CN101979667B - 同步检测单纯疱疹病毒i型和ⅱ型的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术。本发明由DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板PMD18-T-HSV1、标准阳性模板PMD18-T-HSV2和阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针。本发明特异性好，灵敏度高，定量准确；检测速度快；使用步骤简单，可重复性高；可同步检测单纯疱疹病毒I型和II型；可同时进行高通量的样品检测。本试剂盒可对单纯疱疹病毒I、II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

Description

同步检测单纯疱疹病毒I型和Ⅱ型的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒，适用于单纯疱疹病毒I型和II型同步定性定量检测。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起人类多种疾病的常见病原体。HSV有HSV1和HSV2两个亚型，两个亚型的核苷酸同源性达50％，而感染方式和临床表现却不相同。

HSV1主要通过口腔分泌物的接触而感染。人群感染率高达50％-90％，最常见的感染部位是口腔和唇，可引起原发感染，且可造成潜伏感染和复发。HSV1原发感染常引起口咽部疱疹、疱疹性角膜结膜炎、脑炎和皮肤疱疹性湿疹等；HSV1潜伏感染位于三叉神经节和颈上神经节部位，潜伏病毒可被激活转为增殖性感染，病毒沿感觉神经纤维轴索下行返回末梢，在局部上皮细胞内增殖，引起局部复发性疱疹。近年来随着口-生殖器性行为的增多，HSV1导致的生殖器疱疹正日益增多。

HSV2则主要通过性接触而感染。常潜伏在骶神经根区，可引起生殖器疱疹和新生儿疱疹，并与女性外阴癌和宫颈癌的发生有关；HSV2导致的生殖器疱疹容易复发，其复发比HSV1率高5-15倍，是引起人们性心理障碍的主要原因之一，可显著降低感染者的生活质量；HSV2是人类免疫缺陷病毒(HIV)性传播的重要协同辅助因素之一，其感染使HIV感染的危险性提高三倍；我国育龄妇女HSV2的感染率约为2.5％，孕妇感染HSV2后可导致流产、早产、胎儿先天异常和新生儿疾病等，严重影响人类优生优育。

因此准确及时地诊断和区分HSV1与HSV2对指导临床治疗、评估疾病的发展和预后具有重大意义。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此实时荧光定量PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

本试剂盒包括：DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV1标准阳性模板PMD 18-T-HSV 1、HSV2标准阳性模板PMD 18-T-HSV2和阴性质控标准品；

1、DNA提取液

DNA提取液组成：

提取液I：配制0.01M PBS(28.94g Na2HPO4·12H2O，2.6g KH2PO4·2H2O加入1000ml超净水混匀，调pH到7.4)；

提取液II：在pH7.4Tris-EDTA缓冲液(pH7.610mM Tris.HCL，pH8.01mMEDTA)中，按照1∶100比例加入NP-40混匀后完成配制，将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明管)内。分装量5ml/管。

2、荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针

单纯疱疹病毒I型(HSV1)：

1)正向引物为5′GACGCCATATCCACCACCTTC-3′，

反向引物为5′-TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3′；

2)荧光探针序列为5′-CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3′；

荧光探针5′端标记报告荧光基团HEX，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰

单纯疱疹病毒II型(HSV2)：

1)正向引物为5′GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3′，

反向引物为5′-TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3′；

2)荧光探针序列为5′-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3′；

荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse。

3、HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因-GB基因的139个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型高度保守基因GB基因79个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1包含的GB基因的核苷酸序列为

GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATMTTMGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATMA；

N：G或者T；M：C或者T。

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列为

GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGAGCAGGA。

4、阴性质控标准品

该阴性质控标准品为无菌双蒸水，用于阴性对照。

二、PCR试剂盒的制备和检测方法

PCR试剂盒的制备和检测方法包括下列步骤：

①配制DNA提取液；

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1和HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性。

应用DNA提取液提取未知检测样本得到DNA，后再取HSV1阳性定量标准品、HSV2阳性定量标准品和阴性质控标准品分别加入装有荧光定量PCR反应液的PCR反应管中，然后置于PCR荧光定量仪中进行反应；其中，以阳性定量标准品反应曲线作为标准对照，阴性质控标准品反应曲线作为阴性对照，以阳性定量标准品反应曲线判断阳性样本的浓度。从而判断未知样本的阴阳性及浓度。

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的同步快速定量检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对单纯疱疹病毒I型和II型的定量可通过与标准品的循环域值(CT，Threshold Cycle)相比较得出。CT值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，CT值与起始模数呈一定比例关系，CT值越小，起始模板数越多，相反，CT值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的CT值制成标准曲线，再根据待测样品的CT值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒中，针对单纯疱疹病毒I型和II型检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于单纯疱疹病毒I型和II型同步定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR方法，并研制出同步检测单纯疱疹病毒I型和II型荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10copies，可以满足快速诊断单纯疱疹病毒I型和II型的要求。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1、特异性好，灵敏度高，定量准确；

2、检测速度快，仅1.5小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；

3、使用步骤简单，可重复性高；

4、可同步检测单纯疱疹病毒I型和II型；

5、可同时进行高通量的样品检测。

本试剂盒可对单纯疱疹病毒I、II型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

一、关于制备和检测方法的实施例

1、试剂盒组成与配制

①DNA提取液

提取液I：配制0.01M PBS(28.94g Na₂HPO₄·12H₂O，2.6g KH₂PO₄·2H₂O加入1000ml超净水混匀，调pH到7.4)。

提取液II：在pH7.4Tris-EDTA缓冲液(pH7.610mM Tris.HCL，pH8.01mMEDTA)中，按照1∶100比例加入NP-40混匀后完成配制。将提取液II分装至5ml冻存管(有盖透明管)内。分装量5ml/管。

②荧光定量PCR反应液(50μl体系)

荧光定量PCR反应液包含：PCR 10×buffer 10.0μl，10μmol/L HSV1正向引物和反向引物各1.5μl，10μmol/L HSV2正向引物和反向引物各1.5μl，5μmol/L HSV1荧光探针1.0μl，5μmol/L HSV2荧光探针1.0μl，25mmol/L MgCl₂7.0μl，10mmol/L dNTPs1.0μl，2.5U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl，无菌双蒸水23.6μl，反应液总体积45μl。其中荧光探针为所示的核苷酸序列，HSV1荧光探针5′端标记HEX，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse；HSV2荧光探针5′端标记FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse。

③HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1

HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1是含有单纯疱疹病毒I型高度保守基因gB基因139个核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10⁹copies/ml，-20℃保存。贮存浓度为10⁹copies/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。

④HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2是含有单纯疱疹病毒II型GB基因79个核苷酸片段构成的PMD18-TCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10⁹copies/ml，-20℃保存。贮存浓度为10⁹copies/ml，使用前进行10倍梯度的系列稀释。

⑤将阳性标准模板系列稀释为10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml。

⑥阴性质控标准品

阴性质控标准品为无菌双蒸水。

二、关于试剂盒的应用实施例

1、使用试剂盒同步检测单纯疱疹病毒I型和II型

①在标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10000g离心10min，再重复洗涤1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，10000g离心2min，取上清液5μl做PCR反应。

②将阳性标准模板系列稀释为10⁸copies/ml、10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml。

③分别取荧光定量PCR反应液各45μl，取第①步所得HSV1DNA和第②步稀释的HSV1阳性标准模板各2.5μl，取第①步所得HSV2DNA和第②步稀释的HSV2阳性标准模板各2.5μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性300s；95℃10s，58℃40s，扩增40个循环。该双重试剂盒中HSV1所用的荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm；HSV2所用的荧光为ROX，其吸收波长588nm，发射波长608nm。

2、实验结果

荧光定量PCR反应结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：HSV1标准阳性模10⁸copies/ml、10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml的CT值分别为16.11，19.62，22.33，26.98，30.59，34.02；HSV2标准阳性模10⁸copies/ml、10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml的CT值分别为16.71，20.02，23.16，27.35，31.14，34.57；阴性对照为40。

反复重复试验3次，得到HSV2值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

从上述实例可以说明，此发明实时TaqMan荧光定量PCR检测体系，可以用于HSV1和HSV2的同步定量检测和快速鉴定。在提前处理好临床样品的前提下，实时TaqMan荧光定量PCR检测只需要花1.5小时，而常规PCR检测由于需要PCR产物凝胶电泳分析，大约需要4小时，培养法则需要数天时间。而且实时TaqMan荧光定量PCR在扩增的同时以闭管方式进行实时荧光信号监控与分析，从而降低了PCR产物交叉污染导致假阳性结果的可能性，大大加强了检测的特异性。TaqMan-MGB探针可以有效鉴别等位基因中单个碱基的变异。我们使用阳性对照标准株，临床分离株，阴性对照标准株来验证了该反应体系，实验结果均表现出极好的特异性。

用本发明的方法同步检测单纯疱疹病毒I型和II型具有快速简单、灵敏度高、特异性强的优点，具有更加重要的使用价值。

Claims (2)

1.一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括：

DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1、HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2和阴性质控标准品；

荧光定量PCR反应液含有单纯疱疹病毒I型和II型特异性引物对和荧光探针；

①单纯疱疹病毒I型-HSV1

正向引物为5′-GACGCCATATCCACCACCTTC-3′，

反向引物为5′-TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3′；

荧光探针序列为5′-CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3′；

荧光探针5′端标记报告荧光基团HEX，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse；

②单纯疱疹病毒II型-HSV2

正向引物为5′-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3′，

反向引物为5′-TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3′；

荧光探针序列为5′-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3′；

荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse；

HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1包含的GB基因的核苷酸序列为

GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGG

N：G或者T；M：C或者T；

HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列为

GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGAGCAGGA。

2.按权利要求1所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

①配制DNA提取液； 

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制HSV1标准阳性模板PMD18-T-HSV1和HSV2标准阳性模板PMD18-T-HSV2；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性。