CN102816863A

CN102816863A - 猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102816863A
Application number: CN 201110152527
Authority: CN
Inventors: 沈志强; 李安; 谢金文; 王金良; 郭显坡
Original assignee: Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co Ltd
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明提供一种适用于猪瘟病毒C株弱毒疫苗脾淋源和细胞源病毒含量定量检测的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其制备方法。10²拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增，在10⁷～10²拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线，适用于猪瘟弱毒疫苗成品及半成品的效价估测。本发明所使用的猪瘟病毒特异引物是在其高度保守的5’端非编码区(5’-UTR)设计合成的2条引物：P1(5′-GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3′)为猪瘟病毒特异性上游引物，P2(5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′)为猪瘟病毒特异性下游引物，预期扩增产物245 bp，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰。该方法只能检测CSFV，不与BVDV发生交叉反应。

Description

猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种适用于猪瘟兔化弱毒疫苗株脾淋源及细胞源病毒含量定量检测的方法及试剂盒。可以用于猪瘟兔化弱毒疫苗生产的实时监控和质量检测。

技术背景

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、高度接触性传染病，死亡率高达90％以上，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的动物疫病。目前该病主要流行于亚洲、欧洲、南美洲，在家猪和野猪中传播广泛，发达国家采取捕杀政策消灭猪瘟，给养猪业造成重大经济损失。

CSFV与其同属的牛病毒性腹泻病病毒和羊边界病病毒存在一定的抗原交叉性，而且后两种病毒也可自然感染猪，因此血清学诊断上不易将CSFV与其他两种瘟病毒相鉴别，尤其是近年来猪瘟流行方式和发病特点发生了很大变化，转变为隐性感染和亚病毒感染，给兽医临床诊断带来很大困难。目前，疫苗接种是预防控制猪瘟的重要手段，中国猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗以其具有的诱发免疫反应快、无残余毒力、免疫猪可抵挡猪瘟病毒强毒株攻击等特点，成为国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗，在国内外被广泛应用，对猪瘟的控制起到了重要作用。疫苗效价的高低是疫苗质量合格与否的关键指标，HCLV虽然可以在多种细胞上生长，但是病毒增值力相对较弱，不产生细胞病变，病毒滴度低，应用免疫荧光技术也较难检测到感染细胞中抗原的存在。对猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验一直沿用兔体定型热反应法，但该法存在的突出不足是不能准确定量、测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响、实验周期长、费时费力等。因此，如何快速、准确测定疫苗效价是猪瘟疫苗生产中面临的主要难题之一。近年来发展起来的实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。

发明内容

本发明提供一种适用于猪瘟兔化弱毒疫苗脾淋源和细胞源病毒含量定量检测的方法，该方法只能检测HCLV，不与BVDV发生交叉反应；本发明同时提供用该法制备检测试剂盒的方法，以及用前述方法制备的试剂盒。

本发明所使用的猪瘟病毒特异引物是对GenBank中登录的Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株猪瘟病毒基因组全序列进行比较分析后，在其高度保守的5’端非编码区(5’-UTR)设计合成，预期扩增产物245bp，具有高度特异性，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰，不与BVDV发生交叉反应。所述猪瘟病毒特异引物有2条，：其中P1(5’-GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3’)为猪瘟病毒特异性上游引物，P2(5’-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3’)为猪瘟病毒特异性下游引物，预期扩增产物245bp，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰。

本发明所使用的检测模板是以猪瘟病毒全基因组RNA经特异性下游引物P2反转录而成的cDNA，该模板碱基序列在猪瘟病毒基因组中高度保守且与牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)基因同源性低于3.5％，尤其是与引物互补结合的3’端基因组具有高度特异性。

本发明使用绝对定量方法，用于绘制标准曲线的标准品是目的片段经测序后，与克隆载体pMD18-T连接，构建的阳性重组克隆质粒pMD18-T-HCLV。

一种阳性重组克隆质粒，根据上述猪瘟病毒特异引物在其高度保守的5’端非编码区(5’-UTR)扩增的猪瘟病毒特异性核酸扩增片段245bp的阳性重组克隆质粒，测序结果经DNAStar分析，与GeneBank登录的猪瘟病毒序列相似率在99.6％以上。

利用前述检测引物可制备出猪瘟病毒定量检测试剂盒。

该猪瘟病毒定量检测试剂盒中含有，

上述检测引物，

上述阳性重组克隆质粒，

标准阳性猪瘟病毒基因组，

2×SYBR Green I Real-time PCR Master Mix；

RNA裂解液；

RNA酶抑制剂；

荧光定量反应液。

所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒可用于检测猪瘟病毒含量和猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。

本发明与传统兔体定型热反应法及同类产品相比具有以下优点：

1、准确度高：本发明试剂盒中的引物是猪瘟病毒特异性引物，与BVDV没有交叉反应，具有高度特异性，能真实准确地诊断猪瘟病毒含量。

2、灵敏度高、特异性强、重复性好：本发明所使用的检测模板是cDNA，不与其他猪源病毒发生交叉反应，有效克服了兔子个体反应性差异带来的误差，不但能快速对收获疫苗进行准确定量，而且能及时监控疫苗生产中细胞产毒情况、淘汰不合格批次。

3、成本较低：荧光定量检测所需样品量和试剂量较少，这相应的降低了疫苗的生产成本，也大大减少了对家兔等生物资源的浪费。

4、检测速度快：所需时间短。整个过程只需两个半小时左右。

5、方法简便：不需后续处理，没有电泳、照相、显色等过程，PCR反应闭管完成，勿需开盖，没有污染。

6、本发明所使用的荧光染料是SYBR Green I，该染料可嵌合于DNA双链结构的小沟中，当其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当其结合于双链DNA后荧光强度明显增强，可被荧光探测系统检测到，而且具有方法简便、成本较低等优势。

本发明检测试剂盒通过出现S形扩增动力曲线及单特异峰的样品可确诊为猪瘟病毒感染，克服了动物实验过程中测毒周期长、成本高、定量不准确等缺点。

附图说明

图1引物在猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组中的位置。

图2荧光定量PCR扩增结果电泳检测图谱。

其中：1.DL2000 DNA分子量对照；2.弱毒疫苗cDNA；3.空白对照.

图3荧光定量PCR扩增动力曲线图谱。

其中：1.弱毒疫苗cDNA；2.空白对照.。

图4特异性实验动力曲线图谱。

其中：1.弱毒疫苗株cDNA阳照；2.BVDV；3.PPV；4.PCV；5.PRV；6.PRRSV.7.空白对照。

图5敏感性实验动力曲线图谱。

其中：1、4.14×10⁷拷贝/L；2、4.14×10⁶拷贝/L；3、4.14×10⁵拷贝/L；4、4.14×10⁴拷贝/L；5、4.14×10³拷贝/L；6、41.4拷贝/L；7、4.14拷贝/L；8.空白对照.

图6标准曲线。

具体实施方式

首先，应用生物学软件DNAstar比对GenBank数据库中登录的CSFV Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株猪瘟病毒基因组全序列及BVDV序列，选择CSFV最保守的核苷酸序列，应用生物学软件Primer Premier 5.0设计出2条猪瘟病毒特异引物：P1(5′-GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3′)为猪瘟病毒特异性上游引物，P2(5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′)为猪瘟病毒特异性下游引物，扩增产物245 bp，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰。经特异性实验、敏感性实验、重复性实验后最终建立能够定量检测猪瘟疫苗病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法。

其次，病毒RNA的提取和反转录cDNA的合成：用TRIzol试剂参照使用说明书提取样品总RNA，用反转录酶M-MuLV参照使用说明书反转录合成cDNA。从疫苗样品原液中提取病毒总RNA，反转录合成模板cDNA，用上述引物进行荧光定量PCR反应，选择最优的PCR反应条件及程序。回收245bp的目的片端，与克隆载体pMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆菌株，用LB液体培养基培养后提取质粒，经PCR及BamH I和Hind III双酶切鉴定后对阳性质粒进行测序，构建重组克隆质粒pMD18-T-HCLV。该质粒用紫外分光光度计测定OD₂₆₀后，计算拷贝数，经荧光定量PCR检测后选择具有良好线性范围的质粒样品作为用于绝对定量的标准品。

最后，将猪瘟兔化弱毒脾淋苗和细胞苗按瓶签注明头份配制成1头份/mL的原液，同时进行荧光定量PCR检测和兔体定型热反应，比较两种实验结果，找出两者的相关性。

荧光定量PCR检测

25μL反应体系的组成：

荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸30s，86℃30s 40个循环；86℃时收集荧光。

结果判定：对猪瘟细胞苗而言，其疫苗半成品猪瘟病毒RNA在10⁸拷贝/mL以上的疫苗原液兔检结果为++或+-，可直接用来制造疫苗；其疫苗成品猪瘟病毒RNA在10⁸拷贝/mL以上的疫苗原液兔检结果为++或+-，表明疫苗效力检验合格；对猪瘟脾淋苗而言，其疫苗半成品猪瘟病毒RNA在10⁶～10⁷拷贝/mL；两只兔子均产生定型热反应，兔检结果为++，其疫苗半成品猪瘟病毒RNA为10⁶拷贝/mL的疫苗原液兔检结果为+-。猪瘟脾淋苗病毒RNA在10⁶～10⁷拷贝/mL以上；可直接用来制造疫苗；其疫苗成品猪瘟病毒RNA在10⁷拷贝/mL以上的疫苗原液兔检结果为++或+-，表明疫苗效力检验合格；

本发明中的试剂盒效果良好，可在实际生产中应用。

疫苗样品用荧光定量RT-PCR检测与标准检验方法兔体反应热法比较，两者有良好的相关性。

Claims

1.一种适用于猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株脾淋源和细胞源病毒含量定量检测的猪瘟病毒特异引物，其特征是以猪瘟病毒(CSFV)基因组高度保守且与牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)基因同源性低于3.5％的保守区设计而成，且与引物互补结合的3’端基因组具有高度特异性。

2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒特异引物，其特征在于所述引物有2条：其中P1(5′-GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3′)为猪瘟病毒特异性上游引物，P2(5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′)为猪瘟病毒特异性下游引物，预期扩增产物245 bp，荧光定量PCR反应呈现特征性S形扩增动力曲线，熔解曲线分析显示出现单特异峰。

3.一种阳性重组克隆质粒，其特征是根据权利要求2在其高度保守的5’端非编码区(5’-UTR)扩增的猪瘟病毒特异性核酸扩增片段245bp，测序结果经DNAStar分析，与GeneBank登录的猪瘟病毒序列相似率在99.6％以上。

4.一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒，其特征是检测试剂盒中含有：

(1)权利要求1或2所述的检测引物；

(2)权利要求3所述的阳性标准品；

(3)标准阳性猪瘟病毒基因组；

(4)2×SYBR Green I Real-time PCR Master Mix；

(5)RNA裂解液；

(6)RNA酶抑制剂；

(7)荧光定量反应液。

5.根据权利要求4所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒在检测猪瘟病毒含量和猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量上的用途。