CN112280904A - 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法 - Google Patents

一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112280904A
CN112280904A CN202011335736.6A CN202011335736A CN112280904A CN 112280904 A CN112280904 A CN 112280904A CN 202011335736 A CN202011335736 A CN 202011335736A CN 112280904 A CN112280904 A CN 112280904A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
cov
detecting
detection
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011335736.6A
Other languages
English (en)
Inventor
康晓平
李裕昌
姜涛
张森
张颖
李靖
吴晓燕
邓永强
秦成峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN202011335736.6A priority Critical patent/CN112280904A/zh
Publication of CN112280904A publication Critical patent/CN112280904A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物，用其可免提取核酸检测新型冠状病毒。本发明本发明不仅提供了检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物，还优化了样本处理液，将样本处理液与病毒培养液按1:9体积混合后，可促使病毒核酸充分释，提高新冠病毒检测的灵敏性。本发明将样本处理、核酸释放与RPA技术相结合，得到了可检测新冠病毒的快速检测方法，免去了核酸提取过程，实现了从样本至结果的直接检测，进一步简化了操作流程，提高了检测效率。

Description

一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2，是2019年底新发现的一种新型冠状病毒，感染性高，在短短半年内已席卷全球，造成了1400余万感染病例。核酸检测是新冠病毒感染确诊的标准方法，目前已有多种基于qPCR的检测试剂用于新冠病毒感染的实验室检测确诊。并且，基于qPCR的一体化核酸检测系统已出现，加入样本后，系统可自动进行核酸提取并扩增，实现了样本进，结果出的检测效果，摆脱了核酸检测对BSL-2等生物安全专业实验室及PCR专业实验室的依赖，但无论是常规qPCR还是一体化qPCR,最低检测时间是1.5小时。探索更快的核酸反应体系，有望进一步提高检测效率。
RPA(Recombinent polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)是一种新型的等温扩增扩增技术，可在近似室温(37℃-42℃)的条件下15min-20min之内实现样本的快速检测。研究基于RPA的一体化核酸检测试剂，有望30分钟之内完成样本检测。
筛选出灵敏特异的RPA检测引物探针，获得适于RPA反应体系的样本处理液，优化一体化RPA的体系组成，是建立一体化RPA检测体系需克服的关键技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速检测新型冠状病毒，尤其是如何在免提取核酸的情况下快速检测新型冠状病毒。
为了解决上述技术问题，本发明提供了检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物。
本发明所提供的检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物以新型冠状病毒S基因片段(序列表中的序列1，共432bp)作为检测靶标进行RT-RPA扩增；所述引物组合物由上游引物Cov-RPA-F3、下游引物Cov-RPA-R2和探针Cov-RPA-P组成。
上述引物组合物中，所述Cov-RPA-F3是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA；所述Cov-RPA-R2是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA；所述Cov-RPA-P的核苷酸序列为序列表中序列4，其第31位的T以FAM荧光标记、第33位的A和第34位的C之间插入四氢呋喃基团、第35位的T以BHQ1荧光淬灭基团标记、3’末端用封闭基团C3封闭。
所述引物组合物中，所述Cov-RPA-F3、所述Cov-RPA-R2和所述Cov-RPA-P的摩尔比为7：7：2。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种配合上述引物组合物进行样本处理的溶液，名称为ET溶液，其为按摩尔比EDTA:TCEP＝1:100比例配制的水溶液；所述水溶液中EDTA的浓度为0.001mol/L，TCEP的浓度为0.1mol/L。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的试剂或试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒，包括上述检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物。
所述试剂或试剂盒中，所述Cov-RPA-F3、所述Cov-RPA-R2和所述Cov-RPA-P的摩尔比为7：7：2。所述Cov-RPA-F3、所述Cov-RPA-R2和所述Cov-RPA-P可分别单独包装，也可组合在一起包装。
上述试剂或试剂盒还可包括所述的ET溶液。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了所述试剂或试剂盒的使用方法，包括将待测样本和所述ET溶液按9:1的体积比混合后，95℃反应10min，用所述引物组合物进行RT-RPA扩增，以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线，以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，然后进行如下判断：如果15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点，表明待测样本含有新型冠状病毒；否则表明待测样本不含新型冠状病毒。
上述方法中，所述RT-RPA扩增的反应体系为60μl体系，体系中所述样本混合液的添加量为12-16μl。
上述检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用或在制备检测或辅助检测新型冠状病毒试剂或试剂盒产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述ET溶液在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用或在制备检测或辅助检测新型冠状病毒试剂或试剂盒产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述检测或辅助检测新型冠状病毒的的试剂或试剂盒在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述检测或辅助检测新型冠状病毒的方法在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
RPA作为一种快速检测方法，由于具有反应快速、操作简便的特点，非常适于现场及基础单位的使用，但目前仍需扩增提取后再进行扩增。建立免提取的RT-RPA扩增技术，有望提高检测效率及现场及基层适用性。本发明本发明不仅提供了检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的引物组合物，还优化了样本处理液，将样本处理液与病毒培养液按1:9体积混合后，可促使病毒核酸充分释，提高新冠病毒核酸检测的灵敏性。本发明将样本处理、核酸释放与RPA技术相结合，得到了可检测新冠病毒核酸的快速核酸检测方法，免去了核酸提取过程，实现了从样本至结果的直接检测，进一步简化了操作流程，提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同引物对的扩增曲线图；F1R2、F2R3的扩增结果与F1R1相似。
图2为本发明实施例1中组合的新型冠状病毒核酸检测试剂对其他呼吸道病毒核酸的扩增结果。图中，SARS-CoV-2为新型冠状病毒核酸；H1N1为A型流感病毒H1N1亚型病毒核酸；H3N2为A型流感病毒H3N2亚型病毒核酸；CoV229E为普通冠状病毒229E病毒核酸；SARS-CoV为SARS-CoV病毒核酸；INFB为B型流感病毒核酸；ADV为腺病毒核酸。
图3为本发明实施例1中样本处理液对新型冠状病毒核酸检测试剂的检测效果影响图。
图4为本发明实施例1中不同样本体积的RPA扩增体系检测效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、临床样本和病毒株：
以下实施例中的V34新冠病毒株为新型冠状病毒(SARS-CoV-2，又称SARS-CoV 2)毒株，记载于非专利文献“Development of an automatic integrated gene detectionsystem for novel Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus(SARS-CoV 2)，Emerging Microbes&Infections，2020(9)，1489-1495”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的A型流感病毒H1N1亚型病毒采用A型流感病毒H1N1亚型病毒株H1N1/Beijing/501/2009，记载于非专利文献“A duplex real-time RT-PCR assay fordetecting H5N1 avian influenza virus and pandemic H1N1 influenza virus，Kanget al.Virology Journal 2010,7:113)”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的A型流感病毒H3N2亚型病毒记载于非专利文献“黄维娟等，2011-2012年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析，2013(29)，258-262”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的B型流感病毒记载于非专利文献“Development of an automaticintegrated gene detection system for novel Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus(SARS-CoV 2)，Emerging Microbes&Infections，2020(9)，1489-1495”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的SARS-CoV病毒(SARS-CoV BJ01株)记载于非专利文献“Epitopemapping and biological function analysis of antibodies produced byimmunization of mice with an inactivated Chinese isolate of severeacuterespiratory syndrome-associated coronavirus(SARS-CoV)，Virology 334(2005)134–143”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的普通冠状病毒229E病毒记载于非专利文献“Development of anautomatic integrated gene detection system for novel Severe acute respiratorysyndrome-related coronavirus(SARSCoV 2)，Emerging Microbes&Infections，2020(9)，1489-1495”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的腺病毒7型记载于非专利文献“Development of an automaticintegrated gene detection system for novel Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus(SARS-CoV 2)，Emerging Microbes&Infections，2020(9)，1489-1495”，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中的新冠病毒感染阳性的咽拭子样本和痰液样本由武汉金银潭医院提供，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
2、试剂：
以下实施例中的RAA-荧光检测试剂为杭州众测生物技术有限公司(货号：S002ZC)产品。
以下实施例中的病毒RNA/DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品。
以下实施例中的三(2-碳基乙基)磷酸盐(TCEP)为Sigma公司产品。
以下实施例中的乙二胺四乙酸(EDTA)为Sigma公司产品。
实施例1
1、新型冠状病毒RPA检测引物及探针的设计
从genbank数据库中下载新型冠状病毒SARS-CoV-2、SARS-CoV病毒、蝙蝠样SARS病毒、冠状病毒229E、OC43等基因组序列，通过序列比对分析，选取特异性高的新型冠状病毒S基因片段(序列表中的序列1，共432bp)作为检测靶标，分别设计RPA检测引物及探针序列，如表1所示。
表1设计的新冠病毒RPA引物探针序列
Figure BDA0002797087670000051
其中，Cov-RPA-P的核苷酸序列为序列表中序列4，其第31位的T以FAM荧光标记、第33位的A和第34位的C之间插入四氢呋喃基团THF、第35位的T以BHQ1荧光淬灭基团标记、3’末端用封闭基团C3封闭以阻断探针延伸。
2、引物筛选
将RPA上游引物Cov-RPA-F1(简写为F1)、Cov-RPA-F2(简写为F2)、Cov-RPA-F3(简写为F3)和下游引物Cov-RPA-R1(简写为R1)、Cov-RPA-R2(简写为R2)、Cov-RPA-R3(简写为R3)进行组合配对，共获得9对引物对：F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3。
将上述9对引物对分别和探针CoV-RPA-P组合，利用RPA扩增试剂盒配置常规RT-RPA扩增溶液，对系列稀释的SARS-CoV-2病毒(V34新冠病毒株)培养物核酸进行扩增，通过测定每套引物对的最低检出限来选取最为灵敏的检测引物对作为新冠病毒RPA检测体系的候选引物。
结果如图1(F1R2、F2R3的扩增结果与F1R1相似)及表2所示，表明引物对F3R2可获得最为灵敏的检测结果，最低检出限为10copies/反应。
表2不同引物对的最低检出限
引物对 检测特异性 灵敏性(copies/反应)
F1R1 特异 无
F1R2 特异 无
F1R3 特异 无
F2R1 特异 100
F2R2 特异 100
F2R3 特异 1000
F3R1 特异 100
F3R2 特异 10
F3R3 特异 1000
3、常规RT-RPA扩增
以病毒RNA提取试剂盒(Qigen公司生产，货号52904)分别提取新型冠状病毒核酸(标为SARS-CoV-2)、SARS-CoV病毒核酸(标为SARS-CoV)、普通冠状病毒229E病毒核酸(标为CoV229E)、腺病毒核酸(标为ADV)、A型流感病毒H1N1亚型病毒核酸(标为H1N1)、A型流感病毒H3N2亚型病毒核酸(标为H3N2)，以及B型流感病毒核酸(标为INFB)作为待扩增模版核酸。将F3R2引物对、探针与RT-RPA试剂组合为新型冠状病毒核酸检测试剂，对上述提取的模版核酸分别进行RT-RPA(Reverse Transcription-Recombinent polymeraseamplification，逆转录重组酶聚合酶扩增)扩增，以验证该试剂的检测特异性。
反应体系如下：缓冲液42.5μl；醋酸镁溶液2.5μl；上游引物Cov-RPA-F3(序列表的序列2)2.1μl；下游引物Cov-RPA-R2(序列表的序列3)2.1μl；探针Cov-RPA-P(序列表的序列4)0.6μl；待扩增模板核酸5μl；42℃反应20min，以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线，通过检测荧光信号值进行结果判断。便携式荧光扩增检测仪自带的软件F1620可对扩增结果进行自动分析，以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，然后进行如下判断：如果15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点，表明反应体系中的相应新冠病毒病毒基因可以被检测出来；否则表明反应体系中的相应新冠病毒基因不能被检测出来。
结果见图2，表明该检测试剂对新冠病毒核酸扩增良好，其他呼吸病毒核酸均无阳性扩增，表明该检测试剂具有较好的特异性。
4、qPCR检测
qPCR检测是病原体感染检出最为标准并最被认可的核酸检测方法，为了客观评价RPA检测体系的灵敏性及对临床样本检测的准确性，我们将RPA扩增结果与qPCR扩增进行平行比较。
qPCR扩增的上下游引物及探针序列如下：
上游引物CoV-F3：5’-TCCTGGTGATTCTTCTTCAGGT-3’；
下游引物CoV-R3：5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGC-3’；
探针：5’-FAM-AGCTGCAGCACCAGCTGTCCA-BHQ1-3’(其第1位的A以FAM荧光标记、第21位的A以BHQ1荧光淬灭基团标记)。
qPCR扩增体系如下：20μl反应体系中含有5μl模版RNA，5μl Taqman fast virus1-step mix缓冲液(Applied Biosystems,Vilnus,Lithuania)，1μl上游引物CoV-F3(10μM)，1μl下游引物CoV-R3(10μM)，0.5μl探针(10μM)，12.5μl灭菌水。
将反应管置入实时定量PCR反应仪(LightCycler 480Real Time PCR instrument(Roche Diag.,Mannheim,Germany))中进行反应。扩增条件如下：50℃反转录5分钟，95℃预变性10秒，然后进行40个循环扩增：95℃5秒，60℃反应30秒进行荧光收集。CT值38以下，结果判断为阳性，否则为阴性。
取已被qPCR确定为阳性的17份新冠病毒感染阳性的咽拭子样本和3份痰液样本(一共20份阳性样本)，进行RT-RPA扩增，扩增体系同步骤3。
结果见表3，表明该20份阳性样本均为RPA检测阳性。表明F3R2引物对可灵敏扩增新冠病毒感染呼吸道样本中的病毒核酸。
表3新冠病毒RT-RPA检测系统对临床样本的检测
Figure BDA0002797087670000071
Figure BDA0002797087670000081
5、建立一体化RPA快速检测体系
在实验过程中，为了提高检测灵敏性，我们对样本处理效果进行了测试，并对RPA反应体系进行了优化。
5.1样本处理
取EDTA 0.0018612g、TCEP 0.143325g溶解在5ml无菌去离子水中配置成样本处理液(ET溶液)；将系列稀释的新型冠状病毒V34病毒株(10倍系列稀释的培养物浓度为105pfu/ml-1pfu/ml，对应的基因拷贝数为10000copies/ul-0.1copies/ul)与样本处理液(ET溶液)按9:1的体积比混合后，95℃反应10min，使核酸充分释放，得到样本混合液；同时设未加入样本处理液ET的PBS缓冲液对照组。
5.2核酸快速等温扩增及检测
将步骤5.1处理后的样本不进行核酸提取，直接进行RT-RPA等温扩增，反应体系如下：4×浓缩型缓冲液(杭州众测生物技术有限公司生产，货号：货号：S002ZC)12.5μl；醋酸镁溶液2.5μl；上游引物Cov-RPA-F32.1μl；下游引物Cov-RPA-R22.1μl；探针Cov-RPA-P 0.6μl；在不同的反应管中加入样本混合液6μl，然后加入去离子水将总反应体系补至60μl；42℃反应20min，以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线，观察曲线进行结果判断。便携式荧光扩增检测仪自带的软件F1620可对扩增结果进行自动分析，以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，然后进行如下判断：如果15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点，表明反应体系中的相应新冠病毒病毒基因可以被检测出来；否则表明反应体系中的相应新冠病毒基因不能被检测出来。
实验结果见图3，表明按9:1配比制备的样本处理液可获得更灵敏的扩增结果，可检测到100pfu/ml(相当于50copies/反应)的病毒核酸，而未加样本处理液的对照组仅可检测到10000pfu/ml(相当于5000copies/反应)的病毒核酸，表明该样本处理液(ET溶液)可促进核酸释放。
6、一体化RPA扩增体系的优化
由于一体化反应体系直接扩增样本，加入的样本体积越大，靶核酸将越多，阳性率也会越高。但同时，也有更多的样本处理液掺入到了RPA反应体系中，处理液中EDTA的酶抑制活性有可能对RPA的重组酶产生一定的抑制效果，反而会降低检测的阳性率。因此，一体化的RPA检测体系需要对加入的样本量进行测试。
反应体系如下：4×浓缩型缓冲液(杭州众测生物技术有限公司生产，货号：货号：S002ZC)12.5μl；醋酸镁溶液2.5μl；上游引物Cov-RPA-F3 2.1μl；下游引物Cov-RPA-R2 2.1μl；探针Cov-RPA-P 0.6μl；在不同的反应管中加入样本混合液，样本混合液的体积分别设为4μl、8μl、12μl、16μl、20μl，然后加入去离子水将总反应体系补至60μl；42℃反应20min。以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线，以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，然后进行如下判断：如果15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点，表明待测样本含有新冠病毒核酸；否则表明待测样本不含新冠病毒核酸。
表4不同样本混合液添加量对一体化的RPA检测体系的影响
Figure BDA0002797087670000091
Figure BDA0002797087670000101
结果如图4和表4所示，样本体积12微升以下，检测灵敏度随着体积的增大而上升，最低检出限可达10copies/反应；加入的体积为16微升时，最低也为10copies/反应，但荧光强度低于模板体积12μl时的荧光强度，表明样本处理液的酶抑制效果出现，加入的样本体积持续增多，20μl时，检测灵敏度显著降低，仅可达到104copies/反应，表明该反应体系最适的样本体积为12-16μl。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法
<130> GNCSY202465
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat taacatcact 60
aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga ttcttcttca 120
ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag gacttttcta 180
ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtgcact tgaccctctc 240
tcagaaacaa agtgtacgtt gaaatccttc actgtagaaa aaggaatcta tcaaacttct 300
aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc 360
ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag 420
agaatcagca ac 432
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagaagttat ttgactcctg gtgattcttc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaagtgcac agtctacagc atctgtaatg 30
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaagtcctag gttgaagata acccacataa taactgcagc accagctgtc ca 52

Claims (10)

1.用于检测或辅助检测新型冠状病毒的引物组合物，其特征在于，其由上游引物Cov-RPA-F3、下游引物Cov-RPA-R2和探针Cov-RPA-P组成；所述Cov-RPA-F3是核苷酸序列为序列表中序列2的单链DNA；所述Cov-RPA-R2是核苷酸序列为序列表中序列3的单链DNA；所述Cov-RPA-P是核苷酸序列为序列表中序列4的第31位的T以FAM荧光标记、第33位的A和第34位的C之间插入四氢呋喃基团、第35位的T以BHQ1荧光淬灭基团标记，3’末端用封闭基团C3封闭，得到的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述Cov-RPA-F3、所述Cov-RPA-R2和所述Cov-RPA-P的摩尔比为7：7：2。
3.一种配合权利要求1或2所述的引物组合物进行样本处理的溶液，其特征在于，其为按摩尔比EDTA:TCEP＝1:100比例配制的水溶液。
4.根据权利要求3所述的溶液，其特征在于，所述水溶液中EDTA的浓度为0.001mol/L，TCEP的浓度为0.1mol/L。
5.检测或辅助检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括权利要求3或4所述的溶液。
7.权利要求5或6所述试剂或试剂盒的使用方法，其特征在于：包括将待测样本和权利要求3或4所述的溶液按9:1的体积比混合后，95℃反应10min得到样本混合液，用权利要求1或2所述的引物组合物进行RT-RPA扩增，以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述RT-RPA扩增的反应体系为60μl体系，体系中所述样本混合液的添加量为12-16μl。
9.权利要求1或2所述的引物组合物，和/或权利要求3或4所述的溶液在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用或在制备检测或辅助检测新型冠状病毒试剂或试剂盒产品中的应用。
10.权利要求5或6所述的试剂或试剂盒，和/或权利要求7或8所述的方法在检测或辅助检测新型冠状病毒中的应用。
CN202011335736.6A 2020-11-25 2020-11-25 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法 Pending CN112280904A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011335736.6A CN112280904A (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011335736.6A CN112280904A (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112280904A true CN112280904A (zh) 2021-01-29

Family

ID=74425794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011335736.6A Pending CN112280904A (zh) 2020-11-25 2020-11-25 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112280904A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182332A (zh) * 2018-09-30 2019-01-11 浙江天杭生物科技股份有限公司 一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法
CN111206120A (zh) * 2020-03-20 2020-05-29 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法
CN111235316A (zh) * 2020-03-23 2020-06-05 中国检验检疫科学研究院 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
CN111593141A (zh) * 2020-05-25 2020-08-28 商城北纳创联生物科技有限公司 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182332A (zh) * 2018-09-30 2019-01-11 浙江天杭生物科技股份有限公司 一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法
CN111206120A (zh) * 2020-03-20 2020-05-29 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法
CN111235316A (zh) * 2020-03-23 2020-06-05 中国检验检疫科学研究院 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
CN111593141A (zh) * 2020-05-25 2020-08-28 商城北纳创联生物科技有限公司 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OLE BEHRMANN等: "Rapid Detection of SARS-CoV-2 by Low Volume Real-Time Single Tube Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification Using an Exo Probe with an Internally Linked Quencher (Exo-IQ)", 《CLIN CHEM》 *
刘冬虹等: "重组酶聚合酶扩增技术的研究进展", 《检验检疫学刊》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108060269B (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN105543414B (zh) 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法
Josko Molecular virology in the clinical laboratory
CN112538550B (zh) 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
CN103255232B (zh) 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
AU2020100696A4 (en) LAMP-TaqMan ASSAY KIT FOR PIGEON NEWCASTLE DISEASE VIRUS
CN103966356A (zh) 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒
CN110699492A (zh) 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用
CN108753768B (zh) 用于检测肠道病毒的核酸及其应用
CN101921870A (zh) 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN105238880A (zh) 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒
CN102586487B (zh) 鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN111206122A (zh) 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒
CN107287347B (zh) 戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN112280904A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒核酸的方法
US20130122484A1 (en) Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv)
CN107267666A (zh) 一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt‑pcr检测试剂盒
CN112266980A (zh) 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111500777A (zh) 一种基于荧光rt-pcr方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒
CN111118217A (zh) 检测羊口疮病毒的实时荧光rpa引物和探针、试剂盒及其使用方法
Roy et al. SARS-CoV-2 Detection using Real Time RT PCR by a Commercial Diagnostic Kit
CN115323076B (zh) 一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN111074006B (zh) Salivirus病毒的双通道实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒、方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination