CN111172323A

CN111172323A - 一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN111172323A
Application number: CN202010053051.6A
Authority: CN
Inventors: 胡明明; 张学增; 王义聪; 王玮; 李振红; 付光宇; 杨增利; 苗拥军
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阴性对照和阳性对照；PCR反应液1包括：HSV‑1型上游引物、下游引物、荧光探针；HSV‑2型上游引物、下游引物、荧光探针；DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dNTP，PCR缓冲物，PCR扩增增强剂，防腐剂，水；PCR反应液2包括醋酸锰、防腐剂、水。本发明操作方便，试剂2‑8℃保存，检测灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速。采用本发明试剂盒可以实现单管对单纯疱疹病毒1型和2型特异性DNA核酸片段同时进行分型荧光PCR定性检测，为诊断单纯疱疹病毒感染提供可靠的分子诊断依据。

Description

一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，特别涉及一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科α病毒亚科双链DNA病毒，根据抗原性不同分为1型和2型，即HSV-1和HSV-2，两型核苷酸序列有50％同源性。1型主要由口唇病灶获得，主要感染头部(眼、口、唇)的皮肤黏膜及躯干上部皮肤以及中枢神经系统，引起单纯疱疹性脑炎、疱疹性角膜炎、口腔疱疹性、皮炎等；HSV-2可从生殖器病灶分离到，主要引起生殖器部位的皮肤黏膜疱疹及新生儿感染。单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人群中感染极为普遍，潜伏和复发感染者较多。患者和带毒者是该病的传染源，可通过皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体。临床上对两种亚型感染的预后和处理方法不同，因此对HSV感染进行诊断和分型具有重要的临床意义和流行病学意义。

目前HSV检测包括病毒分离培养、血清学检测和分子诊断学方法。病毒分离培养主要是细胞培养检测；血清学检测包括抗体检测和抗原检测，主要使用化学发光法和酶联免疫法；分子诊断学方法包括基因测序及核酸检测方法。传统培养法特异性和敏感性高，但临床检测时间长(至少需要24-48h)，过程繁琐，且阳性率受到多种因素影响，不适用于大范围检测。血清学方法由于窗口期的存在，诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染，虽然特异性可高达95％，但是敏感性不够，检测率较低。基因测序具有成本昂贵、步骤复杂繁琐、耗时长等缺点，不适宜临床检测用。而核酸荧光PCR检测法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对感染作出早期诊断，适合临床筛查及诊断，同时给疫情的快速分析和控制提供了有力的技术支撑。研究显示，实时荧光PCR检测方法与标准的病毒培养方法在HSV检测的敏感性和特异性方面均能达到90％以上。因此，在国内采用实时荧光PCR技术进行HSV核酸检测是最快速、可靠的方法。

但是常规PCR荧光定量检测DNA扩增采用热启动Taq酶扩增体系，RNA扩增采用Taq酶和反转录Mlv酶扩增体系，二者选用的Buffer也不一样，两种扩增体系不能实现统一。在检测时间方面，DNA扩增需要约1.5h，RNA扩增需要约2h，耗时也较长。并且热启动Taq酶扩增试剂储存条件必须为-20℃保存，干冰或冰袋运输，有效期较短，在使用和运输过程中不便捷。现有的多重PCR技术仍存在检测特异性差、灵敏度低等缺点。另外扩增试剂使用外源性质粒作为内标，仅对提取和扩增的过程进行监控。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒。该试剂盒操作方便，试剂2-8℃保存，检测灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阴性对照和阳性对照；

PCR反应液1包括如下组分：

如SEQ ID NO：1所示的HSV-1型上游引物，如SEQ ID NO：2所示的HSV-1型下游引物，如SEQ ID NO：3所示的HSV-1型荧光探针；

如SEQ ID NO：4所示的HSV-2型上游引物，如SEQ ID NO：5所示的HSV-2型下游引物，如SEQ ID NO：6所示的HSV-2型荧光探针；

DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dNTP，PCR缓冲物，PCR扩增增强剂，防腐剂，水；

PCR反应液2包括：醋酸锰、防腐剂和水。

作为优选，PCR反应液1还包括内标引物和探针，内标引物和探针包括：如SEQ IDNO：7所示的人β-珠蛋白基因上游引物，如SEQ ID NO：8所示的人β-珠蛋白基因下游引物，如SEQ ID NO：9所示的人β-珠蛋白基因荧光探针。

作为优选，DNA聚合酶为rTth DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶为UDG酶，dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dUTP的组合，PCR缓冲物包括三(羟甲基)甲基甘氨酸和乙酸钾，PCR扩增增强剂由DMSO、Tween20和甘油组成，防腐剂为叠氮化钠。

作为优选，PCR反应液1中各组分浓度为：

优选地，PCR反应液1中各组分浓度为：

作为优选，三(羟甲基)甲基甘氨酸的pH值为7.0～9.0。

优选地，三(羟甲基)甲基甘氨酸的pH值为8.3。

作为优选，HSV-1型荧光探针5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ1；

作为优选，HSV-2型荧光探针5’端标记报告荧光基团ROX，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ2；

作为优选，人β-珠蛋白基因荧光探针5’端标记报告荧光基团Cy5，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ2。

作为优选，PCR反应液2中各组分浓度为：

醋酸锰 1～5mM；

防腐剂 0.05～0.2％。

优选地，PCR反应液2中各组分浓度为：

醋酸锰 3mM；

防腐剂 0.1％。

作为优选，PCR反应液1与PCR反应液2的体积比为(10～30)：(5～15)。

优选地，PCR反应液1与PCR反应液2的体积比为2∶1。

在本发明中，阳性对照为单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒，阴性对照为生理盐水。

作为优选，单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒的浓度为1×10⁵～5×10⁵copies/mL。

优选地，单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒的浓度为1×10⁵copies/mL。

本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阴性对照和阳性对照；PCR反应液1包括如下组分：如SEQ ID NO：1所示的HSV-1型上游引物，如SEQ ID NO：2所示的HSV-1型下游引物，如SEQ ID NO：3所示的HSV-1型荧光探针；如SEQ ID NO：4所示的HSV-2型上游引物，如SEQ ID NO：5所示的HSV-2型下游引物，如SEQ ID NO：6所示的HSV-2型荧光探针；DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dNTP，PCR缓冲物，PCR扩增增强剂，防腐剂，水；PCR反应液2包括：醋酸锰、防腐剂和水。本发明的有益效果包括：

(1)本发明针对HSV-1和HSV-2特异性靶标序列分别设计引物和不同荧光标记的探针，实现单管同时检测HSV-1和HSV-2并进行基因分型，由于检测波长不同且荧光信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性，操作检测，结果稳定可靠，并有效的降低了检测成本。

(2)本发明含有人类β-珠蛋白基因特异性引物探针，对男性尿道分泌物及女性宫颈分泌物样本采样、提取、荧光PCR检测全过程监控，克服提取过程中加入外标，不能有效监控样本采样成功与否的弊端，避免假阴性和由此造成的误诊。

(3)本发明PCR扩增增强剂不仅降低多重PCR扩增过程中的错配，PCR抑制物的干扰，提高多重PCR扩增的效率，灵敏度和特异性，提高了引物与模板退火延伸的速率，进而缩短了扩增循环中退火、延伸的时间，能够在50分钟内完成45个扩增循环数的荧光PCR检测，大大缩短了检测的时间。同时作为酶稳定剂，提高了DNA聚合酶保存的稳定性，实现PCR反应液的2-8℃稳定保存至少1年的效果。

(4)本发明扩增体系中UDG酶避免了因扩增产物污染导致的假阳性。

附图说明

图1a本发明试剂盒检测HSV-1型检测限参考品扩增曲线；

图1b本发明试剂盒检测HSV-2型检测限参考品扩增曲线；

图2a本发明试剂盒检测阴性参考品HSV-1的扩增曲线；

图2b本发明试剂盒检测阴性参考品HSV-2的扩增曲线；

图3a本发明试剂盒检测HSV-1阳性参考品的扩增曲线；

图3b本发明试剂盒检测HSV-2阳性参考品的扩增曲线；

图4a本发明试剂盒特异性实验HSV-1扩增曲线；

图4b本发明试剂盒特异性实验HSV-2扩增曲线；

图5a本发明试剂盒HSV-1精密度扩增曲线；

图5b本发明试剂盒HSV-2精密度扩增曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述的单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，包括PCR反应液、阴性对照和阳性对照，所述PCR反应液包括PCR反应液1和PCR反应液2，其中PCR反应液1包含引物、探针、DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、dNTP、PCR缓冲物、PCR扩增增强剂、防腐剂；所述DNA聚合酶为rTth DNA聚合酶，所述尿嘧啶DNA糖基化酶为UDG酶，所述dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dUTP的组合，所述PCR缓冲物包括三(羟甲基)甲基甘氨酸和乙酸钾，所述PCR扩增增强剂由DMSO、Tween20和甘油组成。PCR反应液2包含醋酸锰和防腐剂。阳性对照为单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒，阴性对照为灭菌生理盐水。

所述用于单纯疱疹病毒1型靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和检测探针是源于单纯疱疹病毒1型的保守区域gD的引物和探针，其序列分别为：

上游引物(SEQ ID No.1)：5’-AGACGTCCGGAAACAACCCTAC-3’；

下游引物(SEQ ID No.2)：5’-AACCTGACCATCGCTTGGTTTCGG-3’；

荧光探针(SEQ ID No.3)：5’-AACCTGACCATCGCTTGGTTTCGG-3’。

荧光探针5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ1。

所述用于单纯疱疹病毒2型靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和检测探针源于单纯疱疹病毒2型的保守区域gB的引物和探针，其序列分别为：

上游引物(SEQ ID No.4)：5’-CCAAGGTCACCAACATGGTTC-3’；

下游引物(SEQ ID No.5)：5’-GTCTCCGGCCTCGTCCTCG-3’；

荧光探针(SEQ ID No.6)：5’-AAGCGCAACAAAGCCAGGTACTCTC-3’。

荧光探针5’端标记报告荧光基团ROX，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ2。

所述试剂盒还包括内标，所述内标采用人β-珠蛋白进行基因扩增，既能监测临床取样过程又能监测样本核酸提取过程。所述试剂盒用于内标片段扩增的上、下游引物和用于检测内标的探针分别为：

上游引物(SEQ ID No.7)：5’-GAAGGCTCATGGCAAGAAAG-3’；

下游引物(SEQ ID No.8)：5’-CTCACTCAGTGTGGCAAAGG-3’；

荧光探针(SEQ ID No.9)：5’-CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG-3’。

荧光探针5’端标记报告荧光基团Cy5，3’端标记不发光的淬灭基团标记BHQ2。

所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物的浓度为0.2-1.0μM；所述检测探针的浓度为0.2-1.0μM。

所述用于内标片段扩增的上、下游引物的浓度为0.1-0.5μM；检测内标探针的浓度为0.1-0.5μM。

所述试剂盒包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒，其浓度为1×10⁵copies/mL-5×10⁵copies/mL；所述阴性对照为灭菌生理盐水。

所述PCR缓冲物中，三(羟甲基)甲基甘氨酸pH7.0-pH9.0、浓度10～100mM；乙酸钾浓度为50～150mM。

所述的PCR加速剂中，DMSO、Tween20与甘油的体积比为(1～20)∶(0.01～0.15)∶(1～20)。

所述PCR反应液1中其他成分浓度如下：0.25～1.25U/μL DNA聚合酶、0.01～0.1U/μL UDG酶、0.1～0.3mM dATP、0.1～0.3mM dGTP、0.1～0.3mM dCTP、0.2～0.6mM dUTP、0.05～0.2％防腐剂。

所述PCR反应液2中各成分的浓度如下：1～5mM Mn(OAc)₂、0.05～0.2％防腐剂。

所述PCR反应液1与PCR反应液2的体积比为(10～30)∶(5～15)。

本发明中涉及到的百分含量均为体积百分含量。

本发明提供的单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒如下：

1、20μL PCR反应液1

PCR反应液1各成分的浓度如下：

0.4μM单纯疱疹病毒1型正向引物、0.4μM单纯疱疹病毒1型反向引物、0.3μM单纯疱疹病毒1型探针；

0.4μM单纯疱疹病毒2型正向引物、0.4μM单纯疱疹病毒2型反向引物、0.24μM单纯疱疹病毒2型探针；

0.3μM人β-珠蛋白基因DNA正向引物、0.3μM人β-珠蛋白基因DNA反向引物、0.15μM人β-珠蛋白基因DNA探针；

0.5U/μL DNA聚合酶、0.05U/μL UDG酶、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.4mM dUTP、0.1％防腐剂-叠氮化钠。

50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(pH8.3)、100mM乙酸钾；

8％DMSO、0.05％Tween20、2％甘油。

2、10μLPCR反应液2

PCR反应液2各成分的浓度为：

3mM Mn(OAc)₂、0.1％防腐剂-叠氮化钠。

3、PCR反应液1与PCR反应液2的体积比为2∶1。

4、阳性对照：单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒，浓度为1×10⁵copies/mL；阴性对照：灭菌后的生理盐水。

实施例2

本实施例为采用实施例1制备的试剂盒检测男性尿道分泌物及女性宫颈分泌物等未知样本中的单纯疱疹病毒1型/2型DNA核酸的方法。

一、试剂准备

根据待测样本、阴性对照和阳性对照数量，按比例(20μL/人份PCR反应液1+10μL/人份PCR反应液2)取相应量的PCR反应液1、PCR反应液2，充分混匀成PCR-MIX混合液，瞬时离心后备用。

二、样本处理

1、将待测拭子放入1mL生理盐水中，涮洗10次，涮洗后液体备用；

2、取600μL涮洗后液体样本，配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂提取待测样本中单纯疱疹病毒1型/2型DNA核酸，备用；

3、同时取600μL阴/阳性质控品，配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂提取阴、阳性质控品DNA核酸，备用；

4、取PCR反应管若干，加入PCR-MIX混合液30μL，再分别加入提取的待测样本、阴/阳性质控品核酸产物各50μL，盖上管盖(去除气泡后)，瞬时离心10秒。

三、荧光PCR反应

1、将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称；

2、荧光检测通道选择：选择FAM通道检测HSV-1靶标；选择ROX通道检测HSV-2靶标；选择CY5通道检测内标；参比荧光设置为none；

3、荧光PCR反应条件见表1：

表1：荧光PCR反应条件：

PCR具体反应程序为：50℃ 2min；95℃ 2min；(95℃ 10s，60℃ 22s，45Cycle)；40℃ 10s。

四、结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线进行分析)，然后记录样本Ct值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值可以判断检测结果。对于测定Ct值≤38.00的样本，报告为阳性；对于测定Ct值＞38的样本、同时内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为小于检测限；对于测定无Ct值的样本、同时内标检测为阳性(Ct值≤40)，报告为阴性；若内标Ct值＞40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。

实施例3本发明试剂盒性能测定

1、灵敏度实验

配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂，采用实施例1制备的试剂盒，检测企业工作参考品，检测限参考品检出率＞95％。本试剂盒检测HSV-1和HSV-2检测限企业工作参考品各10例，图1a为本发明试剂盒检测HSV-1型检测限参考品扩增曲线；图1b为本发明试剂盒检测HSV-2型检测限参考品扩增曲线。

结论：根据检测结果显示，本发明试剂盒配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂，检测HSV-1和HSV-2企业检测限工作参考品各10例，扩增曲线均为标准“5”型曲线，其中HSV-1检测限10例全检出，检出率100％；HSV-2检测限10例全检出，检出率100％，说明本试剂盒灵敏度高。

2、准确性实验

配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂，采用实施例1制备的试剂盒，检测企业工作参考品，检测HSV-1/2阴性企业工作参考品N1-N99例，HSV-1阳性企业工作参考品P1-P55例，HSV-2阳性企业工作参考品P6-P105例，检测结果如下表2所示。

表2本试剂盒准确性检测结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

图2a所示为试剂盒检测阴性参考品HSV-1的扩增曲线；图2b所示为试剂盒检测阴性参考品HSV-2的扩增曲线；图3a所示试剂盒检测HSV-1阳性参考品的扩增曲线；图3b所示试剂盒检测HSV-2阳性参考品的扩增曲线。

结论：由图2a、图2b、图3a和图3b可知，本发明试剂盒配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂，检测HSV-1/2阴性企业工作参考品9例，HSV-1阳性企业工作参考品5例，HSV-2阳性企业工作参考品5例，各扩增曲线均为标准“S”型曲线，其中HSV-1/2阴性符合率100％，HSV-1阳性符合率100％，HSV-2阳性符合率100％，表明本试剂盒准确性高。

3、特异性实验

配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂进行特异性实验，与临床常见病原体：沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)、人巨细胞病毒(HCMV)、HPV-16、HPV-18、GBS、EBV无交叉反应，检测结果均为阴性。

图4a为本发明试剂盒特异性实验HSV-1扩增曲线；图4b为本发明试剂盒特异性实验HSV-2扩增曲线。

结论：检测结果显示，临床常见病原体沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)、人巨细胞病毒(HCMV)、HPV-16、HPV-18、GBS、EBV对HSV检测无交叉反应，证明本试剂盒特异性较高。

4、精密度实验

分别用3批次试剂盒检测HSV-1和HSV-2低值样本、中值样本和阴性样本，每个样本各检测10个重复。具体的检测结果如表3-表6和图5a、图5b所示，图5a所示为本发明试剂盒HSV-1精密度扩增曲线；图5b所示为本发明试剂盒HSV-2精密度扩增曲线。

表3：第1批试剂批内精密度检测结果统计

表4：第2批试剂批内精密度检测结果统计

表5：第3批试剂批内精密度检测结果统计

表6：批间精密度检测结果统计

实验表明：本发明试剂盒批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数＜5％。

5、稳定性实验

配合郑州安图生物工程股份有限公司磁珠法核酸提取试剂，采用实施例1制备的试剂盒，将PCR反应液1和PCR反应液2同时放置37℃加速，分别在0天、3天、7天、14天4个时间点检测低值、中值、阴性样本，每个样本每个时间点各检测10个重复，N1-N9阴性参考品、P1-P10阳性参考品、检测限参考品、阴阳性对照各1个重复。检测结果如表7所示：

表7本试剂盒加速稳定性结果统计

根据以上实验结果，按照阿伦尼乌斯公式计算，本发明实施例1制备的试剂盒37℃加速14天，可在2-8℃储存至少18-24个月。

6、对比研究

(1)检测灵敏度对比研究：

依据现有专利(201910019734.7)中的方案，配制成PCR反应液(方案1)，与本研究反应液(方案2)进行对比：HSV-1样本浓度1000copies/mL和500copies/mL、HSV-2样本浓度1000copies/mL和500copies/mL，采用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取或纯化试剂进行核酸的提取纯化，并用方案1和方案2配制的PCR反应液进行检测，各方案均重复检测20次，对比研究结果如表8和表9所示：

表8 HSV-1型检测灵敏度对比研究结果

表9 HSV-2型检测灵敏度对比研究结果

检测灵敏度对比研究结果表明，检测HSV-1和HSV-2样本浓度为500copies/mL时，本研究方案(方案2)均能够全部检出，检出率100％，现有专利(方案1)HSV-1和HSV-2均存在漏检，表明本发明HSV-1型和HSV-2型检测灵敏度均优于现有专利。

(2)储存温度对比：

本发明和对比产品1-武汉百泰基因工程有限公司单纯疱疹病毒1+2型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)和对比产品2-上海之江科技股份有限公司单纯疱疹病毒I、II型分型核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)储存温度对比见表10：

表10储存温度对比研究结果

结果表明：本发明储存温度2-8℃，对比产品1和2均需要冷冻保存，使用过程中需要复融，不便于使用、储存和运输，本发明2-8℃储存优于对比产品1和2。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒

<130> MP1927514

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agacgtccgg aaacaaccct ac 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacctgacca tcgcttggtt tcgg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacctgacca tcgcttggtt tcgg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaaggtcac caacatggtt c 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtctccggcc tcgtcctcg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcgcaaca aagccaggta ctctc 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggctcat ggcaagaaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcactcagt gtggcaaagg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttgaggttg tccaggtgag ccag 24

Claims

1.一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阳性对照和阴性对照；

所述PCR反应液1包括：

所述PCR反应液2包括：醋酸锰、防腐剂和水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液1还包括内标引物和探针，所述内标引物和探针包括：如SEQ ID NO：7所示的人β-珠蛋白基因上游引物，如SEQ IDNO：8所示的人β-珠蛋白基因下游引物，如SEQ ID NO：9所示的人β-珠蛋白基因荧光探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTthDNA聚合酶，所述尿嘧啶DNA糖基化酶为UDG酶，所述dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dUTP的组合，所述PCR缓冲物包括三(羟甲基)甲基甘氨酸和乙酸钾，所述PCR扩增增强剂由DMSO、Tween20和甘油组成，所述防腐剂为叠氮化钠。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液1中各组分浓度为：

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述三(羟甲基)甲基甘氨酸的pH值为7.0～9.0。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HSV-1型荧光探针5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团标记BHQ1；

所述HSV-2型荧光探针5’端标记报告荧光基团ROX，3’端标记淬灭基团标记BHQ2；

所述人β-珠蛋白基因荧光探针5’端标记报告荧光基团Cy5，3’端标记淬灭基团标记BHQ2。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液2中各组分浓度为：

醋酸锰 1～5mM；

防腐剂 0.05～0.2％。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液1与所述PCR反应液2的体积比为(10～30)∶(5～15)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒，阴性对照为生理盐水。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述单纯疱疹病毒1型和2型靶标序列质粒的浓度为1×10⁵～5×10⁵copies/mL。