CN109517928B - 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 - Google Patents
乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109517928B CN109517928B CN201811480995.0A CN201811480995A CN109517928B CN 109517928 B CN109517928 B CN 109517928B CN 201811480995 A CN201811480995 A CN 201811480995A CN 109517928 B CN109517928 B CN 109517928B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- hepatitis
- virus
- human liver
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122三重荧光定量PCR检测试剂盒,其包括乙型肝炎病毒miR‑3的逆转录引物如SEQ ID NO.1所示、荧光探针如SEQ ID NO.2所示、PCR引物如SEQ ID NO.3和4所示,还可以进一步包括人肝脏特异性miR‑122的逆转录引物如SEQ ID NO.5所示、荧光探针如SEQ ID NO.6所示、PCR引物如SEQ ID NO.7和8所示,还可以进一步包括内参逆转录引物如SEQ ID NO.9所示、荧光探针如SEQ ID NO.10所示、PCR引物如SEQ ID NO.11和12所示。该试剂盒使用三重荧光定量PCR的方法从微量(100μl)血清或血浆中检测乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122的浓度,检测方法特异、高效、灵敏。该试剂盒能够用于乙型肝炎病毒复制情况的监控、抗病毒药物疗效和预后的评估和肝脏损伤的评测,具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物、医学检测领域,特别涉及一种三重荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122的试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒miR-3是由乙型肝炎病毒基因组编码产生的特异性microRNA,对乙型肝炎病毒的复制具有控制作用。血清或血浆中的HBV miR-3的浓度可以用来评估乙肝病毒复制的情况,同时也能用来评估抗病毒治疗疗效和预后(Xi Yang et al.Hepatitis BVirus-Encoded MicroRNA Controls Viral Replication.Journal of Virology.2017Volume 91 Issue 10 e01919-16)。miR-122是人肝脏细胞特异性表达的microRNA,血清中的miR-122浓度可以用来评测人肝脏细胞由于病毒活动等造成的损伤程度。这两种microRNA都可以作为一种新的生物学指标应用于临床检测,具有重要的临床意义。
从血清中运用荧光PCR检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122,目前有染料法和探针法,染料法特异性不如探针法,目前这两种方法都是通过加入的标准化内参Ct值进行相对定量的方法,无法准确定量出具体的分子拷贝数,检测下限和灵敏性都不可知。而且目前已有的方法都是单通道单色检测,每种microRNA需要单独一管进行PCR,检测效率低下。
本发明的microRNA逆转录使用的是茎环法,比现在主流的加尾法特异性强,成本低,同时为三重荧光定量PCR提供了可能。本发明的三重荧光定量PCR在同一个反应管中同时加入乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR-122和内参的三套引物和三种不同荧光的探针,同时进行荧光定量PCR互不干扰,一管反应可以获得三个结果,比目前的单色荧光定量PCR提高了200%的效率。本发明提供的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122定量参考品,能够绘制标准曲线并且定量标本中乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122的拷贝数浓度,比目前的相对定量方法更直接客观。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒,解决现有技术中microRNA检测试剂盒单色荧光PCR效率低,不能绝对定量血清microRNA分子拷贝浓度的技术问题。
为了实现上述目的,本发明首先提供了乙型肝炎病毒miR-3的引物、探针,包括:
用于逆转录乙型肝炎病毒miR-3采用的茎环法逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAACGCCG;
用于检测乙型肝炎病毒miR-3的荧光探针:
CACTGGATACGACAAACGCCGCAGA;
乙型肝炎病毒miR-3探针5’端连有荧光基团FAM,3’端连有猝灭基团BHQ1。
用于扩增乙型肝炎病毒miR-3的PCR上游引物:TGCGACTGGATGTGTCTG;
用于扩增乙型肝炎病毒miR-3的PCR下游引物:
CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。
优选地,本发明还提供了人肝脏特异性miR-122的引物、探针,包括:
用于逆转录人肝脏特异性miR-122采用的茎环法逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA;
用于检测人肝脏特异性miR-122的荧光探针:
CGCACTGGATACGACCAAACACCAT;
人肝脏特异性miR-122探针5’端连有荧光基团Cy5,3’端连有猝灭基团BHQ2。
用于扩增人肝脏特异性miR-122的PCR上游引物:
TCGCCTGGAGTGTGACAATGG;
用于扩增人肝脏特异性miR-122的PCR下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT。
优选地,本发明进一步提供了用于作为内参检测的C.elegans miR-39引物和探针,包括:
用于逆转录内参C.elegans miR-39采用的茎环法逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT;
用于检测内参C.elegans miR-39的荧光探针:
CGCACTGGATACGACCAAGCTGATT;
内参C.elegans miR-39探针5’端连有荧光基团Hex,3’端连有猝灭基团BHQ1。
用于扩增内参C.elegans miR-39的PCR上游引物:
TCGCCTCACCGGGTGTAAATC;
用于扩增内参C.elegans miR-39的PCR下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT。
优选地,本发明进一步提供了用于绝对定量的参考品和标准化内参包括:乙型肝炎病毒miR-3定量参考品:
TGCGACTGGATGTGTCTGCGGCGTTTGTCGTATCCAGTGCACCTCGGACCCTGCACTGG;
乙型肝炎病毒miR-3定量参考品为一段长为59碱基的人工合成DNA序列,根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该乙型肝炎病毒miR-3定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品,其浓度分别为5.00E+07copies/ml(A)、5.00E+06copies/ml(B)、5.00E+05copies/ml(C)、5.00E+04copies/ml(D)。
人肝脏特异性miR-122定量参考品:
GCCTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGGTCGTATCCAGTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC
人肝脏特异性miR-122定量参考品为一段长为59碱基的人工合成DNA序列,根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该乙型肝炎病毒miR-3定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品,其浓度分别为5.00E+07copies/ml(A)、5.00E+06copies/ml(B)、5.00E+05copies/ml(C)、5.00E+04copies/ml(D)。
标准化内参C.elegans miR-39:UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG;
标准化内参C.elegans miR-39为一段长为22碱基的人工合成RNA序列。
优选地,本发明提供的试剂盒进一步包括microRNA提取试剂:Trizol试剂(购自Invitrogen公司)、小分子RNA吸附柱(购自Magen公司)、洗液1(75%乙醇)、洗液2(85%乙醇)。选择Trizol试剂的方法,强烈的变性蛋白和保护RNA不被降解,然后氯仿萃取出RNA,通过小分子吸附柱纯化出microRNA,操作步骤简单、高效。
优选地,本发明提供的试剂盒进一步包括2.5×逆转录混合液,包括:125mmol/LTris-HCl(PH 8.3),125mmol/L KCl,10mmol/L MgCl2,25mmol/L DTT,25U/μL逆转录酶,2.5U/μL RNA酶抑制剂,2.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。
优选地,本发明提供的试剂盒进一步包括2×DNA聚合酶(Taq酶)混合液,包括:0.05U/μL DNA聚合酶,100mmol/L Tris-HCl(PH 8.5),100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。
本发明进一步提供了该试剂盒用于检测血清、血浆等未知样本中的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度的操作步骤,按照microRNA提取、microRNA逆转录、荧光定量PCR的流程,具体详细步骤如下:
步骤1.用5倍于样本体积的Trizol试剂处理血清或血浆样本,并加入内参至25pmol/L,反复吹打混匀至充分溶解,室温静置10分钟。
步骤2.加入与样本等体积的氯仿,振荡15秒后静置3分钟。12000g以上高速离心15分钟,转移上层水相即萃取出的血清或血浆总RNA至1.5ml无RNA酶离心管,并加入等体积异丙醇混匀,室温静置10分钟。
步骤3.将异丙醇处理的RNA加入小分子RNA吸附柱离心过滤,将小分子RNA吸附在柱子上,将大分子RNA滤过并丢弃。用500μL洗液1离心洗涤一次,再用500μL洗液2离心洗涤一次,去除杂质,最后用15μL无RNA酶水离心洗脱小分子RNA吸附柱,获得microRNA。
步骤4.对提取的microRNA进行逆转录:取11.5μL提取的microRNA、8μL的2.5×逆转录混合液和0.5μL的10μmol/L逆转录引物混合液,充分混匀,置于42℃进行逆转录30分钟,再于70℃孵育5分钟灭活逆转录酶,逆转录获得的cDNA置冰盒中备用。
步骤5.三重荧光定量PCR:取5μl逆转录好的cDNA,加入25μl的2×DNA聚合酶混合液、5μl的2μmol/L探针混合液、15μl去离子水,于PCR管内混匀,进行荧光定量PCR反应,反应条件为:95℃3分钟,进入循环:95℃12秒,60℃30秒(检测荧光),运行45-50个循环结束。
步骤6.分析结果数据,通过标准品拷贝数和Ct值绘制标准曲线,计算获得待测样本中乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度,通过内参Ct值归一化处理结果,消除microRNA提取操作误差。
本发明试剂盒因为采用用于检测乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参的探针都具有很好的特异性,应用本发明提供的试剂盒,可以对血清、血浆等未知样本中的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR122的浓度进行快速、精准测定,特异性好,三重荧光PCR能够在同一管中同时检测出乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参,比现有的单色荧光PCR方法效率提高了200%。进一步地,因为本发明试剂盒加入标准化内参,既可以有效监控假阴性的存在,还可以通过内参Ct值校正不同血清样本microRNA提取过程和PCR过程中产生的实验操作误差,对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。总之,本试剂盒在很大程度上简化了实验的步骤,降低了成本,而且检测效率有了很大的提高。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为本发明提供的试剂盒乙型肝炎病毒miR-3定量参考品A(5.00E+07copies/ml)、B(5.00E+06copies/ml)、C(5.00E+05copies/ml)和D(5.00E+04copies/ml)的扩增曲线图;
图2为本发明提供的试剂盒乙型肝炎病毒miR-3荧光定量PCR检测定量分析的标准曲线图;
图3为本发明提供的试剂盒人肝脏特异性miR122定量参考品A(5.00E+07copies/ml)、B(5.00E+06copies/ml)、C(5.00E+05copies/ml)和D(5.00E+04copies/ml)的扩增曲线图;
图4为本发明提供的试剂盒人肝脏特异性miR122荧光定量PCR检测定量分析的标准曲线图;
图5为本发明提供的试剂盒检测实验中,在同一管中同时扩增乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参的三重荧光定量PCR扩增曲线结果图;
图6为样本的检测中10个正常人血清标本的miR-3和内参扩增曲线图;
图7为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的乙型肝炎病毒miR-3扩增曲线图;
图8为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的人肝脏特异性miR-122扩增曲线图;
图9为样本的检测中10个乙型肝炎病毒阳性血清标本的内参扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述:
实施例1.microRNA提取
(1)取100μl血清/血浆加入1.5ml离心管,每管加入0.5ml的Trizol试剂,枪头反复吹打混匀直至蛋白完全溶解,每管加入5nmol/L的内参5μl,混匀,室温放置10分钟。
(2)每管加入100μl氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
(3)4℃,12000×g离心15分钟,吸取0.3ml上清至新的1.5ml离心管中,并加入0.3ml异丙醇,混匀,室温静置10分钟。
(4)把小分子RNA吸附柱装在2ml收集管中,转移所有RNA异丙醇混合液至小分子RNA吸附柱中,8000×g离心1分钟。
(5)倒弃滤液,装回柱子,加入0.5ml洗涤液1至柱中,8000×g离心1分钟。倒弃滤液,装回柱子,加入0.5ml洗涤液2至柱中,12000×g离心3分钟。
(6)将柱子转移至无RNA酶的1.5ml离心管中,加入15μl无RNA酶水至柱中,静置2分钟,12000×g离心1分钟,丢弃柱子,microRNA置冰盒中备用。
实施例2.microRNA逆转录
(1)取2.5×逆转录混合液8μl、10μmol/L的逆转录引物混合液0.5μl加入0.2ml无RNA酶的PCR薄壁管中。(其中10μmol/L逆转录引物混合液为miR-3、miR-122和C.elegansmiR-39逆转录引物的混合物,三者的浓度均为10μmol/L)
(2)取提取好的microRNA 11.5μl加入上述混合液中,吹打混匀。
(3)放入PCR仪进行逆转录,条件为:42℃30分钟,70℃5分钟。获得的cDNA置冰盒中备用。
实施例3.三重荧光定量PCR
(1)取2×PCR混合液25μl、2μmol/L探针混合液5μl、去离子水15μl加入0.2ml的8联PCR管中。(其中2μmol/L探针混合液为miR-3、miR-122和C.elegans miR-39探针的混合物,三者的浓度均为2μmol/L)
(2)每管加入5μl逆转录好的cDNA,混匀。
(3)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪,按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度
(4)荧光检测通道的选择:通过软件选择FAM通道检测miR-3,选择HEX检测内参,选择Cy5通道检测miR-122。
(5)荧光定量PCR反应条件为:95℃3分钟,进入循环:95℃12秒,60℃30秒(检测荧光),运行45-50个循环结束。
(6)结果分析:反应结束后,仪器自动保存结果。在相应的通道,可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析),然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点,称为Ct(即cycle threshold,指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时,所经历的循环数值);仪器软件根据各样本乙型肝炎病毒miR-3的4个浓度梯度定量参考品扩增曲线(见图1),获得Ct值绘制标准曲线(见图2),同时根据人肝脏特异性miR122的4个浓度梯度定量参考品扩增曲线(见图3),获得Ct值绘制标准曲线(见图4),每个标本通过三重荧光PCR扩增可以在同一个反应管内同时获得乙型肝炎病毒miR-3、人肝脏特异性miR122和内参三条扩增曲线(见图5),软件可以自动求得各样本的定值结果。最后通过内参Ct值校正结果(校准浓度=检测浓度/2-△内参Ct)。如果样本扩增曲线呈S型,有Ct值且定值结果≥500copies/ml,报告具体拷贝数浓度;如果定值结果≤500copies/ml,报告结果为低于检测下限;如果样本扩增曲线平直,无Ct值显示或无定值结果显示,可以判为阴性。凡内参无扩增曲线的数据为无效,应复查获得有效数据才能报告结果。
实施例4.检测10例正常人和10例乙型肝炎病毒阳性血清标本的乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122浓度。
收集10例正常人和10例乙型肝炎病毒阳性血清标本,各取100μL,按照上述实施例1、2、3所描述的方法检测乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122,10例正常人乙型肝炎病毒miR-3扩增曲线平直,无Ct值,检测乙型肝炎病毒miR-3均为阴性(见图6)。10例乙型肝炎病毒阳性血清标本检测乙型肝炎病毒miR-3均为阳性(见图7),同时可见人肝脏特异性miR-122的阳性扩增曲线(见图8)。所有标本均检测出内参,可见内参扩增曲线位置集中(图9),这是试剂盒操作标准化的标志。最后通过内参Ct值校正结果。
序列表
<110> 中南大学湘雅二医院
<120> 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒
<140> 201811480995.0
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtgcac tggatacgac aaacgccg 48
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<220>
<223> 5’端连有荧光基团FAM,3’端连有猝灭基团BHQ1
<400> 2
cactggatac gacaaacgcc gcaga 25
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tgcgactgga tgtgtctg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ccagtgcagg gtccgaggt 19
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaaaca 50
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<220>
<223> 5’端连有荧光基团Cy5,3’端连有猝灭基团BHQ2
<400> 6
cgcactggat acgaccaaac accat 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tcgcctggag tgtgacaatg g 21
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagct 50
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<220>
<223> 5’端连有荧光基团Hex,3’端连有猝灭基团BHQ1
<400> 10
cgcactggat acgaccaagc tgatt 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
tcgcctcacc gggtgtaaat c 21
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
tgcgactgga tgtgtctgcg gcgtttgtcg tatccagtgc acctcggacc ctgcactgg 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
gcctggagtg tgacaatggt gtttggtcgt atccagtgcg aatacctcgg accctgcac 59
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 秀丽隐杆线虫(C. elegans)
<400> 15
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
Claims (1)
1.一种乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,包括:用于乙型肝炎病毒miR-3荧光定量检测的引物和探针;用于人肝脏特异性miR-122荧光定量检测的引物和探针;作为内参检测的C.elegans miR-39引物和探针和绝对定量的参考品和标准化内参C.elegans miR-39;其中:用于乙型肝炎病毒miR-3荧光定量检测的引物和探针,包括:
乙型肝炎病毒miR-3逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAACGCCG
乙型肝炎病毒miR-3荧光探针:CACTGGATACGACAAACGCCGCAGA
乙型肝炎病毒miR-3的PCR引物:
上游引物:TGCGACTGGATGTGTCTG
下游引物:CCAGTGCAGGGTCCGAGGT;
用于人肝脏特异性miR-122荧光定量检测的引物和探针,包括:
人肝脏特异性miR-122逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA
人肝脏特异性miR-122荧光探针:CGCACTGGATACGACCAAACACCAT
人肝脏特异性miR-122的PCR引物:
上游引物:TCGCCTGGAGTGTGACAATGG
下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;
用于作为内参检测的C.elegans miR-39引物和探针,包括:
C.elegans miR-39逆转录引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT
C.elegans miR-39荧光探针:CGCACTGGATACGACCAAGCTGATT
C.elegans miR-39的PCR引物:
上游引物:TCGCCTCACCGGGTGTAAATC
下游引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;
用于绝对定量的参考品和标准化内参C.elegans miR-39,包括:
乙型肝炎病毒miR-3参考品:
TGCGACTGGATGTGTCTGCGGCGTTTGTCGTATCCAGTGCACCTCGGACCCTGCACTGG
人肝脏特异性miR-122参考品:
GCCTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGGTCGTATCCAGTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC
标准化内参C.elegans miR-39:
UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811480995.0A CN109517928B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811480995.0A CN109517928B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109517928A CN109517928A (zh) | 2019-03-26 |
CN109517928B true CN109517928B (zh) | 2020-02-07 |
Family
ID=65794147
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811480995.0A Active CN109517928B (zh) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109517928B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110241255B (zh) * | 2019-05-17 | 2024-01-30 | 东莞微量精准检测研究院有限公司 | 一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒 |
CN111718993B (zh) * | 2020-08-05 | 2021-07-13 | 中南大学湘雅二医院 | 一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105331695B (zh) * | 2015-11-04 | 2020-02-11 | 成都诺恩基因科技有限公司 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
CN106191293A (zh) * | 2016-08-18 | 2016-12-07 | 成都仕康美生物科技有限公司 | 一种基于数字PCR平台的miRNA‑122检测试剂盒及其应用 |
CN108300804B (zh) * | 2018-01-08 | 2022-01-25 | 东莞微量精准检测研究院有限公司 | 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法 |
-
2018
- 2018-12-05 CN CN201811480995.0A patent/CN109517928B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109517928A (zh) | 2019-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111235316A (zh) | 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用 | |
CN104232798B (zh) | 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 | |
CN111286560A (zh) | 用于呼吸道rna病毒pcr检测的内参基因及其检测产品 | |
CN112094944B (zh) | 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 | |
CN109517928B (zh) | 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 | |
CN107574261B (zh) | 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法 | |
CN106555013A (zh) | Hbv病毒的检测方法、试剂盒及其应用 | |
CN114015815B (zh) | 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法 | |
CN111733227B (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
CN114085902B (zh) | 检测人血清外泌体中miR-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒 | |
CN105296676A (zh) | 一种戊型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 | |
CN112593011A (zh) | 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针 | |
CN111718993B (zh) | 一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用 | |
CN112695134A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法 | |
CN112662808A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其检测方法 | |
CN109722492B (zh) | 一种检测h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒和h9亚型禽流感病毒的方法 | |
CN108424977B (zh) | 肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法 | |
CN105525036B (zh) | 一种乙型肝炎病毒hbv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
LU500740B1 (en) | REAL-TIME FLUORESCENT PCR DETECTION PRIMERS AND PROBES, KIT AND METHOD FOR NOVEL CORONAVIRUS 2019-nCoV | |
CN103374631A (zh) | 鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的rt-pcr法 | |
CN111500768B (zh) | 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在双重数字pcr的用途 | |
CN104894112B (zh) | 一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针 | |
CN109628640B (zh) | 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒 | |
CN110684862B (zh) | 用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字pcr试剂盒及检测方法 | |
CN105603113B (zh) | HIV-1早期感染相关的血清miRNA在制备试剂盒中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |