CN105039585A - 用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr检测的引物及含有该引物的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及含有该引物的检测试剂盒及其检测方法。包括用于扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）5′端非编码区保守序列的特异性引物对，其中所述的引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1或序列2或序列3所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列4或序列5或序列6所示的单链DNA。通过特异性、灵敏度、稳定性和重复性实验，证明该试剂盒只能特异性扩增IBV核酸，在1×102～1×107个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1。本发明适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV核酸的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于兽医微生物检测领域，涉及一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV核酸的定量检测。
背景技术
鸡传染性支气管炎(infectiousbronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病可以侵害鸡的气管、肾脏、输卵管和腺胃等组织，引起雏鸡死亡，产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降。IB的流行对养鸡业造成巨大的经济损失，严重制约了世界养禽业的发展。
IBV属于冠状病毒科的Gamma冠状病毒，其基因组因具有独特的先导引物转录机制，具有很高的错配率。在免疫接种程序、家禽饲养密度等因素的影响下，IBV正以不同的速度和不同的进化方向发生变异。由于不同血清型IBV毒株之间交叉保护力弱，这给IB的免疫预防带来了很大的困难。临床上IB与禽流感、鸡传染性喉气管炎、传染性鼻炎和新城疫等疾病的临床症状相似，给该病的快速诊断造成了困难。因此，建立方便、快速和准确的IBV检测方法成为预防和控制该病的关键。目前，检测IBV的常用方法有病毒分离、血清学试验和分子生物学方法如RT-PCR等。在这些方法中，反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）虽然具有灵敏度高、快速等优点，但不能实现对病毒的定量检测。虽然传统的鸡胚或气管环培养能用于病毒的定量，但这些技术都存在实验周期长、成本高、重复性差等缺点。随着分子生物学技术的飞速发展，近年来发展起来的实时荧光定量PCR技术，不但具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，还能实现对病毒的定量检测，对病毒的致病机理、免疫机理、防控效果的研究都具有重要意义。
建立荧光定量RT-PCR方法用于鸡传染性支气管炎病毒的定量检测方面，国内外已有不少研究。国内刘乔然等（刘乔然，刘胜旺.鸡传染性支气管炎病毒Real-timePCR方法的建立及其对感染鸡体内病毒的检测.中国预防兽医学报，2008，(08):637-641.）根据IBVLDT3毒株的N基因设计引物，建立了检测IBV核酸的SYBRGreenI荧光定量PCR方法，建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于传染性支气管炎的临床诊断。之后，磨美兰等（磨美兰，陈秋英，侯金莲等.鸡传染性支气管炎病毒real-timePCR检测方法的建立.中国兽医科学，2011，(02):193-198.）根据IBV基因组中N基因的保守区域设计引物，成功建立了检测IBV核酸的SYBRGreenIreal-timePCR检测方法，通过对人工感染组织样品中病毒核酸的检测，结果显示该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。王鹏等（王鹏，高峰，王园等.鸡传染性支气管炎病毒Real-timeRT-PCR检测方法的建立及应用.中国农学通报，2013，(08):45-49.）也根据IBV基因组中N基因的保守区域设计引物，建立了检测IBV核酸的SYBRGreenIreal-timePCR检测方法，对IBVM41株感染组织样品中的病毒核酸进行了定量检测。
上述文献中报道的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法，所采用的检测引物都是根据IBV结构蛋白基因N的基因序列设计，由于IBV基因组采用独特的先导引物转录机制，在新鲜组织等样品中病毒N基因序列的拷贝数理论上要高于IBV基因组的拷贝数，因此在检测新鲜组织样品时，采用N基因等结构基因设计的检测引物并不能真实反应IBV基因组的拷贝数。而IBV基因组5′端非编码区序列与病毒基因组的拷贝数存在一一对应的关系，本发明针对IBV基因组5′端非编码区保守区域设计引物建立荧光定量RT-PCR检测方法，能真实反应IBV基因组的拷贝数，适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV基因组的定量检测。
发明内容
本发明的针对上述缺陷，目的在于提供一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及含有该引物的检测试剂盒及其检测方法。
为此本发明采用的技术方案是：所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5′端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计而成。
所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：
引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’；或
5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’；或
5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’；
引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’；或
5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’；或
5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。
包含上述引物的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物对、SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水。
所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液：包含有SYBRGreenI、ROXReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。
所述的阳性对照包含有IBV基因组5′端非编码区保守序列的重组质粒。
一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的监测方法，按以下步骤进行：
1）阳性对照质粒的构建：
5′端非编码区序列的RT-PCR扩增：根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列设计引物，用于扩增其5′端非编码区片段；
将H120疫苗株接种于SPF鸡胚，后收获尿囊液；采用RNAisoPlus提取基因组RNA，反转录采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit，构建20μL的反应体系，以5R作为反转录引物进行反转录反应；
以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增，PCR反应采用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，构建50μL的反应体系；PCR产物经电泳检测后进行胶回收；
重组质粒的构建及鉴定：将上述胶回收的DNA片段用Taq酶进行加T处理后，连接到pMD18-T载体中，转化JM109基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆进行序列测定，筛选阳性对照质粒pMD5UTR；
2）标准曲线的建立和溶解曲线分析
提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至100～109拷贝/μL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线；扩增反应体系为：SYBRGreenI、ROXReferenceDye、ExTaqHSDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等10μL，pMD5UTR质粒2μL，浓度为10μmol/L的引物1和引物2各0.4μL，dH2O补足至20μL，扩增反应程序为：95℃30s，然后95℃5s，60℃20s进行40个循环，然后95℃30s，20℃/s，60℃30s，20℃/s，95℃30s，0.1℃/s进行溶解曲线分析。
所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：
引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’；或
5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’；或
5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’；
引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’；或
5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’；或
5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’；
所述5F：5’-gttgctggtatcactgcttgt-3’，5R：5’-GACCACTGGCATGCTGTT-3’。
所述1）步骤中：所述H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液；
PCR反应条件为：95℃，30s；52℃，30s；72℃，1min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。
所述2）步骤中：采用无内毒素质粒提取试剂盒提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量
本发明所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5′端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计多对引物，通过最终优化筛选获得。引物间和引物内无互补序列。
本发明的第二个目的是提供一种用于荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。
优选地，所提供的用于荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，由所述的引物对、SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水组成。
其中所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液，包含有SYBRGreenI、ROXReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。
其中所述的阳性对照，其特征在于含有IBV基因组5′端非编码区保守序列的重组质粒。
实验证明，本发明具有以下优点：
1）能快速定量样品中病毒基因组的拷贝数。该方法无需进行电泳，扩增反应仅需要40min，反应结果可以直接通过电脑观察；而常规的RT-PCR方法最少需要120min来完成扩增反应和结果观察，且无法定量。
2）操作简单，一次检测的样本量大。按照设定的程序和步骤制备反应管，PCR反应开始就在封闭的体系中完成扩增和实时检测，降低了污染的可能性。
3）灵敏度高。建立的SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR方法对样品中IBV的含量进行定量，能检测到限量为100个拷贝的含有IBV基因片段的阳性质粒，常规PCR为1000个拷贝，检测结果比常规PCR方法敏感。
4）特异性好。本发明提供的引物对于不含有IBV的检测样本均无扩增信号，具有良好的特异性。
附图说明
图1为构建阳性标准品时，5′端非编码区PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段的大小约为0.7kb。
图2是SYBRGreenI实时定量RT-PCR方法检测IBV的标准曲线。图中各点分别对应的模板浓度为1×102拷贝/μL，1×103拷贝/μL，1×104拷贝/μL，1×105拷贝/μL，1×106拷贝/μL和1×107拷贝/μL。
图3为SYBRGreenI实时定量RT-PCR方法检测IBV的溶解曲线。其中空白对照为H2O,阳性模板浓度分别为1×102拷贝/μL，1×103拷贝/μL，1×104拷贝/μL，1×105拷贝/μL，1×106拷贝/μL和1×107拷贝/μL。
图4为采用SYBRGreenI实时定量RT-PCR方法检测IBV在鸡胚中的生长曲线，分别测定18h、24h、30h、36h、42h、48h、60h和72h所收获尿囊液中毒株rH120-YZ株及其亲本毒株H120的病毒滴度。
具体实施方式
以下实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1本发明试剂盒中引物的设计和合成
根据GenBank中公布的IBV基因组序列（GenBank登录号为FJ807652），选择5′端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计引物，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列：
引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’
引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’；或
引物1：5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’
引物2：5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’；或
引物1：5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’
引物2：5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例2阳性对照质粒的构建
生物材料的准备：本发明所用的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120，购自中国兽药监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司；JM109基因工程菌、pMD18T载体购自大连宝生物工程有限公司。
5′端非编码区序列的RT-PCR扩增：根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列（GenBank登录号为FJ807652）设计引物，用于扩增其5′端非编码区片段，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为5F：5’-gttgctggtatcactgcttgt-3’，5R：5’-GACCACTGGCATGCTGTT-3’。将H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液；采用RNAisoPlus(大连宝生物工程有限公司)提取基因组RNA，反转录采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit(大连宝生物工程有限公司)，按照使用说明书构建20μL的反应体系，以5R作为反转录引物，37℃，30min反转录反应。以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增。PCR反应采用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase(大连宝生物工程有限公司)，按照产品说明书构建50μL的反应体系。反应条件为：95℃，30s；52℃，30s；72℃，1min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，片段的大小约为0.7kb，与理论值一致（图1）。
重组质粒的构建及鉴定：将上述胶回收的DNA片段用Taq酶进行加T处理后，连接到pMD18-T载体中，转化JM109基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆。将获得的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，筛选阳性对照质粒pMD5UTR。
实施例3SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR的建立
1、标准曲线的建立和溶解曲线分析
采用无内毒素质粒提取试剂盒（美国Omega公司）提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至100～109拷贝/μL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。扩增反应体系为：SYBRGreenI、ROXReferenceDye、ExTaqHSDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等10μL，pMD5UTR质粒2μL，浓度为10μmol/L的引物1和引物2各0.4μL，dH2O补足至20μL。扩增反应程序为：95℃30s，然后95℃5s，60℃20s进行40个循环，然后95℃30s，20℃/s，60℃30s，20℃/s，95℃30s，0.1℃/s进行溶解曲线分析。
标准曲线如图2所示，阳性对照模板浓度从1×102～1×107拷贝/μL具有良好的线性关系，各点基本在一条直线上。
溶解曲线如图3所示，从图中可以看出，溶解曲线只有单一的峰出现，表明为特异性的扩增反应，没有引物二聚体或其他非特异性的扩增。
2、IBV在鸡胚中的生长曲线测定
生物材料的准备：鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120，购自中国兽药监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司；传染性支气管炎病毒致弱株rH120-YZ，已于2013年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），其保藏编号为CGMCCNo.8501，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为InfectiousBronchitisVirus。
生长曲线的测定：将rH120-YZ株的种毒及H120的种毒，用PBS进行1∶1000倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各32枚。分别于接种后18h、24h、30h、36h、42h、48h、60h、72h收获尿囊液，采用荧光定量RT-PCR测定不同时间段的病毒滴度。结果如图4所示，毒株rH120-YZ株及其亲本毒株H120的病毒滴度在接种鸡胚30h后达到最高峰，然后逐渐下降。
Claims (9)
1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5′端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计而成。
2.根据权利要求1所述的一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：
引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’；或
5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’；或
5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’；
引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’；或
5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’；或
5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。
3.一种包含权利要求1或2所述引物的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物对、SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水。
4.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液：包含有SYBRGreenI、ROXReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。
5.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包含有IBV基因组5′端非编码区保守序列的重组质粒。
6.一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，按以下步骤进行：
1）阳性对照质粒的构建：
5′端非编码区序列的RT-PCR扩增：根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列设计引物，用于扩增其5′端非编码区片段；
将H120疫苗株接种于SPF鸡胚，后收获尿囊液；采用RNAisoPlus提取基因组RNA，反转录采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit，构建20μL的反应体系，以5R作为反转录引物进行反转录反应；
以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增，PCR反应采用高保真酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，构建50μL的反应体系；PCR产物经电泳检测后进行胶回收；
重组质粒的构建及鉴定：将上述胶回收的DNA片段用Taq酶进行加T处理后，连接到pMD18-T载体中，转化JM109基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆进行序列测定，筛选阳性对照质粒pMD5UTR；
2）标准曲线的建立和溶解曲线分析
提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至100～109拷贝/μL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线；扩增反应体系为：SYBRGreenI、ROXReferenceDye、ExTaqHSDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等10μL，pMD5UTR质粒2μL，浓度为10μmol/L的引物1和引物2各0.4μL，dH2O补足至20μL，扩增反应程序为：95℃30s，然后95℃5s，60℃20s进行40个循环，然后95℃30s，20℃/s，60℃30s，20℃/s，95℃30s，0.1℃/s进行溶解曲线分析。
7.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：
引物1:5’–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’或
5’–CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’或
5’–GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’
引物2:5’–CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’或
5’–TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’或
5’–GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’
所述5F：5’-gttgctggtatcactgcttgt-3’，5R：5’-GACCACTGGCATGCTGTT-3’。
8.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述1）步骤中：所述H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液；
PCR反应条件为：95℃，30s；52℃，30s；72℃，1min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。
9.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述2）步骤中：采用无内毒素质粒提取试剂盒提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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