CN113897422A - 一种用于检测致病毛霉菌的多重pcr引物探针组和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测致病毛霉菌的多重pcr引物探针组和试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明涉及毛霉菌检测技术领域，公开了一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。该引物探针组包括引物组和探针组，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明的引物探针组和试剂盒能实现米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉在种水平的同步检测，检测速度快，且检测特异性和准确度高。

Description

一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒
技术领域
本发明涉及毛霉菌检测技术领域，即一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。
背景技术
毛霉菌病是一种新兴的由毛霉菌丝状真菌引起的严重感染性疾病，其发展快速，死亡率高，主要影响免疫功能低下的患者和糖尿病患者。在真菌感染中，毛霉菌发病率占8.3％～13％，仅次于假丝酵母菌和曲霉菌。近年来，毛霉病在高危人群中的发病率上升，在恶性肿瘤及器官移植患者中约为1％。毛霉病的发病率在免疫缺陷患者常见深部真菌感染中占第二位。据报道，毛霉菌病在美国和法国的发病率在2000年至2010年期间每年增加约7％，而死亡率则每年增加9.3％。在西班牙，该疾病的发病率从2005年的0.62例/10万人增加到2007年至2015年的3.3例/10万人。毛霉病在发展中国家的检出也越来越频繁，特别是在印度、中国和拉丁美洲国家。在印度，它的发病率达14例/10万人。毛霉病感染进展迅速，大多病情凶险，180天内死亡率为56.7％，死亡率较高，且死亡时间大多在1月以内。毛霉病因为临床表现不典型，诊断较困难。经过文献统计，米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉属于临床感染毛霉病较多检出的几种毛霉菌。
毛霉病的常规检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测。其中，痰培养检测的特异性差，且培养时间较长；影像学检测时，真菌感染病灶的形态缺乏特异性，会给诊断造成一定困难。毛霉菌的分子生物学检测主要包括核酸扩增检测技术，其中，多重qPCR技术能同步检测多种毛霉菌，缩短检测时间，但其对引物和探针的特异性要求较高，引物和探针的设计难度较大，非目标菌易对目标菌的扩增和检测产生干扰，目标菌之间也会存在相互干扰。受限于以上的条件，目前毛霉菌的分子生物学检测多局限在属水平，种水平的检测较为罕见。
专利CN112725508A公开了用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途，该试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中，所述通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。采用该试剂盒，虽然能够实现对多种毛霉真菌的一次性检测，但由于引物是针对于多种毛霉菌的共有基因保守区设计的，特异性较差，在检测过程中易受到非目标菌(特别是同属的非致病毛霉菌)的干扰。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。本发明的引物探针组和试剂盒能实现米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉在种水平的同步检测，检测速度快，且检测特异性和准确度高。
本发明的具体技术方案为：
一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组，包括引物组和探针组，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
作为优选，所述探针组包括：用于检测米根霉的探针，序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测微小根毛霉的探针，序列分别如SEQ ID NO.8所示；用于检测伞枝横梗霉的探针，序列如SEQ ID NO.9所示。
采用本发明的引物探针组，能对毛霉病的主要3种致病毛霉菌(米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉)进行种水平的同步检测，引物和探针的特异性高，能避免非目标菌(特别是同属非致病毛霉菌)的干扰以及目标菌之间的相互干扰，防止非特异性扩增，从而提高检测准确度。
作为优选，所述引物组还包括：用于检测内参基因GAPDH的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述探针组还包括：用于检测内参基因GAPDH的探针，序列如SEQ ID NO.12所示。
通过设置内参照质控，监测核酸提取和荧光PCR过程，能够尽量避免临床检测污染(假阳性)的发生，使检测结果更加准确可靠。
一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR试剂盒，包括所述的引物探针组。
本发明的试剂盒能用于临床样品的检测，有助于查清病原体，对毛霉病的治疗给予一定的指导；此外还能检测水样、食物等是否受到致病毛霉菌污染，预防致病毛霉菌经口摄入后感染人体。
作为优选，所述试剂盒还包括：PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶。
作为优选，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的3种探针分别带有3种不同的荧光标记。
作为优选，所述试剂盒还包括：阴性对照品、阳性对照品和内参照；所述阴性对照品为无核酸酶污染的去离子水；所述阳性对照品为含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉DNA片段的质粒，所述DNA片段包含三种菌对应引物的扩增片段；所述内参照为人组织DNA样本。
一种所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)对待测样品进行DNA提取，获得核酸样本；
(2)将引物探针组、PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶配制成PCR反应液，将核酸样本加入PCR反应液中，获得PCR反应体系；
(3)对PCR反应体系进行多重qPCR扩增。
作为优选，步骤(2)中，所述PCR反应液中，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的上游引物和下游引物的浓度均为0.3～0.4μmol/L，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针的浓度分别为0.9～1.2μmol/L、0.3～0.4μmol/L和0.6～0.8μmol/L。
将引物浓度控制在上述范围内，可使得三种菌扩增结果的对应通道Ct值达到较低值且扩增曲线清晰。
作为优选，步骤(3)中，所述多重qPCR扩增的反应程序如下：50～55℃预热5～6min；90～95℃预变性8～10min；90～95℃变性15～20s，60～65℃退火和延伸55～60s，40～45个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的引物探针组能实现3种主要致病毛霉菌(米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉)种水平的同步检测，特异性高，检测准确度高；
(2)本发明的试剂盒检测快速，整个检测过程仅需3小时左右，且检测灵敏度高，可用于DNA样品、临床样本中毛霉菌种的检测。
附图说明
图1为米根霉的单重qPCR扩增曲线；
图2为微小根毛霉的单重qPCR扩增曲线；
图3为伞枝横梗霉的单重qPCR扩增曲线；
图4为内参照的单重qPCR扩增曲线；
图5为米根霉的多重qPCR扩增曲线；
图6为微小根毛霉的多重qPCR扩增曲线；
图7为伞枝横梗霉的多重qPCR扩增曲线；
图8为实施例6中临床样本检测的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：试剂盒及使用方法
Figure BDA0003218348870000041
一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR试剂盒，包括：PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、尿嘧啶-N-糖基化酶和引物探针组。
所述引物探针组包括以下3对上下游引物和3个探针：
1)用于检测米根霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.7所示；该探针采用FAM标记；
2)用于检测微小根毛霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8所示；该探针采用ROX标记；
3)用于检测伞枝横梗霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示；该探针采用HEX标记。
上述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)对待测样品进行DNA提取，获得核酸样本；
(2)按照表1，配制PCR反应液，再将核酸样本加入PCR反应液中，获得PCR反应体系；
(3)按照表2中的反应程序，对PCR反应体系进行多重qPCR扩增；
(4)根据多重qPCR扩增结果，判断待测样品中是否含有3种致病毛霉菌，具体方法如下：当某种致病毛霉菌的无Ct值时，该致病毛霉菌为阴性；当某种致病毛霉菌的Ct值≤38时，该致病毛霉菌为阳性；当某种致病毛霉菌的Ct值大于38且小于等于3840时，建议重复检验确认。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003218348870000051
1Probe mix：采用康为GoldStar Probe Mixture(UNG)试剂盒配制(含有PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、尿嘧啶-N-糖基化酶)。
表2 PCR反应程序
Figure BDA0003218348870000052
实施例2：试剂盒及使用方法
一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR试剂盒，包括：PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、引物探针组、阴性对照品、阳性对照品和内参照。
所述引物探针组包括以下4对上下游引物和4个探针：
1)用于检测米根霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.7所示；该探针采用FAM标记；
2)用于检测微小根毛霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8所示；该探针采用ROX标记；
3)用于检测伞枝横梗霉的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示；该探针采用HEX标记；
4)用于检测内参基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针，序列分别如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；该探针采用Cy5标记。
所述阴性对照品为无核酸酶污染的去离子水；所述阳性对照品为含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉DNA片段(所述DNA片段包含三种菌对应引物的扩增片段)的质粒；所述内参照为人组织DNA样本。
上述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)对待测样品、阴性对照品、阳性对照品和内参照分别进行DNA提取，获得待测核酸样本、阴性对照核酸样本、阳性对照核酸样本和内参核酸样本；
(2)按照表3，配制PCR反应液，再分别将待测核酸样本、阴性对照核酸样本、阳性对照核酸样本和内参核酸样本加入PCR反应液中，获得待测PCR反应体系、性对照PCR反应体系、阳性对照PCR反应体系和内参PCR反应体系；
(3)按照表2中的反应程序，对各PCR反应体系分别进行多重qPCR扩增；
(4)根据多重qPCR扩增结果，判断待测样品中是否含有3种致病毛霉菌，具体方法如下：当某种致病毛霉菌的无Ct值，且内参的Ct值<40时，该致病毛霉菌为阴性；当某种致病毛霉菌的Ct值≤38，且内参的Ct值<40时，该致病毛霉菌为阳性；当某种致病毛霉菌的Ct值大于38且小于等于40时，建议重复检验确认。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0003218348870000061
实施例3：试剂盒及使用方法
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤(2)中，按照表4配制PCR反应体系；步骤(3)中，采用如表5所示的PCR反应程序。
表4 PCR反应体系
Figure BDA0003218348870000071
表5PCR反应程序
Figure BDA0003218348870000072
实施例4：单重qPCR
1材料与方法
1.1制备核酸样本
取分别含有米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、内参基因GAPDH序列的4种质粒，分别配制成4种核酸样本。
1.2配制PCR反应体系
按照表3，将引物探针组、PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶配制成PCR反应液，再将4种核酸样本分别加入PCR反应液中，获得4种PCR反应体系。
1.3单重qPCR
按照表2中的反应程序，对3种PCR反应体系分别进行单重qPCR扩增。
2结果
米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉和内参照的单重qPCR扩增曲线分别如图1～4所示；米根霉、伞枝横梗霉和微小根毛霉的Ct值如表6所示。3种毛霉菌和内参照的单重qPCR检测菌具有较好的对数扩增曲线，且空白对照无Ct值，说明本发明的引物探针组和试剂盒能用于检测3种毛霉菌。
实施例5：多重qPCR
1材料与方法
1.1制备核酸样本
取分别含有米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉序列的3种质粒，配制成同时含有3种质粒的核酸样本。
1.2制备核酸样本2
取分别含有米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉序列的3种质粒，分别配制成3种核酸样本。
1.3配制PCR反应体系
按照表3，配制PCR反应液，再将3种核酸样本分别加入PCR反应液中，获得3种PCR反应体系。
1.4多重qPCR
按照表2中的反应程序，对PCR反应体系进行多重qPCR扩增。
2结果
米根霉、伞枝横梗霉和微小根毛霉的多重qPCR扩增曲线分别如图5～7所示；米根霉、伞枝横梗霉和微小根毛霉的Ct值如表6所示。多重qPCR中各目标菌的Ct值与单重qPCR的Ct差值在5以内，受到的扩增抑制较小，且单个探针的其他非特异荧光通道不会出现扩增曲线和Ct值，说明当采用本发明的引物探针组和试剂盒时，目标菌相互之间的干扰较小，可以用多重qPCR来一管检测三种毛霉菌。
表6 3种致病毛霉菌的单重和多重qPCR Ct值
Figure BDA0003218348870000081
Figure BDA0003218348870000091
实施例6：临床样品的检测
1材料与方法
1.1制备核酸样本
采用微量样品基因组DNA提取试剂盒分别对临床样品(全血样品)、阴性对照品、阳性对照品和内参照分别进行DNA提取，获得待测核酸样本、阴性对照核酸样本、阳性对照核酸样本和内参核酸样本。
1.2多重qPCR检测
采用实施例2中的试剂盒，通过步骤(2)～(3)，进行多重qPCR检测。
2结果
经检测，米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉和内参照的Ct值分别为33.58，31.75，28.01，27.48，说明该临床样品中含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉。
实施例7：同属非主要致病菌的干扰
1材料与方法
1.1制备核酸样本
采用微量样品基因组DNA提取试剂盒，对加入总状横梗霉菌液和小孢根霉菌菌液的临床样品(全血样品)、阴性对照品、阳性对照品和内参照分别进行DNA提取，获得待测核酸样本(其中总状横梗霉和小孢根霉菌终浓度各为0.025ng/μL左右)、阴性对照核酸样本、阳性对照核酸样本和内参核酸样本
1.2多重qPCR检测
采用实施例2中的试剂盒，通过步骤(2)～(3)，进行多重qPCR检测。
2结果
经检测，米根霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉和内参照的Ct值分别为0，0，0，28.2，说明该临床样品中未检出米根霉、微小根毛霉或伞枝横梗霉，本发明的引物探针组和试剂盒具有较高的特异性，总状横梗霉和小孢根霉菌不会干扰米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的检测。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州电子科技大学
<120> 一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctagaaatt cagtattata aag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggcgtact ctatagaa 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggtgctgat ggattttc 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatttgtggt tgattgacct tta 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcctcaca gttatgtg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagccttca agttaaca 18
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taacaatgga tctcttggtt ctcgca 26
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accaatgcaa gccctcaagg aaatatcaa 29
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccttggtt gactctgcct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaagcttgt catcaatg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccccacttga ttttggag 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcaccatct tccaggagcg ag 22

Claims (10)

1.一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组，包括引物组和探针组，其特征在于，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针组包括：用于检测米根霉的探针，序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测微小根毛霉的探针，序列分别如SEQ ID NO.8所示；用于检测伞枝横梗霉的探针，序列如SEQ ID NO.9所示。
3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述引物组还包括：用于检测内参基因GAPDH的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述探针组还包括：用于检测内参基因GAPDH的探针，序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的引物探针组。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的3种探针分别带有3种不同的荧光标记。
7.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照品、阳性对照品和内参照；所述阴性对照品为无核酸酶污染的去离子水；所述阳性对照品为含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉DNA片段的质粒，所述DNA片段包含三种菌对应引物的扩增片段；所述内参照为人组织DNA样本。
8.一种如权利要求4~7之一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行DNA提取，获得核酸样本；
（2）将引物探针组、PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶配制成PCR反应液，将核酸样本加入PCR反应液中，获得PCR反应体系；
（3）对PCR反应体系进行多重qPCR扩增。
9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR反应液中，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的上游引物和下游引物的浓度均为0.3~0.4μmol/L，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针的浓度分别为0.9~1.2μmol/L、0.3~0.4μmol/L和0.6~0.8μmol/L。
10.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（3）中，所述多重qPCR扩增的反应程序如下：50~55℃预热5~6min；90~95℃预变性8~10min；90~95℃变性15~20s，60~65℃退火和延伸55~60s，40~45个循环。
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