CN111593141A - 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体公开一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法，所述引物组包括靶向基因DNA扩增引物组和crRNA序列，还包括一个荧光探针序列，本发明利用反转录酶对RNA样本反转录，设计引物（包括新冠肺炎病毒的特异的S基因、N基因和Orf1ab，以及所有冠状病毒都有的E基因，人RNaseP基因作为质控）利用重组酶聚合酶在37℃等温扩增，在各个基因对应的特异性crRNA引导下，Cas12a核糖核蛋白识别目的序列，并切割荧光报告序列（Reporter），最后根据显示的颜色来区分新冠病毒与非新冠病毒。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
新冠病毒肆掠全球，严重危害人类将康,由于新冠病毒传播能力强，病毒携带者在初期症状不明显，导致传染性非常强，涉及范围非常广，因此如何能快速，方便的检测新冠病毒将有效阻止新冠病毒的传播。目前对新型冠状病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR方法，这种方法是检测新冠病毒的传统方法，但是需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、较长的检出时间，我们将CRISPR/Cas12和恒温扩增技术相融合，开发出简便快捷的新冠病毒检测方法，不依赖昂贵设备，可以在采样后20-40分钟内快速完成现场检测，并同时对几个新冠病毒特异性基因位点进行检测，极大的提高了新冠病毒检测的效率和准确性，肉眼观察即可判定检测结果，可用于机场，急诊室，社区医院等一些资源相对贫乏地方新冠病毒的快速检测，为保证检测的特异性，我们选用高保真cas12a核酸酶并设计了5套crRNAs，可以区分新冠病毒,也可以同时检测其它冠状病毒，其具有快速简便、灵敏度高、容易普及等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法，同时提供一组用于快速鉴定新冠病毒的特异性引物，及一种用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)和CRISPR方法快速鉴定新冠肺炎病毒的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，所述引物组包括靶向基因DNA扩增引物组和crRNA序列，还包括一个荧光探针序列。
进一步的，所述靶向基因包括至少一个新型冠状病毒特异性基因和所有冠状病毒E基因，还包括一个样品质控的人RNaseP基因。
进一步的，所述新型冠状病毒特异性基因包括S基因、N基因和Orf1ab基因，每个新型冠状病毒特异性基因均包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列，所有冠状病毒E基因和样品质控的人RNaseP基因也分别包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列。
进一步的，所述S基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-S-F和后引物CoV2-S-R，S基因的crRNA识别序列为CoV2-S-crRNA1和CoV2-S-crRNA2，所述N基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-N-F和后引物CoV2-N-R，N基因的crRNA识别序列为CoV2-N-crRNA1和CoV2-N-crRNA2；所述Orf1ab基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-Orf1ab-F和后引物CoV2-Orf1ab-R，Orf1ab基因的crRNA识别序列为CoV2-Orf1ab-crRNA1和CoV2-Orf1ab-crRNA2；所述E基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-E-F和后引物CoV2-E-R，E基因的crRNA识别序列为CoV2-E-crRNA1和CoV2-E-crRNA2；所述人RNaseP基因的DNA扩增引物为前引物hRNaseP-F和后引物hRNaseP-R，人RNaseP基因的crRNA识别序列为hRNaseP-crRNA1和hRNaseP-crRNA2。
一种含有RPA引物组的检测试剂或试剂盒。
一种检测试剂或试剂盒在新型冠状病毒及所有普通冠状病毒检测中的应用。
一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒，包括核酸酶Cas12a，用于特异性检测新型冠状病毒基因序列及所有普通冠状病毒基因序列的Cas12acrRNA，荧光探针，反转录酶，RPA扩增酶以及MgSO4缓冲液。
进一步的，所述Cas12a指导RNA包含核酸酶Cas12a识别序列及靶向病毒RNA互补序列；所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，所述荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团BHQ1。
一种检测冠状病毒RNA的方法，包括以下步骤：
1、提取待检测样品的RNA，取5个离心管，每个离心管加RNA样本1ul；
1、提取待检测样品的RNA，取5个离心管，每个离心管加RNA样本1ul；
2、向每个离心管中加入恒温反应复合物A：包括AMV逆转录酶反应缓冲液10ul，Cas12a反应缓冲液2ul，同一个靶向基因对应的上下游引物各0.1ul，dNTPs0.2ul，AMV逆转录酶0.5ul，Nuclease-free water 0.9ul；
3、向每个离心管中均加入反应底物混合物B：反应底物Reporter 0.5ul，RPA扩增缓冲液2ul；
4、向每个离心管中均加入Cas12核糖核蛋白混和物C：280mM MgSO41 ul，Cas12a0.5ul，每个基因对应的2条crRNA各0.25ul，于37-42℃下进行反应20-40分钟，获得反应产物；
5、使用肉眼或荧光读板仪或DNA琼脂胶电泳分析检测反应产物，以获得对带有新型冠状病毒基因序列及所有冠状病毒基因序列的RNA检测结果。
所述步骤1中待检测样品选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种；所述步骤4中用肉眼观察时可以在黑色背景下，若反应产物变成淡绿色则为阳性，反应液变成淡粉色为阴性；在紫外灯下或LED蓝光下观察，显示荧光信号为阳性。
本发明具有的优点是：
1.本发明采用单反应体系，采集过待检测样本以后，利用反转录酶对RNA样本反转录，根据制定的靶向基因引物先进行扩增，再在与其对应的crRNA引物的引导下，Cas12a识别目的序列，并切割荧光报告序列(Reporter)，最后根据显示的颜色来区分新冠病毒与非新冠病毒，同时本试剂盒将世界顶级的CRISPR和恒温扩增技术相融合，真正实现了单反应体系；
2.本发明对检测的反应温度要求低，反应温度在37-42℃，且反应结果通过肉眼即可识别，不需要大型仪器即可完成现场检测，只需检测人员的细心和无菌操作技术，不需要特殊培训，可用于机场，急诊室，社区医院等一些资源相对贫乏地方新冠病毒的快速检测；
3.本发明能在采集样品后30分钟内得到检测结果，灵敏度高，最低可以检测1copy，多基因(S基因，N基因和Orf1ab基因)同时检测，极大的提高了检测的灵敏性和准确性，另外还可避免因为病毒个别位点变异导致的漏诊，避免假阴性出现；
4.本发明用人的RNaseP基因作内参，提高检测样品的准确性；
5.本发明在检测新型冠状病毒的同时还能兼顾普通冠状病毒的检测，实用性强。
具体实施方式
用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，所述引物组包括靶向基因DNA扩增引物组和crRNA序列，还包括一个荧光探针序列。
进一步的，所述靶向基因包括至少一个新型冠状病毒特异性基因和所有冠状病毒E基因，还包括一个样品质控的人RNaseP基因。
进一步的，所述新型冠状病毒特异性基因包括S基因、N基因和Orf1ab基因，每个新型冠状病毒特异性基因均包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列，所有冠状病毒E基因和样品质控的人RNaseP基因也分别包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列。
进一步的，所述S基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-S-F和后引物CoV2-S-R，S基因的crRNA识别序列为CoV2-S-crRNA1和CoV2-S-crRNA2，所述N基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-N-F和后引物CoV2-N-R，N基因的crRNA识别序列为CoV2-N-crRNA1和CoV2-N-crRNA2；所述Orf1ab基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-Orf1ab-F和后引物CoV2-Orf1ab-R，Orf1ab基因的crRNA识别序列为CoV2-Orf1ab-crRNA1和CoV2-Orf1ab-crRNA2；所述E基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-E-F和后引物CoV2-E-R，E基因的crRNA识别序列为CoV2-E-crRNA1和CoV2-E-crRNA2；所述人RNaseP基因的DNA扩增引物为前引物hRNaseP-F和后引物hRNaseP-R，人RNaseP基因的crRNA识别序列为hRNaseP-crRNA1和hRNaseP-crRNA2。
一种含有RPA引物组的检测试剂或试剂盒。
一种检测试剂或试剂盒在新型冠状病毒及所有普通冠状病毒检测中的应用。
一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒，包括核酸酶Cas12a，用于特异性检测新型冠状病毒基因序列及所有普通冠状病毒基因序列的Cas12acrRNA，荧光探针，反转录酶，RPA扩增酶以及MgSO4缓冲液。
进一步的，所述Cas12a指导RNA包含核酸酶Cas12a识别序列及靶向病毒RNA互补序列；所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，所述荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团BHQ1。
一种检测冠状病毒RNA的方法，包括以下步骤：
1、提取待检测样品的RNA，取5个离心管，每个离心管加RNA样本1ul；
2、向每个离心管中加入恒温反应复合物A：包括AMV逆转录酶反应缓冲液10ul，Cas12a反应缓冲液2ul，同一个靶向基因对应的上下游引物各0.1ul，dNTPs0.2ul，AMV逆转录酶0.5ul，Nuclease-free water 0.9ul；
3、向每个离心管中均加入反应底物混合物B：反应底物Reporter 0.5ul，RPA扩增缓冲液2ul；
4、向每个离心管中均加入Cas12核糖核蛋白混和物C：280mM MgSO41 ul，Cas12a0.5ul，每个基因对应的2条crRNA各0.25ul，于37-42℃下进行反应20-40分钟，获得反应产物；
5、使用肉眼或荧光读板仪或DNA琼脂胶电泳分析检测反应产物，以获得对带有新型冠状病毒基因序列及所有冠状病毒基因序列的RNA检测结果。
所述步骤1中待检测样品选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种；所述步骤4中用肉眼观察时可以在黑色背景下，若反应产物变成淡绿色则为阳性，反应液变成淡粉色为阴性；在紫外灯下或LED蓝光下观察，显示荧光信号为阳性。
本发明中用于检测新型冠状病毒和普通冠状病毒的特异性引物见表1.
实验例
样品准备
1.样本：咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等；
2.病毒RNA提取：用常规或其他有效方法对以上样本进行提取，准备好需要检测的病毒RNA，包括①S基因，②Orf1ab基因，③N基因，④E基因，⑤人RNaseP基因(样品质控)，⑥NTC(没有样品的空白对照)混合物。
恒温扩增反应体系(20ul)准备
1、提取待检测样品的RNA，取5个离心管，每个离心管加RNA样本1ul；
2、向每个离心管中加入恒温反应复合物A：包括AMV逆转录酶反应缓冲液10ul，Cas12a反应缓冲液2ul，同一个靶向基因对应的上下游引物各0.1ul，dNTPs0.2ul，AMV逆转录酶0.5ul，Nuclease-free water 0.9ul；
3、向每个离心管中均加入反应底物混合物B：反应底物Reporter 0.5ul，RPA扩增缓冲液2ul；
4、向每个离心管中均加入Cas12核糖核蛋白混和物C：280mM MgSO41 ul，Cas12a0.5ul，每个基因对应的2条crRNA各0.25ul，于37-42℃下进行反应20-40分钟，获得反应产物；
测试结果说明：见表2
表2：测试结果说明
1.人RNaseP基因为样品内源性质控，如果为阴性，说明样品和/或检测操作有问题，需要重新检测。
2.S基因，N基因和Orf1ab基因为新冠特异性的，一个，两个或者三个都阳性，说明为冠状病毒阳性，应用三个新冠特异性基因同时进行检测，是为了增加检测的灵敏性和准确性。
3.E基因为冠状病毒特异性；如果为阴性，基本排除冠状病毒感染；如果为阳性，且其它新冠特异性基因为阴性，说明为其它类型冠状病毒感染。
测试结果的进一步确认：
本测试结果可以通过以下方法进行进一步的确认：
方法I：在紫外灯下观察，阳性反应可以观察到信号；
方法II:在LED蓝光下观察，阳性反应可以观察到信号；
方法III:DNA琼脂胶电泳分析：在120伏跑2.5％的DNA琼脂胶20分钟，凝胶成像仪可以观察到DNA条带。
序列表
<120> 基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法
<141> 2020-05-25
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (10)
1.用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，其特征在于：所述引物组包括靶向基因DNA扩增引物组和crRNA识别序列，还包括一个荧光探针序列。
2.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，其特征在于：所述靶向基因包括3个新型冠状病毒特异性基因和所有冠状病毒E基因，还包括一个样品质控的人RNaseP基因。
3.如权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，其特征在于：所述新型冠状病毒特异性基因包括S基因、N基因和Orf1ab基因，每个新型冠状病毒特异性基因均包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列，所有冠状病毒E基因和样品质控的人RNaseP基因也分别包含有一对DNA扩增引物和2条crRNA识别序列。
4.如权利要求3所述的用于检测新型冠状病毒2019-nCov的RPA引物组，其特征在于：所述S基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-S-F和后引物CoV2-S-R，S基因的crRNA识别序列为CoV2-S-crRNA1和CoV2-S-crRNA2，所述N基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-N-F和后引物CoV2-N-R，N基因的crRNA识别序列为CoV2-N-crRNA1和CoV2-N-crRNA2;所述Orf1ab基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-Orf1ab-F和后引物CoV2-Orf1ab-R，Orf1ab基因的crRNA识别序列为CoV2-Orf1ab-crRNA1和CoV2-Orf1ab-crRNA2;所述E基因的DNA扩增引物为前引物CoV2-E-F和后引物CoV2-E-R，E基因的crRNA识别序列为CoV2-E-crRNA1和CoV2-E-crRNA2;所述人RNaseP基因的DNA扩增引物为前引物hRNaseP-F和后引物hRNaseP-R，人RNaseP基因的crRNA识别序列为hRNaseP-crRNA1和hRNaseP-crRNA2。
5.含有权利要求1-4任一所述的RPA引物组的检测试剂或试剂盒。
6.如权利要求5所述的检测试剂或试剂盒在新型冠状病毒及所有普通冠状病毒检测中的应用。
7.一种基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于：包括AMV逆转录酶，用于RPA扩增的TwistAmp液体基础试剂盒，用于扩增新型冠状病毒基因的引物序列，核酸酶Cas12a及识别新型冠状基因序列的crRNA，荧光探针。
8.如权利要求7所述的基于RPA的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒，其特征在于：所述crRNA包含核酸酶Cas12a识别序列及靶向病毒RNA互补序列；所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团6-FAM，所述荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团BHQ1。
9.一种如权利要求5-8任一所述的试剂盒检测冠状病毒RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、提取待检测样品的RNA，取5个离心管，每个离心管加RNA样本1ul;
2、向每个离心管中加入恒温反应复合物A：包括AMV逆转录酶反应缓冲液10 ul，Cas12a反应缓冲液2 ul，同一个靶向基因对应的上下游引物各0.1ul，dNTPs 0.2ul，AMV逆转录酶0.5ul，Nuclease-free water 0.9ul；
3、向每个离心管中均加入反应底物混合物B：反应底物 Reporter 0.5 ul， RPA扩增缓冲液2 ul；
4、向每个离心管中均加入Cas12核糖核蛋白混和物C：280mM MgSO4 1 ul， Cas12a0.5ul，每个基因对应的2条crRNA各0.25ul， 于37-42℃下进行反应20-40分钟，获得反应产物；
5、使用肉眼或荧光读板仪或DNA琼脂胶电泳分析检测反应产物，以获得对带有新型冠状病毒基因序列及所有冠状病毒基因序列的RNA检测结果。
10.如权利要求9所述的检测冠状病毒RNA的方法，其特征在于：所述步骤1中待检测样品选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种；所述步骤4中用肉眼观察时可以在黑色背景下，若反应产物变成淡绿色则为阳性，反应液变成淡粉色为阴性；在紫外灯下或LED蓝光下观察，显示荧光信号为阳性。
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