CN114214395A - 一种提高基因检测准确性的核酸扩增方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高基因检测准确性的核酸扩增方法与试剂盒,它在反应体系中设计引入双内质控系统,即核酸扩增检测时同时使用内源性和外源性内质控、和靶基因一起扩增。本发明技术方案不仅能有效监测样本从采集、储运、到核酸提取和扩增反应全过程的操作,还能排查扩增试剂是否失效或者反应中是否存在扩增抑制物,起到全面监控检测结果假阴性的作用,提高了基因检测的准确性,在分子生物学研究和临床分子诊断中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高基因检测准确性的核酸扩增方法与试剂盒,属于生物技术领域。
背景技术
20世纪末以来,以聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)特别是荧光PCR为代表的基因检测技术,因为具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、实时快速、无污染的优点,在分子生物学和临床分子诊断领域得到大量的推广应用,包括分子生物学研究中的基因表达、单核苷酸多态性和基因突变分析等,临床分子诊断领域中的病原体检测、肿瘤基因检测、产品诊断等。
目前科研或临床应用时,基因扩增一般除了待检靶基因外,还有用于监测样本与核酸质量、以及反应体系的内质控。按其来源内质控通常分为外源、内源两类并择一使用,外源性内质控是人工添加的样品,通常选择人工合成的基因片段、无感染性的假病毒或病毒颗粒,它需要在样本处理前加入、参与核酸提取检测;内源性内质控是指待处理的样本中已经含有的质控基因,因此在样本处理时无需额外添加、可伴随样本采集而进入检测体系,对于人源样本一般选择人源性管家基因(House-keeping gene)作为内源性内质控。
外源性内质控相比内源性内质控多了一步在样本处理前加入的操作,有可能增加因为操作失误造成的结果异常,同时人工加入的外源质控品也无法监测样本采集和储运过程;但是外源性内质控因为人工构建和添加,可以构建和检测的病原体结构类似的假病毒模拟核酸提取过程,总体性能更为可控,并且适用于环境样本的检测。内源性内质控由于是样本中已经含有的基因,对于一些采集时难以通过肉眼判断样本是否采集到位的情形,采用内源性质控检测待检样本中的管家基因含量,可以确认是否采集到人源性样品;但是人基因组与病原体靶标在提取效率上有所差异,内源性内标并不能很好地评测病原体核酸的提取过程。基于两类基因扩增检测内质控的优缺点,在基因检测中如何设计和选择应用内质控,与内质控是否能监测结果假阴性、提高检测准确性的效果密切相关。此外,目前基因检测应用尤其是在临床分子诊断应用中也出现了对单个样本床旁检测(Point-of-caretesting,POCT)“样本进、结果出”的一体化检测的需求,当检测出现靶基因和内质控均无信号的结果时,如果试剂盒只有内源性或外源性内质控,便无法确认该异常结果是样本采集和运输、处理不当还是扩增试剂失效引起的,也就难以确定后续复检形式:是重新加剩余样本复测呢,还是需重新采集样本复检。
发明内容
本发明提供一种提高基因检测准确性的核酸扩增方法与试剂盒,其特征在于,所述核酸扩增方法与试剂盒中除了对靶基因的检测,还同时包括外源性内质控和样本来源的内源性内质控检测;所述的核酸扩增方法是指PCR或荧光PCR,或者是环介导等温扩增、转录介导扩增技术、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、支链核酸信号放大系统、滚环扩增反应。对于可以实现单管多重扩增检测的反应,例如PCR或荧光PCR,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别采用不同荧光波长检测;对于单管单重扩增检测的反应,例如环介导等温扩增,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别在不同的反应室中检测。本发明引入的含有内外源的双内质控的核酸扩增检测系统,能克服不使用或者使用单一类别内质控的缺点,它适用于不同类型的样本,能监测样本从采集、储运,到核酸提取和扩增反应全过程的操作,为检测结果无效的原因缩小排查范围,避免结果假阴性,提高了检测结果的准确性。
技术方案
通过对基因数据库公开的人内源性管家基因序列和病原体等常见靶基因序列的查询,用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列比对设计,优选了在动物和人源细胞组织中均存在的核糖核酸酶P(RNase P,RP)基因作为内源性内质控,优选了在动物和人源细胞组织、病原体中通常没有的绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein,GFP)作为外源性内质控,它们和靶基因同时扩增检测,通过分析三者检测数据综合判断样本检测结果,防止产生假阴性结果。核酸扩增方法是指PCR或荧光PCR,或者是环介导等温扩增、转录介导扩增技术、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、支链核酸信号放大系统、滚环扩增反应。对于可以实现单管多重扩增检测的反应,例如PCR或荧光PCR,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别采用不同荧光波长检测;对于单管单重扩增检测的反应,例如环介导等温扩增,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别在不同的反应室中检测。
对于荧光PCR扩增方法,靶基因、外源性内质控、内源性内质控可以实现单管扩增检测,三者的荧光探针报告基团标记不同波长的荧光染料。按照TaqMan荧光PCR设计的原则,本申请优选了一对内源性内质控基因特异性引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和一条荧光探针(SEQ ID NO:3)扩增RP基因保守区域序列片段,一对外源性内质控基因特异性引物(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)和一条荧光探针(SEQ ID NO:6)扩增GFP基因保守区域序列片段,6条引物和探针核苷酸序列(5’ -> 3’)如下:
内源性内质控基因上游引物:ggTgTTTgCAgATTTggACCTg,序列记为SEQ ID NO:1。
内源性内质控基因下游引物:CAACAACTgAATAgCCAAggTgAg,序列记为SEQ ID NO:2。
内源性内质控基因荧光探针:CTgACCTgAAggCTCTgCgCggAC,序列记为SEQ ID NO:3,其中探针5’端标记ROX(Carboxy-x-rhodamine)荧光基团、3’端标记BHQ(Black holequencher)淬灭基团。
外源性内质控基因上游引物:CgTCCATgCCgAgAgTgATC,序列记为SEQ ID NO:4。
外源性内质控基因下游引物:AgCAAAgACCCCAACgAgAAg,序列记为SEQ ID NO:5。
外源性内质控基因荧光探针:CggCggTCACgAACTCCAgCAgg,序列记为SEQ ID NO:6,其中探针5’端标记Cy5荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。
基于荧光PCR原理、含有内外源的双内质控的核酸扩增试剂盒的反应体系各成分组成如下:10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,0.2mM dNTPs(由dATP、dCTP、dGTP、dUTP混合组成),1.5~5 mM MgCl2,各0.1~0.5μM 内外源内质控、待检靶基因引物和荧光探针、1~5U Taq DNA聚合酶和0.01~1 U UNG酶,提取的模板10μl,总反应体积30μl。
含有内外源的双内质控的核酸扩增试剂盒包括反应缓冲液、外源性内质控,反应缓冲液由上述含有各成分的反应体系组成,外源性内质控为人工构建、培养的含有外源性内质控GFP基因的假病毒溶液。
表1 靶基因和内外源双内质控试剂盒检测结果和样本检测结果综合判断
说明:荧光PCR各波长检测Ct≤37判断为结果阳性(P),Ct>37或无数值(undet)判断为阴性(N)。
含有内外源的双内质控的核酸扩增试剂盒的使用方法:吸取检测样本,同时加入外源性内质控后进行核酸提取,获得的核酸模板用于扩增检测靶基因(A)、内源性内质控(B)、以及外源性内质控(C),最后通过分析三者检测数据综合判断样本检测结果(表1)。
本发明通过上述设计优选获得了含有内外源的双内质控的核酸扩增方法与试剂盒,本发明还提供了内、外源内质控基因扩增的引物探针,并优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序,也同样能实现检测的目的。
有益效果
本发明根据上述设计的含有内外源的双内质控的核酸扩增方法与试剂盒技术方案,其主要特点如下:
(1)设计的基因检测技术方案,同时含有内源性和外源性内质控,和靶基因一起扩增,能监测样本采集、储运、核酸提取和扩增反应全过程操作,评估是否出现误操作,防止结果假阴性,提高了基因检测准确性。
(2)设计的内外源的双内质控核酸检测系统,同时具有两者的优点并避免各自的缺点,还能排查扩增试剂是否失效或者扩增反应中可能存在的抑制物,缩小检测结果无效时原因的排查范围,避免由于检测结果不准确造成的误诊,提高了基因检测准确性。
(3)设计的内外源的双内质控核酸检测系统,适用于不同类型的样本,甚至是环境样本的检测,在分子生物学研究和临床分子诊断中具有广阔的应用前景。
(4)设计的内外源的双内质控核酸系统,特别适合单个样本分子POCT“样本进、结果出”的一体化检测的需求,提高了结果判断的准确性和检测效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1:含内外源双内质控的核酸检测引物探针的设计
本发明以荧光PCR检测新型冠状病毒(SAS-CoV-2,新冠病毒)为例进行技术方案的实施说明。首先,根据NCBI GenBank数据库中查询的人内源性管家基因序列和病原体等常见靶基因序列,优选了内源性内质控采用RP基因、外源性内质控采用GFP基因;然后基于荧光PCR原理,采用Vector NTI、Oligo等引物设计软件,优选获得的内外源双内质控检测引物探针序列(SEQ ID NO:1-6)如下所示(5’-->3’,包括探针荧光标记基团),新冠病毒引物探针(SEQ ID NO:7-12)采用国家CDC推荐的ORF1ab和N基因检测方案:
内源性内质控基因上游引物:ggTgTTTgCAgATTTggACCTg,序列记为SEQ ID NO:1。
内源性内质控基因下游引物:CAACAACTgAATAgCCAAggTgAg,序列记为SEQ ID NO:2。
内源性内质控基因荧光探针:CTgACCTgAAggCTCTgCgCggAC,序列记为SEQ ID NO:3,其中探针5’端标记ROX(Carboxy-x-rhodamine)荧光基团、3’端标记BHQ(Black holequencher)淬灭基团。
外源性内质控基因上游引物:CgTCCATgCCgAgAgTgATC,序列记为SEQ ID NO:4。
外源性内质控基因下游引物:AgCAAAgACCCCAACgAgAAg,序列记为SEQ ID NO:5。
外源性内质控基因荧光探针:CggCggTCACgAACTCCAgCAgg,序列记为SEQ ID NO:6,其中探针5’端标记Cy5荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。
新冠病毒ORF1ab上游引物:CCCTgTgggTTTTACACTTAA,序列记为SEQ ID NO:7。
新冠病毒ORF1ab下游引物:ACgATTgTgCATCAgCTgA,序列记为SEQ ID NO:8。
新冠病毒ORF1ab荧光探针: CCgTCTgCggTATgTggAAAggTTATgg,序列记为SEQ IDNO:9,其中探针5’端标记FAM荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。
新冠病毒N基因上游引物:ggggAACTTCTCCTgCTAgAAT,序列记为SEQ ID NO:10。
新冠病毒N基因下游引物:CAgACATTTTgCTCTCAAgCTg,序列记为SEQ ID NO:11。
新冠病毒N基因荧光探针:TTgCTgCTgCTTgACAgATT,序列记为SEQ ID NO:12,其中探针5’端标记JOE荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。
以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例2:含内外源双内质控的核酸检测试剂盒配制
试剂盒反应缓冲液为自行配制,按32人份/盒配制反应缓冲液(640μL)过程如下:吸取1000mM Tris-HCl (pH8.3) 9.6μL、500mM KCl 96μL、100mM dATP 1.92μL、100mM dGTP1.92μL、100mM dCTP 1.92μL、100mM dUTP 1.92μL、50mM MgCl2 67.2μL、5μM SEQ ID NO 1-6六条引物探针各28.8 μL、10μM SEQ ID NO 7-12六条引物探针各28.8μL、5 U/μL Taq酶12.8μL、5 U/μL 逆转录酶6.4μL、UNG酶16μL、水78.72μL,置于1.5mL离心管混匀。配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl,加入模板10μl后总反应体积为30μl。
试剂盒中外源性内质控为含有GFP基因的人工构建培养假病毒,培养灭活后的假病毒浓度为1x108 copies/ml,用生理盐水稀释到1.0x104 copies/ml使用。
试剂盒扩增程序为:50℃ 5min、95℃ 20sec后按照95℃ 5sec、60℃ 30sec循环扩增40次,循环步骤中60℃时采集FAM、JOE、ROX和Cy5四个波长荧光信号,按探针标记的荧光基团可知,FAM和JOE波长分别检测新冠病毒的ORF1ab基因和N基因,ROX和Cy5波长分别检测内源性和外源性内质控。
通过上述配制的新冠病毒荧光PCR检测试剂盒-20℃保存和运输。
实施例3:试剂盒在新型冠状病毒疑似样本中检测的应用
(1)样本处理
取临床收集的新型冠状病毒疑似患者鼻咽拭子样本10个(置于细胞保存液中)、北京康彻思坦生物技术有限公司的新型冠状病毒核酸(2019-nCoV RNA)质控品1个(S1,浓度为2.5E+04 copies/mL),先将S1用新冠病毒阴性样本稀释10倍、100倍(记为S1-1、S1-2,理论浓度为2.5E+03copies/mL、2.5E+02copies/mL),合计12个样本一起用于处理,核酸提取试剂采用复星诊断科技(上海)有限公司的核酸提取及纯化试剂(型号:通用型),每个样本吸取200μL、加入5μL外源性内质控一起进行核酸提取,获得的核酸模板用于荧光PCR检测。
(2)荧光PCR检测
将实施例2中试剂盒从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心,按20μL/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中,然后分别加入上述提取的12个样本核酸模板各10 μL。每个反应管体积为30μL,将上述反应管放到ABI7500Fast荧光PCR仪上,按照50℃反应5分钟,然后95℃保温20秒,再按 95℃5秒→60℃30秒 循环40次(在60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号)的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。
(3)结果分析
12个样本(10个临床样本,2个为已知浓度的康彻思坦2019-nCoV RNA质控品稀释样本)采用实施例2中的试剂盒检测获得了每个样本4个波长的检测Ct值,根据表1方法判断结果如表2,可知10个临床样本中1个为新冠病毒阳性、7个为新冠病毒阴性、2个结果异常(样本#6和#9);已知浓度的康彻思坦2019-nCoV RNA质控品稀释样本检测结果均为新冠病毒阳性,说明试剂盒检测性能较好、反应体系中引入的双内质控系统不影响靶基因检测。
两个结果异常的样本,其中样本#6检测双内质控均阴性,样本#9检测内源内质控阴性、外源内质控阳性,按表1结果判断标准均建议重新采集样本复检。将样本#6和样本#9重新采集样本后用本试剂盒复检,样本#6结果为双内质控和ORF1ab/N基因结果均为阴性,判断该样本为新冠病毒阴性;样本#9结果为双内质控和ORF1ab/N基因均阳性,判断该样本为新冠病毒阳性。
上述样本检测结果表明,本技术方案中设计的含内外源双内质控的核酸检测方法与试剂盒,双内质控能有效发挥检测基因检测假阴性结果的作用,适合在分子生物学研究和临床分子诊断中推广应用。
表2 双内质控的核酸检测试剂盒对新冠病毒样本检测结果
样本 | FAM | JOE | ROX | Cy5 | 综合判断样本结果 |
#1 | Undet | Undet | 26.11 | 25.60 | 新冠病毒阴性 |
#2 | Undet | Undet | 17.65 | 25.87 | 新冠病毒阴性 |
#3 | 28.93 | 29.16 | 20.65 | 25.71 | 新冠病毒阳性 |
#4 | Undet | Undet | 16.64 | 25.89 | 新冠病毒阴性 |
#5 | Undet | Undet | 22.18 | 25.38 | 新冠病毒阴性 |
#6 | Undet | Undet | Undet | Undet | 结果异常,建议采样复检 |
#7 | Undet | Undet | 26.44 | 25.76 | 新冠病毒阴性 |
#8 | Undet | Undet | 14.93 | 25.61 | 新冠病毒阴性 |
#9 | Undet | Undet | Undet | 25.45 | 结果异常,建议采样复检 |
#10 | Undet | Undet | 27.27 | 25.63 | 新冠病毒阴性 |
S1-1 | 29.42 | 29.34 | 24.28 | 25.66 | 新冠病毒阳性 |
S1-2 | 32.88 | 32.56 | 24.79 | 25.74 | 新冠病毒阳性 |
说明:荧光PCR各波长检测Ct≤37判断为结果阳性(P),Ct>37或无数值(undet)判断为阴性(N)。
序列表
<110> 上海星耀医学科技发展有限公司
复星诊断科技(上海)有限公司
<120> 一种提高基因检测准确性的核酸扩增方法与试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgtttgca gatttggacc tg 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacaactga atagccaagg tgag 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(25)
<223> b="ROX",d="BHQ"
<400> 3
bctgacctga aggctctgcg cggacd 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtccatgcc gagagtgatc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaaagacc ccaacgagaa g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(34)
<223> b="Cy5",d="BHQ"
<400> 6
bcggcggtca cgaactccag caggd 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(35)
<223> b="FAM",d="BHQ"
<400> 9
bccgtctgcg gtatgtggaa aggttatggd 30
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(32)
<223> b="JOE",d="BHQ"
<400> 12
bttgctgctg cttgacagat td 22
Claims (7)
1.一种用于基因检测的核酸扩增方法与试剂盒,其特征在于,所述核酸扩增方法与试剂盒中除了对靶基因的检测,还同时包括外源性内质控和样本来源的内源性内质控检测。
2.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,所述的核酸扩增方法是指聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应,或者是环介导等温扩增、转录介导扩增技术、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、支链核酸信号放大系统、滚环扩增反应。
3.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,所述的核酸扩增方法为荧光聚合酶链反应时,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别采用不同荧光波长检测。
4.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,所述的核酸扩增方法为环介导等温扩增、滚环扩增反应时,靶基因、外源性内质控、内源性内质控分别在不同的反应室中检测。
5.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,所述的扩增方法为荧光聚合酶链反应时,内源性内质控的一对引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、荧光探针为SEQ ID NO:3;外源性内质控的一对引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、荧光探针为SEQ ID NO:6。
6.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,试剂盒包括反应缓冲液和外源性内质控,其中反应缓冲液中含有检测靶基因、外源性内质控、内源性内质控的扩增引物和探针以及其它扩增反应组分,外源性内质控为人工构建的含有外源性内质控基因的假病毒溶液。
7.如权利要求1所述的方法与试剂盒,其特征在于,试剂盒使用时吸取检测样本,同时加入外源性内质控后进行核酸提取,获得的核酸模板用于扩增检测靶基因、内源性内质控、以及外源性内质控,最后通过分析三者检测数据综合判断样本检测结果。
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Citations (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030104438A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-06-05 | Eyre David J. | Real-time gene quantification with internal standards |
CN101331237A (zh) * | 2005-12-21 | 2008-12-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于核酸测试的对照 |
CN101613730A (zh) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于预防核酸扩增技术中遗留污染的改良方法 |
CN102559875A (zh) * | 2010-12-17 | 2012-07-11 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于对照核酸的通用基质 |
CN105705659A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-06-22 | 赛卢拉研究公司 | 大规模平行单细胞分析 |
CN107227363A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-10-03 | 上海赛安生物医药科技股份有限公司 | Ercc1基因多态性检测体系及其试剂盒 |
WO2018039599A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
CN109593887A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒 |
CN111172323A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-19 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒 |
CN111621604A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-04 | 上海五色石医学研究股份有限公司 | 一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法 |
CN111926117A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-13 | 上海交通大学 | SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法 |
CN112553373A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-26 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 |
CN112852930A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-05-28 | 湖北伯远合成生物科技有限公司 | 一种抗干扰pcr的方法 |
US20210207204A1 (en) * | 2018-05-31 | 2021-07-08 | Hong Jiang | Directional polymerisation fluorescent probe pcr and test kit |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111657392.5A patent/CN114214395A/zh active Pending
Patent Citations (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030104438A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-06-05 | Eyre David J. | Real-time gene quantification with internal standards |
CN101331237A (zh) * | 2005-12-21 | 2008-12-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于核酸测试的对照 |
CN101613730A (zh) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于预防核酸扩增技术中遗留污染的改良方法 |
CN102559875A (zh) * | 2010-12-17 | 2012-07-11 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于对照核酸的通用基质 |
CN105705659A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-06-22 | 赛卢拉研究公司 | 大规模平行单细胞分析 |
WO2018039599A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
CN107227363A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-10-03 | 上海赛安生物医药科技股份有限公司 | Ercc1基因多态性检测体系及其试剂盒 |
US20210207204A1 (en) * | 2018-05-31 | 2021-07-08 | Hong Jiang | Directional polymerisation fluorescent probe pcr and test kit |
CN109593887A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒 |
CN112852930A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-05-28 | 湖北伯远合成生物科技有限公司 | 一种抗干扰pcr的方法 |
CN111172323A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-19 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒 |
CN111621604A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-04 | 上海五色石医学研究股份有限公司 | 一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法 |
CN111926117A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-13 | 上海交通大学 | SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法 |
CN112553373A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-26 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KULYYASSOV, A.: "Synthetic construct enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene, partial cds", GENBANK, pages 443913 * |
李爱云等: "戊型肝炎病毒一步法多重荧光定量PCR分型鉴定技术的建立及应用", 中国预防兽医学报, vol. 40, no. 11, pages 1020 - 1025 * |
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