中，再依次加入上述制备的RNA4.0μL，将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶，将制备的反转录模板于4℃保存备用。此操作过程既可在PCR仪上操作，也可在普通水浴锅上进行。
反转录结束后，进行多重荧光定量PCR检测，操作方法为：根据单反应体系(2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix(Qiagen)12.5μL，混合引物2μL(10μM)，混合荧光探针3μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL))以及检测样本的数量，配制大体系，然后再平均分配到荧光PCR检测专用管中，再依次加入4.0μLcDNA模板。反应条件为：第一步：92℃，2min，1cycle；第二步：94℃，10sec，60℃，30sec(收集荧光信号)，40cycles。
(4)检测结果
结果表明，样本S1、S3、S5和阳性标准品，均可检测到明显的Ct值，动力学扩增曲线良好；而阴性对照、样本S2、S4未检测到Ct值，说明本方法可实现对A型鸭甲肝病毒组织和尿囊病毒有效检测(表1)。
表1
实施例3检测基因C型鸭甲肝病毒感染
(1)检测样本
所选择的检测样品有C型鸭甲肝病毒感染病死鸭肝组织(Y1)，健康鸭肝组织(S2)，C型鸭甲肝病毒鸭胚组织毒(Y2)，健康鸭胚组织(D4)，C型鸭甲肝病毒鸭胚致弱尿囊液病毒(Y3)，阳性标准品(P)。
(2)病毒RNA的提取
病毒RNA的提取方法参照上述方法，对于组织病毒均采用液氮法研磨，以防止研磨过程中产生的热量，造成病毒RNA的降解。研磨后的组织匀浆液核酸提取方法同鸡胚尿囊液病毒，均为传统Trizol法提取RNA。
(3)反转录及多重荧光定量PCR检测
先将随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(2.5μM))4.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL，根据检测样本的数量配成大体系，然后再平均分装到0.5mLPCR反应管中，再依次加入上述制备的RNA4.0μL，将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶，将制备的反转录模板于4℃保存备用。此操作过程既可在PCR仪上操作，也可在普通水浴锅上进行。
反转录结束后，进行多重荧光定量PCR检测，操作方法为：根据单反应体系(2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix12.5μL，混合引物2μL(10μM)，混合荧光探针3μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL))以及检测样本的数量，配制大体系，然后再平均分配到荧光PCR检测专用管中，再依次加入4.0μLcDNA模板。反应条件为：第一步：92℃，2min，1cycle；第二步：94℃，10sec，60℃，30sec(收集荧光信号)，40cycles。
(4)检测结果
结果表明，样本Y1、Y2、Y3和阳性标准品，均可检测到明显的Ct值，动力学扩增曲线良好；而阴性对照、样本S2、D4，Ct值均被判为阴性，说明本方法可实现对C型鸭甲肝病毒组织和尿囊病毒有效检测(表2)。
表2
实施例4检测基因C型和A型鸭甲肝病毒混合感染
(1)检测样本
所选择的检测样品有A型鸭甲肝病毒感染病死鸭肝组织(S1)、C型鸭甲肝病毒感染病死鸭肝组织(Y1)、健康鸭肝组织(S2)、A型鸭甲肝病毒鸡胚组织毒(S3)、C型鸭甲肝病毒鸭胚组织毒(Y2)、健康鸡胚组织(S4)、A型鸭甲肝病毒鸡胚致弱尿囊液病毒(S5)、C型鸭甲肝病毒鸭胚致弱尿囊液病毒(Y3)、A型和C型鸭甲肝病毒致弱尿囊液病毒混合液(Y4)、阳性标准品(P)。
(2)病毒RNA的提取
病毒RNA的提取方法参照上述方法，对于组织病毒均采用液氮法研磨，以防止研磨过程中产生的热量，造成病毒RNA的降解。研磨后的组织匀浆液核酸提取方法同鸡胚尿囊液病毒，均为传统Trizol法提取RNA。
(3)反转录及多重荧光定量PCR检测
先将随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(2.5μM)4.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL，根据检测样本的数量配成大体系，然后再平均分装到0.5mLPCR反应管中，再依次加入上述制备的RNA4.0μL，将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶，将制备的反转录模板于4℃保存备用。此操作过程既可在PCR仪上操作，也可在普通水浴锅上进行。
反转录结束后，进行多重荧光定量PCR检测，操作方法为：根据单反应体系(2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix12.5μL，混合引物2μL(10μM)，混合荧光探针3μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL))以及检测样本的数量，配制大体系，然后再平均分配到荧光PCR检测专用管中，再依次加入4.0μLcDNA模板。反应条件为：第一步：92℃，2min，1cycle；第二步：94℃，10sec，60℃，30sec(收集荧光信号)，40cycles。
(4)检测结果
结果表明，样本Y1、Y2、Y4和阳性标准品，均可检测到明显的动力学扩增曲线，其检测CT值均小于38.0，可判为阳性；而阴性对照样本S2、S4，Ct值均大于38.0或未被检测到，因而被判为阴性，说明本方法可实现对A和C型鸭肝炎组织和尿囊病毒有效检测(表3)。
表3
实施例5临床病料的检测
(1)检测样本
鸭甲型肝炎病毒广西GX株、河北R株、河北H株、北京J株、山东SL株、湖北XG株，均为临床发病鸭分离毒株，并经过RT-PCR检测鉴定，3型鸭甲型肝炎病毒鸭胚组织毒(P)作为阳性对照，阴性对照采用健康鸭胚组织匀浆液(N)。
(2)病毒RNA的提取
病毒RNA的提取方法参照上述方法，对于组织病毒均采用液氮法研磨，以防止研磨过程中产生的热量，造成病毒RNA的降解。研磨后的组织匀浆液核酸提取方法同鸡胚尿囊液病毒，均为传统Trizol法提取RNA。
(3)反转录及多重荧光定量PCR检测
先将随机引物(20μM)、Oligod(T)(20μM)各0.5μL，dNTPs(2.5μM)4.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL，根据检测样本的数量配成大体系，然后再平均分装到0.5mLPCR反应管中，再依次加入上述制备的RNA4.0μL，将反应混合物混合均匀后，瞬离。反应条件为42℃保温1h，70℃作用10min，灭活反转录酶，将制备的反转录模板于4℃保存备用。此操作过程既可在PCR仪上操作，也可在普通水浴锅上进行。
反转录结束后，进行多重荧光定量PCR检测，操作方法为：根据单反应体系(2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix12.5μL，混合引物2μL(10μM)，混合荧光探针3μL(DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL))以及检测样本的数量，配制大体系，然后再平均分配到荧光PCR检测专用管中，再依次加入4.0μLcDNA模板。反应条件为：第一步：92℃，2min，1cycle；第二步：94℃，10sec，60℃，30sec(收集荧光信号)，40cycles。
(4)检测结果见表4。
表4多重荧光定量PCR检测方法与RT-PCR方法比较
根据以上试验结果表明，本发明的鸭甲型肝炎病毒检测与基因1型和3型鉴别的方法及试剂盒，无论是对实验室分离培养的疫苗株病毒，还是临床上分离的病毒以及病料鸭肝组织，均呈现良好的检测效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>武汉中博生物股份有限公司
<120>鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法及试剂盒
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Claims (8)
1.一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法，包括样品核酸的提取、cDNA模板的制备和多重荧光定量PCR扩增步骤，其特征在于：所述的多重荧光定量PCR扩增步骤中采用了以下引物和荧光标记的探针：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’；
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’；
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’；
该方法不用于疾病的诊断。
2.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的cDNA模板的制备的反应体系和反应条件如下：
反应体系：RNA5.0μL，随机引物、Oligod(T)各0.5μL，dNTPs1.0μL，RnaseInhibitor0.5μL，反转录酶M-MLV0.5μL，5×M-MLVBuffer2.0μL；
反应条件：42℃保温1h，70℃作用10min。
3.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的多重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的多重荧光定量PCR扩增的反应体系和反应条件如下：
反应体系：2×QuantiFastMultiplexPCRMasterMix12.5μL，权利要求1中的2对引物混合液3.0μL，DHAV-C荧光探针PB30.5μL、DHAV-A荧光探针PB11.0μL、DHAV荧光探针PB01.5μL，cDNA检测模板为5.0μL，余下补足DEPC-H2O至50μL体系；
反应条件：92℃预变性2min，进行循环阶段，94℃变性10s，60℃退火30s，退火过程中收集荧光，40个循环。
4.一种鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，其特征在于：包含检测DHAV通用引物、DHAV-A与DHAV-C检测引物及TaqMan荧光探针；
所述的检测DHAV通用引物为：
DHAVPF：5’-AGGYATTGAGGCWTGYAA-3’，
DHAVPR：5’-GAGGTTYGCYAACARATTG-3’；
所述的DHAV-A与DHAV-C检测引物为：
DHAV-A-CPF：5’-GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3’，
DHAV-A-CPR：5’-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3’；
所述的TaqMan荧光探针为：
DHAV荧光探针PB0：5’-ROX-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3’，
DHAV-A荧光探针PB1：5’-JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3’，
DHAV-C荧光探针PB3：5’-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3’。
5.根据权利要求4所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，其特征在于：包含阳性标准品。
6.根据权利要求5所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，其特征在于：所述的阳性标准品通过包括如下步骤的方法制备得到：以DHAV基因组RNA为模板，反转录后用检测DHAV通用引物进行PCR扩增，以扩增产物为模板用T7RNA聚合酶进行体外转录得到cRNA即是阳性标准品。
7.根据权利要求4所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，其特征在于：包含反转录试剂。
8.根据权利要求4所述的鸭甲型肝炎病毒检测与基因A型和C型鉴别的试剂盒，其特征在于：包含荧光定量PCR试剂。
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