CN112593011A

CN112593011A - 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针

Info

Publication number: CN112593011A
Application number: CN202011568706.XA
Authority: CN
Inventors: 黎孟枫; 李隽�; 朱勋; 何振健; 吴珏珩; 谭姹辉; 陈德林; 林翠姬; 谭泳谣; 曹开源; 袁洁; 蔡俊超
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-02

Abstract

本发明公开了一组检测柯萨奇病毒B组的引物和探针，本发明通过Real‑time RT‑PCR方法对肠道病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内，准确对流行中的肠道病毒进行鉴定，对疑似感染样本进行确诊。本发明选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，实现单次检测即可对四种不同血清型的柯萨奇病毒进行分型鉴定，具有特异性强、灵敏性高、快速、操作方便、成本低廉等多种优点，适用于现场检测、早期诊断和流行病学检测研究等，对柯萨奇病毒B组感染疾病起到辅助和鉴别诊断作用。

Description

一组检测柯萨奇病毒B组的引物和探针

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体地，涉及一组检测柯萨奇病毒B组的引物和探针。

背景技术

柯萨奇病毒B组(coxsackieviruses B，CVB)均属于小RNA病毒科肠病毒属，共有6个家族成员，CVB1～6。它是一种大小约为30nm、核衣壳20面体立体对称、无包膜的单正链全长7.5kb左右RNA病毒。基因组仅有一个开放读码框以及2个非编码区(5'UTR和3′UTR)，开放读码框可以编码4个结构基因(VP1～VP4)和4个非结构基因(2A～2C和3A～3D)。

CVB一直在美国诊断实验室报告给CDC的最常见的15种肠道病毒列表之内，特别是在幼儿中有较高的感染发病率。虽然CVBs属于肠道类病毒并且其经粪口的传播方式，但是病毒并不会导致胃肠疾病。许多CVB感染症状是轻微的，通常只产生类似感冒的症状，但在免疫力低下的患者以及部分老人、幼儿中可引起严重疾病，比如病毒性心肌炎、肺炎、肝炎、胰腺炎和睾丸炎等。此外，CVB还能入侵中枢神经系统，能造成无菌性脑膜脑炎以及急性弛缓性麻痹，发病阶段出现发热、脑膜刺激症、头痛和畏光症等临床症状。临床诊断是根据病人临床表现并辅之与脑脊液实验室检测、脑电图、影像学CT和MRI共同评估。20世纪70年代，美国CDC上报的CVB感染临床综合症中，脑膜炎、脑炎和瘫痪分别占了56％、15％、1％。近20年来，世界范围内，均有大规模的肠道病毒暴发感染，引发神经系统病症以及脑膜脑炎的报道，并且CVB也是主要的感染源。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测科萨奇病毒B组的引物和探针，本发明建立了单管荧光PCR同时检测4种型别的科萨奇病毒，并应用于临床标本的检测。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明针对流行中的肠道病毒的序列进行比对和分析，设计出针对不同血清型特异的引物和探针。每种病毒检测时探针上对应不同的荧光标记，通过不同的荧光通道检测相对应的病毒，以此来实现分型

因此本发明要求保护一组检测柯萨奇病毒B组的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1～8所示。

以及，一组检测柯萨奇病毒B组的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO：9～12所示。

优选地，所述探针5’端和3’端有均标记有不同的荧光基团。

更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的探针，其5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光基团BHQ1。

更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的探针，其5’端标记有荧光基团Cy5，3’端标记有荧光基团BHQ3。

更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针，其5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光基团BHQ2。

更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的探针，其5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光基团MGB。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组1型(CVB1)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：1所示(CACTCACGGTCCGAATCRTCA)，其下游引物如核苷酸序列SEQ ID NO：2所示(TTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示(TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT)，其5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光基团BHQ1。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组2型(CVB2)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：3所示(ATCAGCATGTGTGTTTTACACGA)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(GCCTGTCTAACACTCACCTTC)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCA)，其5’端标记有荧光基团Cy5，3’端标记有荧光基团BHQ3。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：5所示(CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRT)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示(GAARGGTATRGACATGCGTG)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示(AAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC)，其5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光基团BHQ2。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组4型(CVB4)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：7所示(CAAATAATGTAYGTRCCRCCYGG)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示(TAYACCATGTTYTAYGAYGG)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示(GTGTGGCARACRTCCACYAACCCCAG)，其5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光基团MGB。

所述的引物中的一条或几条，和/或所述的探针中的一条或几条在制备柯萨奇病毒B组检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护一个柯萨奇病毒B组检测试剂盒，包括所述的引物中的一条或几条，和/或所述的探针中的一条或几条。

优选地，包括所述的引物和所述的探针。

更优选地，还包括逆转录反应的试剂和/或荧光定量PCR的试剂。

更优选地，所述荧光定量PCR的试剂为Vazyme 2×AceQ Mix。

更优选地，所述荧光定量PCR的体系为：Vazyme 2×AceQ Mix：10μl，所述的引物各0.25μl，所述的探针各0.25μl，cDNA：2μl，ddH₂O：5μl，总体系为20μl。

更优选地，荧光定量PCR的反应程序为95℃预变性，5min，1个循环；95℃变性，10s，55℃退火，30s，45个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过Real-time RT-PCR方法对肠道病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内，准确对流行中的肠道病毒CVB1、CVB2、CVB3和CVB4进行鉴定，对疑似感染样本进行确诊。本发明选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，实现单次检测即可对四种不同血清型的柯萨奇病毒进行分型鉴定，具有特异性强、灵敏性高、快速、操作方便、成本低廉等多种优点，适用于现场检测、早期诊断和流行病学检测研究等，对柯萨奇病毒B组感染疾病起到辅助和鉴别诊断作用。

附图说明

图1为利用CVB1型病毒特异性引物和探针进行Real-time PCR检测CVB1的荧光扩增曲线图，Ct值为20.83；以及阴性对照组扩增曲线图。

图2为利用CVB2型病毒特异性引物和探针进行Real-time PCR检测CVB2的荧光扩增曲线图，Ct值为21.18；以及阴性对照组扩增曲线图。

图3为利用CVB3型病毒特异性引物和探针进行Real-time PCR检测CVB3的荧光扩增曲线图，Ct值为22.58；以及阴性对照组扩增曲线图。

图4为利用CVB4型病毒特异性引物和探针进行Real-time PCR检测CVB4的荧光扩增曲线图，Ct值为20.73；以及阴性对照组扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

柯萨奇病毒CVB1到4毒株由本实验室所保存提供。

实施例1引物和探针的设计

1、实验方法

通过分别对所有GenBank数据库中已知的柯萨奇B组病毒的基因序列进行比对分析，设计出针对上述病原体检测的引物和探针。

2、实验结果

设计出用于检测和鉴定四种柯萨奇病毒B组的多重实时荧光定量PCR引物，可以同时检测和鉴定的对象包括柯萨奇病毒B组1型(CVB1)、柯萨奇病毒B组2型(CVB2)、柯萨奇病毒B组3型(CVB3)、柯萨奇病毒B组4型(CVB4)；

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组1型(CVB1)的引物，

其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(CACTCACGGTCCGAATCRTCA)，其下游引物如核苷酸序列SEQ ID NO：2所示(TTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示(TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT)，其5’端有荧光标记FAM，3’端有荧光标记BHQ1。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组2型(CVB2)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：3所示(ATCAGCATGTGTGTTTTACACGA)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(GCCTGTCTAACACTCACCTTC)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCA)，其5’端有荧光标记Cy5，3’端有荧光标记BHQ3。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：5所示(CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRT)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示(GAARGGTATRGACATGCGTG)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示(AAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC)，其5’端有荧光标记ROX，3’端有荧光标记BHQ2。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组4型(CVB4)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：7所示(CAAATAATGTAYGTRCCRCCYGG)，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示(TAYACCATGTTYTAYGAYGG)，以及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示(GTGTGGCARACRTCCACYAACCCCAG)，其5’端有荧光标记HEX，3’端有荧光标记MGB。

实施例2一种检测和鉴定四种柯萨奇病毒B组的试剂盒

一、组成

引物和探针、逆转录反应试剂(

II Q Select RT SuperMix forqPCR：)、荧光定量PCR试剂(Vazyme 2×AceQ Mix)，

其中，引物和探针包括：

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组1型(CVB1)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其下游引物如核苷酸序列SEQ ID NO：2所示，以及探针，其核苷酸序列如SEQID NO：9所示，其5’端有荧光标记FAM，3’端有荧光标记BHQ1。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组2型(CVB2)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：3所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，以及探针，其核苷酸序列如SEQID NO：10所示，其5’端有荧光标记Cy5，3’端有荧光标记BHQ3。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组3型(CVB3)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，以及探针，其核苷酸序列如SEQID NO：11所示，其5’端有荧光标记ROX，3’端有荧光标记BHQ2。

用于检测和鉴定柯萨奇病毒B组4型(CVB4)的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQID NO：7所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，以及探针，其核苷酸序列如SEQID NO：12所示，其5’端有荧光标记HEX，3’端有荧光标记MGB。

二、使用方法

1、提取样本的RNA

2、进行逆转录反应

(1)体系配置：使用Vazyme公司

II Q Select RT SuperMix for qPCR进行逆转录反应，配置反应组分如下：

(2)将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行RT-PCR，反应程序如下：

3、荧光定量PCR的反应

(1)体系配置：配制实时荧光定量PCR的反应体系，组分如下：

(2)将加好上述反应体系的反应管放于实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，反应程序如下：

三、结果判读

一次性鉴定出上述四种柯萨奇B组病毒。根据Ct值判断是否是肠道病毒阳性，每种对应不同的荧光标记，Ct值小于35的判断为阳性。

实施例3对阳性样本的检测

一、实验方法

1、样本的选择

使用实施例2的试剂盒对柯萨奇病毒B组1-4型的样品进行检测，进行病毒效价滴定(TCID50/ml)，TCID50即是组织细胞培养半数感染剂量，各组病毒株均以1TCID₅₀/ml的病毒量。利用灭活的病毒作为待测样品。

2、提取样本的RNA

利用QIAamp MinElute Virus Spin kit(Qiagen,Chatsworth,CA，catalog#74104)对咽拭子标本中病毒RNA进行提取，按照以下操作步骤进行：

本实施例使用的洗脱液1、洗脱液2、蛋白酶、吸附液以及洗脱柱均为试剂盒提供。第一次使用试剂盒时，需提前配置好洗脱液1，洗脱液2，向AW1的瓶中加入25ml乙醇，AW2的瓶中中加30ml乙醇；

(1)将25μl Qiagen Protease加入新的1.5ml离心管中，加入待测样品，混匀；

(2)向每管加入200μl吸附液，混匀后置于56℃加热15min；

(3)加热完成后每管加入250μl无水乙醇，混匀后室温放置5min。

(4)将混合液加入吸附柱中，离心弃去废液；

(5)加500μl洗脱液1到吸附柱内，离心弃去废液；

(6)加500μl洗脱液2到吸附柱内，离心弃去废液；

(7)加500μl无水乙醇到吸附柱内，离心弃去废液；

(8)将吸附放置于另一干净的收集管上，空离14000rpm，3min。

(9)将吸附柱样品用30μ洗脱并收集。

3、RNA纯度和浓度检测

取2μl RNA溶液，使用Nano Drop1000核酸蛋白定量仪，分别测定并计算出其260nm和280nm波长的吸光度值(absorbance density value,A)A260与A280的比值及RNA浓度，1.8≤A260/A280≤2.0表明纯度符合要求。根据所测得的浓度，全部RNA用无RNA酶的水稀释成终浓度为1μg/μl。

4、样本的检测

使用实施例2的试剂盒，按照实施例2的使用的方法进行检测和结果判定。

二、实验结果

各组反应对于柯萨奇病毒的核酸模板均出现相应的特异性荧光扩增曲线，相对应的其他病毒株模板均为阴性(图1到图4)，这显示了所建立的多重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性。

实施例4灵敏性评价

一、实验方法

使用实施例2的试剂盒检测不同浓度的柯萨奇病毒B组1-4型病毒。对柯萨奇病毒B组1到4型病毒进行病毒效价滴定(TCID₅₀/ml)，TCID₅₀即是组织细胞培养半数感染剂量。将病毒参考株10倍稀释成10^-2、10^-1、10⁰、10¹、10²、10³TCID₅₀/ml共6组稀释度，分别进行检测。

二、实验结果

结果显示登革病毒1-4型病毒的最低检出限分别达到0.12TCID₅₀/ml、0.24TCID₅₀/ml、0.15TCID₅₀/ml、0.17TCID₅₀/ml，这显示了所建立的多重实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性。

实施例5稳定性分析

一、实验方法

使用实施例2的试剂盒检测柯萨奇病毒B组1-4型病毒。对柯萨奇病毒B组1-4型病毒进行病毒效价滴定(TCID50/ml)，TCID50即是组织细胞培养半数感染剂量。将病毒参考株10倍稀释成10^-2、10^-1、10⁰、10¹、10²、10³TCID50/ml共6组稀释度，同时各取6个稀释度(10^-2、10^-1、10⁰、10¹、10²、10³TCID50/ml)平行进行单重实时荧光定量RT-PCR与多重实时荧光定量RT-PCR反应的检测比较，每个样品进行4次重复试验。

二、实验结果

结果显示对各稀释度样品的4次检测所获得的CT值变异系数均在0.8％以下。分别比较各组的单重与多重荧光定量RT-PCR检测结果，发现对各组病毒(柯萨奇病毒B组1型、柯萨奇病毒B组2型、柯萨奇病毒B组3型、柯萨奇病毒B组4型)单重实时荧光定量RT-PCR要比多重实时荧光RT-PCR方法的检测CT值平均分别小0.5、0.2、0.1、0.3。以上数据表明本研究建立的多重荧光RT-PCR方法具有较好的稳定性，相对各自单重荧光RT-PCR方法而言，多重方法各引物探针之间存在着一定干扰，但对结果影响不明显，因而多重方法可同时对各组病毒进行稳定、可靠的检测。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一组检测柯萨奇病毒B组的引物和探针

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactcacggt ccgaatcrtc a 21

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttytgagttr ttrgtgtatg tggcat 26

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcagcatgt gtgttttaca cga 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcctgtctaa cactcacctt c 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagtamcag ataaagtgga ttcrt 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaarggtatr gacatgcgtg 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaataatgt aygtrccrcc ygg 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tayaccatgt tytaygaygg 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcctgtgcc ggtctgcctg tgt 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacaccaaca gcaaaaatgc agcca 25

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtgtgttc tggacagagg gtaatgc 27

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgtggcara crtccacyaa ccccag 26

Claims

1.一组检测柯萨奇病毒B组的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～8所示。

2.一组检测柯萨奇病毒B组的探针，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：9～12所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针5’端和3’端有均标记有不同的荧光基团。

4.权利要求1所述的引物中的一条或几条，和/或权利要求2所述的探针中的一条或几条在制备柯萨奇病毒B组检测试剂盒中的应用。

5.一个柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物中的一条或几条，和/或权利要求2所述的探针中的一条或几条。

6.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。

7.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，还包括逆转录反应的试剂和/或荧光定量PCR的试剂。

8.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的试剂为Vazyme 2×AceQ Mix。

9.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的体系为：Vazyme 2×AceQ Mix：10μl，权利要求1所述的引物各0.25μl，权利要求2所述的探针各0.25μl，cDNA：2μl，ddH₂O：5μl，总体系为20μl。

10.根据权利要求5所述的柯萨奇病毒B组检测试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR的反应程序为95℃预变性，5min，1个循环；95℃变性，10s，55℃退火，30s，45个循环。