CN109777888A - 一种同时检测多种a组人类肠道病毒的引物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用。该引物组合包括：引物对1—4，其序列分别如SEQ ID No.1和2、SEQ ID No.4和5、SEQ ID No.7和8、SEQ ID No.10和11；还可包括检测探针，优选为特异探针1—4；引物对及特异探针分别用于检测A组人类肠道病毒CVA6、CVA10、CVA16、和/或EV71。本发明设计的特异性引物对1—4及探针1—4对于四型病毒CVA6、CVA10、CVA16和EV71可实现单重及多重特异性检测，其特异性强、灵敏性高、重复性及稳定性好，对于临床上可快速检测且分型，实现一检定型的效果。本发明具有很强的临床实践意义，使得临床治疗更加及时有效，同时对于手足口病的防控也有重要的意义。

Description

一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用，尤其涉及检测多种A组人类肠道病毒的试剂盒。

背景技术

人类肠道病毒(HEV)是一类在人类肠道繁殖的常见病毒。按血清型分为脊髓灰质类病毒(Poliovirus,PV 1-3型)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A型(CVA 1-22和24型)、柯萨奇病毒B型(CVB 1-6型)、埃可病毒(Echovirus，ECHO 1-7、9、11-27、29-33型)。随着分子生物学技术与生物信息学技术的应用，根据生物学及遗传特性，HEV被重新划分为A、B、 C、D共4个基因组，其中，HEV-A(A组人类肠道病毒)包括17个基因型，即CVA 2-8、 10、12、14、16、EV71、EV76、EV89-92。

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒感染而导致的一种良性自限性急性传染性疾病，多发于6岁以下儿童，其特征是发热、口腔黏膜溃疡、手足臀部斑疹或斑丘疹；个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎等并发症，致死、致残率很高，不仅影响患者的生存质量，而且占用耗费着极大的医疗卫生资源，财政支出巨大。HFMD曾在许多国家和地区多次流行，在我国，HFMD自1981年在上海出现以来，相继出现在北京、天津、福建等地。自从2008年3月份安徽阜阳出现疫情以来，几乎波及中国大陆所有省份和地区，在我国HFMD感染人数和死亡人数呈逐年上升趋势。自2012年起，在国内外很多地区HFMD的肠道病毒A组71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16) 不再是优势流行株。其他肠道病毒如柯萨奇病毒A组6型(CVA6)和柯萨奇病毒A组10型 (CVA10)所占比例越来越高。2008年，芬兰爆发了以CVA6和CVA10型为主的手足口病。 2010年法国手足口致病病原调查中，CVA6和CVA10型的比例大大超过EV71和CVA16。

柯萨奇病毒和EV71型手足口病临床症状很难区分，且多伴行爆发流行，故临床上急需一种可快速精确分型的检测方法，为临床上的个体化治疗提供了可靠的依据。目前对于肠道病毒的诊断方法有病毒分离培养法、血清学方法、以及普通的RT-PCR方法。而病毒培养法相对耗时且需要专门技术人员；血清学方法灵敏度相对较低；普通RT-PCR检测法易污染且只能定性检测。而荧光定量PCR技术具有灵敏性高、特异性强、便捷快速等特点，是目前较为理想的诊断技术。多重荧光定量PCR使用多条引物在一个反应管中进行多种核酸的扩增，实现多重病原体的同步检测，与常规RT-PCR(即普通PCR)相比，具有绝对的优势。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用，所述A组人类肠道病毒包括：CVA6、CVA10、CVA16和EV71。本发明具有特异性强、灵敏性高、重复性及稳定性好的特点，临床上对上述四种肠道病毒可进行快速检测且分型。

一方面，本发明提供了检测A组人类肠道病毒的引物对，所述引物对包括引物对1-4。

其中，引物对1可用于检测柯萨奇病毒A组6型(CVA6)，其上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；

引物对2可用于检测柯萨奇病毒A组10型(CVA10)，其上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示；

引物对3可用于检测柯萨奇病毒A组16型(CVA16)，其上游引物如SEQ ID No.7所示，下游引物如SEQ ID No.8所示；

引物对4可用于检测肠道病毒A组71型(EV71)，其上游引物如SEQ ID No.10所示，下游引物如SEQ ID No.11所示。

上述引物对1-4可分别单独使用，也可任意组合使用。在一个实施方式中，可同时使用引物对1-4构成引物组合，用于同时检测A组人类肠道病毒为柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(CVA10)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)和肠道病毒A组71型(EV71)。

在另外的实施方式中，可同时使用引物对1-4中的任三种、任两种组成引物组合，用于检测三种或两种A组人类肠道病毒；如，同时使用引物对1/2/3、1/2/4、1/3/4或2/3/4构成引物组合，同时使用引物对1/2、1/3、1/4、2/3、2/4或3/4构成引物组合用于检测相应的A组人类肠道病毒。优选的，可同时使用引物对1和引物对2构成引物组合，用于同时检测CVA6和CVA10；还可同时使用引物对3和引物对4构成引物组合，用于同时检测使用CVA16和EV71。

在一个实施方式中，本发明的引物对或引物组合还可与检测探针同时使用。优选的，所述探针包括：探针1，序列为SEQ ID No.3或其互补序列，可以与引物对1所扩增的目标序列进行杂交；探针2，序列为SEQ ID No.6或其互补序列，可以与引物对2所扩增的目标序列进行杂交；探针3，序列为SEQ ID No.9或其互补序列，可以与引物对3所扩增的目标序列进行杂交；探针4，序列为SEQ ID No.12或其互补序列，可以与引物对4所扩增的目标序列进行杂交。

在一个实施方式中，本发明的探针为Taqman探针，在探针的5’端修饰报告荧光基团，如FAM、HEX、Texas Red、或CY5等，在探针的3’端修饰与所述报告荧光基团相应的淬灭荧光基团，如BHQ1、BHQ2、或BHQ3等。优选的，本发明的探针1-4分别使用报告荧光基团HEX、CY5、Texas Red和FAM进行5’端修饰，对应的淬灭荧光基团分别使用BHQ1、BHQ3、 BHQ2和BHQ1进行3’端修饰。

另一方面，本发明的引物对或引物组合还可用于制备检测A组人类肠道病毒的试剂或试剂盒，或者用于制备检测由A组人类肠道病毒引起的疾病的试剂或试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为手足口病。

另一方面，本发明提供了用于检测A组人类肠道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一引物对，或由引物对构成的引物组合。

在一个实施方式中，本发明的试剂盒还包括检测探针；优选的，所述检测探针包括所述探针1-4。

在一个实施方式中，本发明的试剂盒还包括用于绘制标准曲线的系列标准品溶液、含 dNTP和Mg²⁺的qPCR反应预混液和DNA聚合酶。

在一个实施方式中，本发明用于绘制标准曲线的系列标准品溶液具体为系列质粒标准品溶液，浓度为10⁸-10⁰copies/μl的10倍梯度溶液。

在检测CVA6时，质粒标准品溶液中的质粒为引物对5在CVA6基因组cDNA上的目标片段克隆至质粒载体上获得的重组质粒；引物对5由SEQ ID No.13和14所示单链DNA分子组成；

在检测CVA10时，质粒标准品溶液中的质粒为引物对6在CVA10基因组cDNA上的目标片段克隆至质粒载体上获得的重组质粒；引物对6由SEQ ID No.15和16所示单链DNA分子组成；

在检测CVA16时，质粒标准品溶液中的质粒为引物对7在CVA16基因组cDNA上的目标片段克隆至质粒载体上获得的重组质粒；引物对7由SEQ ID No.17和18所示单链DNA分子组成；

在检测EV71时，质粒标准品溶液中的质粒为引物对8在EV71基因组cDNA上的目标片段克隆至质粒载体上获得的重组质粒；引物对8由SEQ ID No.19和20所示单链DNA分子组成。

所述质粒载体本发明使用T载体pMD19-TVector，也可为其它克隆载体。

本发明中含dNTP和Mg²⁺的qPCR反应预混液和DNA聚合酶具体为南京诺唯赞生物科技有限公司的Probe Master Mix和AceQ U。

本发明的引物对、引物组合可用于常规的PCR，也可以用于荧光定量PCR(qPCR)，从而制备成为相应的试剂或试剂盒。

另一方面，本发明还提供了同时检测多种A组人类肠道病毒的方法，所述方法包括利用本发明的引物对或引物组合对待测样品的核酸进行扩增的步骤；优选的，所述方法还包括利用检测探针对扩增产物进行杂交的步骤；更优选的，所述探针为上述探针1-4。

在一个实施方式中，本发明检测A组人类肠道病毒的方法包括：取待测样品提取总RNA，反转录获得cDNA，使用所述引物对1-4中的四种、任三种、任两种、或任一种、和与引物对1-4相对应的所述特异探针1-4，进行多重或单重荧光定量PCR，得到待测样品中含有A 组人类肠道病毒CVA6、和/或CVA10、和/或CVA16、和/或EV71的定性或定量检测结果。

在上述方法中，进行多重或单重荧光定量PCR时，同时对所述用于绘制标准曲线的系列标准品溶液进行检测。

在上述方法中，当进行单重荧光定量PCR时，反应体系为：含dNTP和Mg²⁺的qPCR反应预混液和DNA聚合酶10μl，引物浓度为10μM的引物对1或、2或3、或4 0.8μl，与引物对配套的特异探针0.2μl，模板DNA/cDNA 3-5μl，水补足至20μl；

当进行多重荧光定量PCR时，反应体系为：含dNTP和Mg²⁺的qPCR反应预混液和DNA聚合酶25μl，引物浓度为10μM引物对1或、2或3、或4 0.8μl，与引物对配套的特异探针0.4μl，模板DNA/cDNA 3-5μl，水补足至50μl。

在上述方法中，当进行单重或多重荧光定量PCR时，反应条件为：37℃，2min；95℃，10min；95℃，10s，57℃，20s，72℃，35s，40个循环。

本发明的有益效果如下：

实验证明，使用本发明提供的引物对及探针及其组合，进行荧光定量PCR时，对于CVA6、 CVA10、CVA16、EV71 4种病毒的质粒标准品的检测下限分别为：单重荧光定量PCR为4×10⁰copies/μl、4×10⁰copies/μl、5×10⁰copies/μl、3×10¹copies/μl；对于CVA6+CVA10、 CVA16+EV71两种组合的双重荧光定量PCR，为4×10¹copies/μl和4×10¹copies/μl、5×10¹copies/μl和3×10²copies/μl；四重荧光定量PCR，为4×10³copies/μl、4×10¹copies/μl、 5×10²copies/μl、3×10³copies/μl。

本发明设计的特异性引物对1—4及探针1—4对于四型病毒CVA6、CVA10、CVA16和EV71可实现单重及多重特异性检测，其特异性强、灵敏性高，重复性及稳定性好，对于临床上可快速检测且分型，实现一检定型的效果。本发明具有很强的临床实践意义，使得临床治疗更加及时有效，同时对于手足口病的防控也有重要的意义。

附图说明

图1为建立检测多种或一种A组人类肠道病毒的试剂盒及方法的技术路线。

图2为引物及探针设计前筛选的保守区。其中，图A为CVA6的保守区图，图B为CVA10的保守区图，图C为CVA16的保守区图，图D为EV71的保守区图。

图3为重组质粒PCR产物的凝胶电泳图。其中，M为2000bp的Mark，1为CVA6扩增条带，2为CVA10扩增条带，3为CVA16扩增条带，4为EV71扩增条带。

图4为单重荧光定量PCR的标准曲线。其中，图A为CVA6单重荧光定量PCR的标准曲线，图B为CVA10单重荧光定量PCR的标准曲线，图C为CVA16单重荧光定量PCR的标准曲线，图D为EV71单重荧光定量PCR的标准曲线。

图5为单重荧光定量PCR的特异性扩增曲线。其中，图A为CVA6的单重荧光定量PCR特异性扩增曲线，图B为CVA10的单重荧光定量PCR特异性扩增曲线，图C为CVA16的单重荧光定量PCR特异性扩增曲线，图D为EV71的单重荧光定量PCR特异性扩增曲线。

图6为单重荧光定量PCR灵敏性扩增曲线。其中，图A为CVA6单重荧光定量PCR灵敏性检测结果，图B为CVA10单重荧光定量PCR灵敏性检测结果，图C为CVA16单重荧光定量PCR灵敏性检测结果，图D为EV71单重荧光定量PCR灵敏性检测结果；图A—D 中的曲线1-9分别对应拷贝浓度分别为10⁸—10⁰copies/μl的相应病毒的质粒标准品。

图7为CVA6和CVA10的双重荧光定量PCR检测结果。其中，图A为CVA6双重荧光定量PCR灵敏度检测结果，图B为CVA10双重荧光定量PCR灵敏度检测结果，图A和B 中的曲线1-9分别对应拷贝浓度分别为10⁸—10⁰copies/μl的相应病毒的质粒标准品。

图8为CVA6及CVA10的双重荧光定量PCR标准曲线。其中，图A为CVA6的标准曲线，图B为CVA10的标准曲线。

图9为CVA16及EV71的双重荧光定量PCR的标准曲线。其中，图A为双重中CVA16 的标准曲线，图B为双重中EV71的标准曲线。

图10为CVA16和EV71双重荧光定量PCR检测结果。其中，图A为CVA16双重荧光定量PCR灵敏度检测结果，图B为EV71双重荧光定量PCR灵敏度检测结果，图A和B中的曲线1-7表示分别对应拷贝浓度分别为10⁶—10⁰copies/μl的相应病毒的质粒标准品。

图11为CVA6+CVA10+CVA16+EV71的四重荧光定量的标准曲线。其中，图A为CVA6 的标准曲线，图B为CVA10的标准曲线，图C为CVA16的标准曲线，图D为EV71的标准曲线。

图12为CVA6+CVA10+CVA16+EV71的四重荧光定量PCR检测结果。其中，图A为 CVA6四重荧光定量PCR检测结果，图B为CVA10四重荧光定量PCR检测结果，图C为 CVA16四重荧光定量PCR检测结果，图D为EV71四重荧光定量PCR检测结果，图A—D 中的曲线1-8分别对应拷贝浓度分别为10⁸—10¹copies/μl的相应病毒的质粒标准品。

图13为四重荧光定量PCR盲检结果。其中，曲线1为CVA16靶基因参考品的扩增曲线，曲线2为EV71靶基因参考品的扩增曲线，曲线3为CVA6靶基因参考品的扩增曲线，曲线4为CVA10靶基因参考品的扩增曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1所示，本发明的技术路线为：由GenBank数据库中下载各病毒基因VP1的序列，设计各病毒的荧光定量PCR的引物及探针，通过制备各病毒的质粒标准品，分别检测其特异性、灵敏性、重复性，并最终应该用所建立的多重荧光定量PCR的检测方法对临床样本进行检测。具体如下：

实施例一、单重及多重荧光定量PCR的检测方法建立

1、荧光定量PCR引物及探针设计

1.1高保守同源区序列的获取

从NCBI GenBank的检索获取2000年以来中国大陆的人肠道病毒71型EV71全长VP1基因5476条、柯萨奇病毒A6型CVA6的全长VP1基因1050条、柯萨奇病毒A10型CVA10 的全长VP1基因344条，柯萨奇病毒A16型CVA16的全长VP1基因1141条。经过生物信息学软件MUSCLE和Bioedit Entropy(H(x))plot进行序列比对分析，各找到一段高度保守的区域，CVA6的保守区位于VP1的200bp～800bp，CVA10的保守区位于VP1的50bp～550bp， CVA16的保守区位于VP1的200bp～740bp，EV71的保守区位于VP1的30bp～780bp，如图2 所示。

1.2引物及探针的设计

通过Primer Express和Primer Premier 5.0软件，根据相应的原则，设计4种A组人类肠道病毒(CVA6、CVA10、CVA16和EV71)标准品引物(即表2中的普通PCR引物)和用于实时荧光定量PCR的扩增引物及Taqman探针，通过NCBI Blast程序对所设计引物及探针的特异性进行在线的初步分析和确认后，使用DNAstar软件进行对四重荧光定量PCR检测组合引物及探针进行干扰性分析评价，尽量避免或减少引物自身及引物间二聚体的形成，最终确定四重引物及探针的组合，探针的两端分别采用FAM、HEX、Texas Red、CY5报告荧光基团和相应的BHQ1/BHQ2/BHQ3淬灭荧光基团标记。引物及探针的详细信息见表1，所设计引物及探针由上海生工合成。

表1、引物及探针序列

2.质粒标准品的制备

对4种A组人类肠道病毒(CVA6、CVA10、CVA16和EV71)分别进行质粒标准品的制备，方法如下：对病毒CVA6、CVA10、CVA16或EV71的RNA进行提取，逆转录合成cDNA，以该cDNA为模板，使用步骤1.2设计的标准品引物，进行PCR扩增，将扩增产物回收，与 T载体pMD19-TVector连接，得到重组质粒。对重组质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒进行拷贝数测定，并通过10倍梯度稀释得到10⁸—10⁰copies/μl的质粒标准品，用于分别制作标准曲线。

上述PCR扩增和鉴定为普通PCR，其引物序列如表2所示。

表2、普通PCR引物序列

普通PCR反应体系为在200μl PCR管中配制如下体系：

普通PCR反应条件为：95℃10min；95℃30s，54℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min。

对重组质粒进行PCR鉴定的结果为：CVA6、CVA10、CVA16、EV71四种病毒对应的重组质粒分别扩增得到大小约292bp、477bp、331bp、441bp，与预期结果一致(图3)。

3.单重荧光定量PCR检测

3.1标准曲线绘制

采用经优化的反应体系和条件，使用表1所示的引物和探针，对4种病毒各自10倍梯度稀释的质粒标准品分别进行单重荧光定量PCR的检测，每个浓度设置3个复孔，设置ddH₂O 做阴性对照。

以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标(X)，以复孔的平均Ct值为纵坐标(Y)，建立标准曲线。结果显示，阴性对照均无明显的扩增曲线，当质粒标准品浓度在10⁸—10¹copies/μl 区间时，反应体系的扩增效率均>90％，相关系数也均可达到0.99以上，且曲线具有良好的线性关系。以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板进行的各病毒单重荧光定量PCR检测标准曲线见图4。

单重荧光定量PCR反应体系为：

单重荧光定量PCR反应条件：37℃，2min；95℃，10min；95℃，10s，57℃，20s，72℃，35s,40个循环。

3.2单重荧光定量PCR的特异性、灵敏性、重复性实验

3.2.1特异性检测

用步骤3.1的单重荧光定量PCR方法，使用表1所示的一套引物-探针组合，分别对CVA6、 CVA10、CVA16、EV71、CVB3、CVB4、CVB5、CVA2阳性细胞培养上清核酸提取物经反转录合成的cDNA进行检测，结果显示，各引物-探针仅对自身的模板有特异性扩增，表1所示的4套引物-探针对之间均无明显的交叉反应，表明所设计的引物及探针具有良好的特异性，交叉验证的扩增见图5。

3.2.2灵敏性检测

将10倍梯度稀释的质粒标准品(10⁸～10⁰copies/μl)作为模板，分别进行单重荧光定量 PCR和普通PCR。结果显示，单重荧光定量PCR对于CVA6、CVA10、CVA16、EV71 4种病毒的质粒标准品的检测下限分别为4×10⁰copies/μl、4×10⁰copies/μl、5×10⁰copies/μl、 3×10¹copies/μl(见图6)。而普通PCR的检测下限分别为4×10¹copies/μl、4×10¹copies/μl、5×10¹copies/μl、3×10¹copies/μl。

3.2.3重复性检测

对10⁴—10¹copies/μl浓度的阳性质粒标准品进行3次重复检测，应用统计学软件SAS进行分析，结果显示其扩增曲线的Ct值差异均不显著，变异系数CV均小于5％，表明该方法具有较好的重复性及稳定性(见表3)。

表3、单重荧光定量PCR体系重复性检验

4.多重荧光定量PCR检测

在单重荧光定量PCR检测分析的基础上，对多重荧光定量PCR反应体系中探针及引物浓度比进行优化，并对其灵敏性、重复性进行评价。以10⁸-10⁰copies/μl的质粒标准品为模板进行荧光定量PCR的检测，反应体系为：

反应条件：37℃，2min；95℃，10min；95℃，10s，57℃，20s，72℃，35s,40个循环

4.1双重荧光定量PCR的灵敏性、重复性实验

4.1.1双重荧光定量组合CVA6+CVA10和CVA16+EV71灵敏性检测及标准曲线制作

以质粒标准品为模板，分别进行PCR CVA6+CVA10和CVA16+EV71的双重荧光定量的灵敏性检测。结果显示，对于CVA6+CVA10、CVA16+EV71两种组合病毒质粒标准品的检测下限分别为4×10¹copies/μl和4×10¹copies/μl、5×10¹copies/μl和3×10²copies/μl，相较于单重荧光定量PCR灵敏度，整体下降1个数量级，但仍具有较高的灵敏度(见图7-10)。

4.1.2双重荧光定量组合CVA6+CVA10和CVA16+EV71重复性检测

对10⁴—10¹copies/μl浓度的阳性质粒标准品进行3次重复检测，应用统计学软件SAS进行分析，结果显示其扩增曲线的Ct值差异均不显著，变异系数CV均小于5％，表明该方法具有较好的重复性及稳定性(见表4)。

表4双重荧光定量PCR体系重复性检验

4.1.3其它双重荧光定量组合的灵敏性、重复性实验

按照4.1.1和4.1.2的方法，以质粒标准品为模板，分别进行CVA6+CVA16、CVA6+EV71、 CVA10+CVA16、CVA10+EV71的双重荧光定量PCR检测。

结果：CVA6+CVA16的灵敏性可达到10⁰copies/μl，CVA6+EV71灵敏性可达到10¹copies/μl，CVA10+CVA16的灵敏性可达到10⁰copies/μl，CVA10+EV71的灵敏性可达到10¹copies/μl；且重复性实验中，扩增曲线的Ct值差异均不显著，变异系数CV均小于5％，重复性和稳定性均较好。

4.2三重荧光定量PCR的灵敏性、重复性实验

按照4.1.1和4.1.2的方法，以质粒标准品为模板，分别进行CVA6+CVA10+CVA16、CVA6+CVA10+EV71、CVA10+CVA16+EV71、CVA6+CVA16+EV71的三重荧光定量PCR检测。

结果：CVA6+CVA10+CVA16的灵敏性均为10¹copies/μl，CVA6+CVA10+EV71的灵敏性分别为10¹copies/μl、10¹copies/μl及10³copies/μl，CVA10+CVA16+EV71的灵敏性分别为10¹copies/μl、10¹copies/μl及10³copies/μl，CVA6+CVA16+EV71的灵敏性分别为10¹copies/μl、 10¹copies/μl及10³copies/μl。且重复性实验中，扩增曲线的Ct值差异均不显著，变异系数CV 均小于5％，重复性和稳定性均较好。

4.3四重荧光定量PCR检测的灵敏性、重复性实验

4.3.1四重荧光定量组合CVA6+CVA10+CVA16+EV71灵敏性检测

以质粒标准品为模板，分别进行四重荧光定量PCR CVA6+CVA10+CVA16+EV71灵敏性检测。结果显示，对于CVA6+CVA10+CVA16+EV71四种组合病毒质粒标准品的检测下限分别为4×10³copies/μl、4×10¹copies/μl、5×10²copies/μl、3×10³copies/μl。相较于单重荧光定量 PCR灵敏度，整体下降2-3个数量级，但仍具有较高的灵敏度。以10倍梯度稀释的标准品为模板进行的各病毒多重荧光定量PCR检测的灵敏度及标准曲线(见图12、11)。

4.3.2荧光定量组合CVA6+CVA10+CVA16+EV71重复性检测

对10⁴—10¹copies/μl浓度的阳性质粒标准品进行3次重复检测，应用统计学软件SAS进行分析，结果显示其扩增曲线的Ct值差异均不显著，变异系数均小于5％，表明该方法具有较好的重复性及稳定性(见表5)

表5四重荧光定量PCR体系重复性检验

4.3.3盲样考核

利用盲样对建立的用于肠道病毒的四重荧光定量PCR检测体系进行考核，5份样本中包括一份DEPC水，和4份阳性的靶基因参考品，利用所建立的多重检测方法进行筛查，结果显示如图13。图中显示为四重荧光定量PCR盲样考核的结果，图中相应通道仅扩增出相应的毒株序列存在交叉，且扩增可同时检测混合感染，可起到一检即可分型的目的。

实施例二、使用四重荧光定量PCR检测临床样本

使用通用荧光定量PCR以及实施例一建立的四重荧光定量PCR检测体系，对收集到的部分临床样本进行检测，具体如下：

采集自2017年的山东省济南市儿童医院51份脑脊液、39份血液、29份粪便和采集自 2017年山东省泰安市妇幼保健院的58份咽拭子。临床样本采用Trizol法提取RNA，经反转录为cDNA。

通用荧光定量PCR：即中国疾病防控中心的《肠道病毒实验室手册》所用的引物和探针，肠道病毒通用荧光定量PCR共检测出70份阳性样本，四重荧光定量PCR检测结果见表6。

采用通用荧光定量PCR只能检测出病毒是人类肠道病毒，但是，并无法对检测出的肠道病毒进行分型；采用本发明的四重荧光定量PCR进行检测，可以一次检测出不同类型的人类肠道病毒；如表6所示，采用四重荧光定量PCR检测出的阳性样本不仅高于通用荧光定量 PCR，并且还能对不同的病毒直接进行分型，对检测出的阳性样本进行测序，结果显示四重荧光定量PCR检测的结果均是正确的，没有出现假阳性结果。

表6样本检测结果

病毒类型	四重荧光定量PCR阳性结果
		EV71	32
CVA16	1
		CVA10	10
CVA6	36

注：已应用一代测序的方法，对四重荧光定量PCR阳性样本测序，证实其检测结果是正确的。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 泰山医学院

<120> 一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用

<141> 2017-12-14

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims (10)

1.一种用于同时检测多种A组人类肠道病毒的荧光定量PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括以下引物对：

引物对1：上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；

引物对2：上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示；

引物对3：上游引物如SEQ ID No.7所示，下游引物如SEQ ID No.8所示；

引物对4：上游引物如SEQ ID No.10所示，下游引物如SEQ ID No.11所示。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物对还可以与检测探针同时使用；优选的，所述检测探针包括以下探针：

探针1，序列为SEQ ID No.3或其互补序列；探针2，序列为SEQ ID No.6或其互补序列；

探针3，序列为SEQ ID No.9或其互补序列；探针4，序列为SEQ ID No.12或其互补序列；优选的，所述探针为Taqman探针；

更优选的，探针的5’端使用荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，探针的3’端使用BHQ1、BHQ2或BHQ3进行修饰。

3.权利要求1或2所述的引物组合在制备检测A组人类肠道病毒的试剂或试剂盒中的用途；或在制备检测由A组人类肠道病毒引起的疾病的试剂或试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为手足口病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述A组人类肠道病毒为柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(CVA10)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)和肠道病毒A组71型(EV71)。

5.一种同时检测多种A组人类肠道病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测探针；优选的，所述检测探针包括以下探针：

探针1，序列为SEQ ID No.3或其互补序列；探针2，序列为SEQ ID No.6或其互补序列；探针3，序列为SEQ ID No.9或其互补序列；探针4，序列为SEQ ID No.12或其互补序列；优选的，所述探针为Taqman探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端使用荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，探针的3’端使用BHQ1、BHQ2或BHQ3进行修饰。

8.根据权利要求5-7的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于绘制标准曲线的系列标准品溶液、含dNTP和Mg2+的PCR反应预混液和DNA聚合酶。

9.一种同时检测多种A组人类肠道病毒的方法，所述方法包括利用权利要求1的引物组合对待测样品的核酸进行扩增的步骤，所述A组人类肠道病毒为柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(CVA10)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)和肠道病毒A组71型(EV71)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用检测探针对扩增产物进行杂交的步骤；优选的，所述探针包括：

探针1，序列为SEQ ID No.3或其互补序列；探针2，序列为SEQ ID No.6或其互补序列；

探针3，序列为SEQ ID No.9或其互补序列；探针4，序列为SEQ ID No.12或其互补序列。