CN111206120A - 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法 - Google Patents

一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物探针组及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明提供的RT‑RAA荧光法检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物探针组包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰淬灭基团的物质。本发明提供的引物探针组检测快速、准确、灵敏、操作简便，特异性达100％，能够在30min内完成对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测。

Description

一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物和探针组，本发明还涉及利用该引物和探针进行新型冠状病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术
2020年2月11日，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)在医学类预印本发布平台medRxiv发表最新关于新型冠状病毒命名的论文，正式将新冠病毒从“2019-CoV”，正式命名为“SARS-CoV-2”。
冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径50-200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。冠状病毒按血清型可分为α、β、γ和δ四个属，新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属。冠状病毒的理化特性为：对热敏感，56℃30分钟、乙醚、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。
核酸检测是现阶段用于确诊新型冠状病毒肺炎的主要手段之一。目前对新型冠状病毒的核酸检测手段主要是RT-PCR法，此方法以其较高的特异性及敏感性在新型冠状病毒检测方面发挥着重大作用。但是RT-PCR方法由于其变温的特点需要相关的昂贵复杂仪器设备且需要有专业技术人员操作，现有的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-PCR检测方法需要现场进行反应体系的配制，反应程序也分为两个步骤，第一个步骤为50-55℃30分钟以上的逆转录和40到90分钟的扩增检测时间，整体核酸扩增检测根据不同的试剂盒需要的时间在1.5-3小时，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制，受检测速度及检测人员的限制，会导致大量疑似病例的样本积压，不能快速得到结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、耗时短、易于操作的快速荧光检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物探针组及检测方法。
本发明通过对已公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的全序列共包含10个基因进行综合分析比较，为达到快速筛查的目的，实现快速、灵敏，准确检测这三个基本要求，从10个基因中选择保守性最优的ORF 1ab基因序列进行设计引物探针，且为了更快更准的检测出新型冠状病毒SARS-CoV-2，针对ORF 1ab基因进行单一基因检测，减少检测多重基因的干扰，提高扩增速度和检测灵敏度；具体设计运用DNAMAN软件进行冠状病毒同源性分析和b1ast序列分析，筛出新型冠状病毒保守度及特异性俱佳的基因序列，为了筛选出最优的引物探针，进行多区间设计，共设计了46对特异性引物探针供筛选。通过筛选，优选出灵敏度10拷贝/测试的引物探针组，共为5个组合；在这5个组合的基础上用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物核酸进一步进行适应性筛选，选出灵敏度最高的一组引物探针组。
具体而言，第一方面，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
上游引物：5’-CACGTAGGAATGTGGCAACTTTACAAGCTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CTTAGGTATGCCAGGTATGTCAACACATAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGGTAATCACTGGGTTACAT-3’(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
本发明的探针第31位碱基修饰的荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；优选为FAM或HEX。
所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；优选为BHQ1或BHQ2。
含有上述特异性引物探针组的试剂盒属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测试剂盒，该试剂盒含有上述特异性引物探针组。
所述试剂盒中，上游引物浓度为0.02-0.05mM，下游引物浓度为0.02-0.05mM；优选上游引物浓度为0.03mM，下游引物浓度为0.03mM。
本发明所述试剂盒中，探针浓度为0.01-0.03mM，优选0.02mM。
本发明所述试剂盒其工作程序是以待测样品基因组RNA为模板，利用特异性引物探针组，进行RT-RAA荧光扩增，根据荧光信号判定结果。
扩增检测在等温条件下温度为37-42℃，优选39℃，扩增检测时间为10-15min。
第三方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测方法，以待测样品基因组RNA为模板，利用特异性引物探针组，进行RT-RAA荧光扩增，根据荧光信号判定结果。
具体步骤为：将5μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA样本加入到45μL扩增体系中，将配制好的扩增体系与新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA在等温条件39℃下，放入恒温振荡混匀仪中混匀后，放入恒温荧光检测仪，荧光检测仪设置为：检测时间10分钟，温度39℃，在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，监测到有荧光信号放大为阳性，说明存在新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA。
本发明提供了一种快速荧光检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的扩增体系，所述扩增体系包括反应单元及反应缓冲液两部分；所述的反应缓冲液中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2特异性引物探针组；
本发明所述反应缓冲液是在江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液中加入本申请所述的特异性引物探针组配制而成，反应缓冲液中组份为：上游引物、下游引物、探针、Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000；
所述反应单元江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应单元，主要包括以下组分：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
用50μL的移液器吸取本发明所述的反应缓冲液加入冻干反应单元中配制成扩增体系，再加入1-5μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA样本，在等温条件下，混匀并进行逆转录4～10min后，放入荧光检测仪中进行实时检测。
优选的，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA的检测方法加样体积为1～5μL，浓度为1～50ng/μL，更优的加样量为5μL。
优选的，所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为37～42℃，更优的为39℃。优选的，所述等温扩增的时间为10～15min。
优选的，所述扩增体系重溶后的体积为25～100μL，更优为50μL。
本领域技术人员能够理解，出于防疫部门对流行病学第一手资料掌握与统计的目的、或检验检疫部门对进出口食品、生活用品、动植物产品的检验检疫的目的，均需要快速、准确、灵敏地实现对新型冠状病毒的检测，因此本发明的检测方法在上述领域应用时具有非疾病诊断目的的适用性。
更进一步的，本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA更优的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品(疑似新型冠状病毒SARS-CoV-2)的RNA；本发明所述提取的方法优选采用市售商品化的病毒核酸提取试剂，按说明书进行操作，本发明实施例使用济凡生物的自动提取试剂盒进行RNA提取；提取得到的RNA在-80℃保存备用；
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀，提高实验一致性；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)将配制好的引物探针与F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液混合，每43μL原反应缓冲液中加入1μL浓度为0.02mM探针和1μL浓度为0.03mM引物混合，得到本发明所述的反应缓冲液，将配制好的45μL试剂加入到F00R01冻干反应单元中，使其充分溶解并混均；
(4)将5μL所述步骤(1)中得到的待测RNA样品加入所述步骤(3)中得到的反应体系，再放入RAA-B6100仪器中进行预处理及逆转录4min后，放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；
(5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值设置成K≥20时，判定为阳性。斜率值K＜20时判定为阴性；也可以直接观察是否有荧光增长来判定阴阳性，有扩增曲线的为阳性，没有荧光增长的为阴性。
在本发明中，所述待测样品为可能含有新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的样本，本发明对待测样本的提取方法没有特殊限定，采用病毒RNA的常规提取方法即可。
本发明提供的引物探针检测新型冠状病毒SARS-CoV-2时与冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌无交叉反应，特异性强，达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到2Copies。且本发明提供的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于基层快速诊断。
本发明提供的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，具有实际的应用价值；并且本发明经过大量实验摸索后发现，对SEQ ID NO.3所示探针进行以下修饰：第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，能够取得最优异的检测效果，而对探针的其他位置的常规修饰并不能取得最佳检测效果。并且，本发明克服了现有RT-PCR检测新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA检测时间长，灵敏度偏低，易造成假阴性、操作繁琐的缺点，本发明提供的快速荧光检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法能够实现新型冠状病毒SARS-CoV-2的快速准确鉴定，操作简便，检测时间短，特异性高达100％。试验结果表明，本发明提供的引物探针组只需30min内即可完成，无需先将RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增即可完成检测，检测快速、灵敏，特异性好，无假阳性，适合基层和现场检测；对新型冠状病毒的快速诊断具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。
附图说明
图1～图5为本发明用质粒对46对引物探针组筛选出来符合要求的5对不同引物探针筛选图，其中图1为组合1，图2为组合2，图3为组合3，图4为组合4，图5为组合5。图中，“1”为红色曲线，“2”为蓝色曲线，“3”为绿色曲线。
图6为新型冠状病毒SARS-CoV-2病毒培养物的核酸稀释10倍5个组合扩增图。图中，“1”为红色曲线，“2”为蓝色曲线，“3”为绿色曲线，“4”为黑色曲线，“5”为粉色曲线。
图7为新型冠状病毒培养物的核酸稀释105倍5个组合扩增图。图中，“1”为红色曲线，“2”为蓝色曲线，“3”为绿色曲线，“4”为黑色曲线，“5”为粉色曲线。
图8为新型冠状病毒培养物的核酸稀释106倍5个组合扩增图。图中，“1”为红色曲线，“2”为蓝色曲线，“3”为绿色曲线，“4”为黑色曲线，“5”为粉色曲线。
图9为新型冠状病毒SARS-CoV-2培养物的核酸稀释109倍2、4、5组合扩增图。图中，“2”为蓝色曲线，“4”为黑色曲线，“5”为粉色曲线。
图10为新型冠状病毒培养物的核酸稀释1010倍2、4、5组合扩增图。图中，“2”为蓝色曲线，“4”为黑色曲线，“5”为粉色曲线。
图11是1号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本均未有扩增。
图12是2号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本均有扩增，但阴性对照明显有橇尾现象，存在假阴性风险。
图13是3号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本只有106有扩增，且起峰时间更晚。
图14是4号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本只有106有扩增且起峰时间更晚。
图15为本发明实施例3提供的最佳引物探针组不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果图。
图16为本发明实施例4提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组质粒DNA重复性检测结果图。
图17为本发明实施例5提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性检测结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1特异性引物探针组合的初步筛选
针对中国疾病预防控制中心公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的全序列共包含10个基因进行综合分析比较，结合防控疫情需要，达到快速筛查的目的，本发明核心解决快速、灵敏，准确这三个基本点，从10个基因中选择保守性最优的ORF 1ab基因序列进行设计引物探针，且为了更快更准的检测出新型冠状病毒SARS-CoV-2，针对ORF 1ab基因进行单一基因检测，减少检测多重基因的干扰，提高扩增速度和检测灵敏度；
具体设计运用DNAMAN软件进行冠状病毒同源性分析和b1ast序列分析，筛出新型冠状病毒ORF 1ab序列中保守度及特异性俱佳的两个区间分别如SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5所示。
在已选择的区间上优先进行探针的设计，探针的设计方法与原则探针长度选择46-52个碱基，荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰在碱基T上，荧光报告基团和荧光淬灭基团间隔距离不超过5个碱基，间隔碱基越少，荧光本底干扰就越小，根据以上设计要求确定探针位置，优先设计的2条探针序列为：
第1条：TTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAG(SEQ ID NO.6)
第2条：TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGGTAATCACTGGGTTACAT(SEQ ID NO.3)
对以上两条探针进行修饰，修饰后为：
TTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGT(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CAACAAGACGGCAG
TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGG(FAM-dT)(THF)A(BHQ1-dT)CACTGGGTTACAT
确定探针以后按不同长度设计引物，防止产生假阳性必须避开发卡结构和引物二聚体，区间SEQ ID NO.4设计了30对，区间SEQ ID NO.5设计了16对，共46对特异性引物和2条探针进行引物探针灵敏度筛选。
将SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5两个区间序列合二为一，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒，质粒大小991bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，梯度制备工作标准品备用，分别为：
工作标准品1-5，分别含有1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100Copies/μL新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒。
用工作标准品进行引物探针组合的筛选，通过筛选，优选出灵敏度达到10拷贝/测试的引物探针组，具体实施方法为：
(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制46对引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，将配制好的引物探针与F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液混合，每47μL通用反应缓冲液中加入1μL配制好的探针和1μL引物混合，得到本发明所述的反应缓冲液；将配制好的49μL试剂加入到F00R01冻干反应单元中，使其充分溶解并混均；实际进行配制时的具体操作为：46对引物探针组分别用工作标准品3、工作标准品4、工作标准品5进行灵敏度筛选时，可以按每次5个扩增反应体系进行配制，用移液器吸取235μL通用反应缓冲液中加入5μL配制好的探针和5μL引物混合，再分装至反应单元中重溶。
(4)用工作标准品进行引物探针筛选时加样量为1μL。将1μL工作标准品加入所述步骤(3)中得到的反应扩增体系，放入RAA-B6100仪器中进行混匀后，放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；
(5)有扩增曲线的为阳性，没有荧光增长的为阴性；
经过第一轮筛选出符合要求的5个组合，这5对组合筛选情况见图1-图5，其中图1为组合1，图2为组合2，图3为组合3，图4为组合4，图5为组合5。5对组合的引物探针序列如下表1：
表1
Figure BDA0002419861060000091
实施例2特异性引物探针组合的确定
在上述实施例1中的5个引物探针组合基础上用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物核酸进一步进行适应性筛选，选出灵敏度最高的一对引物探针即为本发明提供的引物探针组；
本实施例目的是筛选出最灵敏的引物探针组，将核酸原液按10倍倍比稀释，稀释至102、103、104、105、106、107、108、109、1010共十个梯度，加样量为5μL。
具体实施方法为：(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制5对引物探针组溶液，准备好核酸稀释样品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，将配制好的引物探针与F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液混合，每43μL通用反应缓冲液中加入1μL配制好的探针和1μL引物混合，得到本发明所述的反应缓冲液；将配制好的45μL试剂加入到F00R01冻干反应单元中，使其充分溶解并混均；实际进行配制时的具体操作为：5对引物探针组分别用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物核酸的梯度稀释进行灵敏度及适应性筛选，按同一浓度5对引物探针同步进行比对筛选出最好的一对，每次6个扩增反应体系进行配制，用移液器吸取301μL通用反应缓冲液中加入7μL配制好的探针和7μL引物混合，再按每个反应单元中加入45μL重溶。
(4)用核酸进行引物探针筛选时为了提高灵敏度加样量为5μL。将5μL工作标准品加入所述步骤(3)中得到的反应扩增体系，放入RAA-B6100仪器中进行混匀后，放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；
(5)有扩增曲线的为阳性，没有荧光增长的为阴性；
按以上方法，图6是10倍稀释的扩增图，从图中可见5个组合均有扩增。图7是105倍稀释的扩增图，从图中可见5个组合也均有扩增。图8是106倍稀释的扩增图，从图中可见只有3个组合有扩增，分别是2号、4号、5号组合。图9是109倍稀释的扩增图，从图中可见只有1个组合有扩增，是5号组合。图10是1010倍稀释的扩增图，从图中可见也只有1个组合有扩增，也是5号组合。
经过本轮筛选出符合要求最优的组合，这5对组合筛选情况见图6-图10，通过两轮的筛选和评价，最终确定的引物探针组为5号组合，其引物探针为：
上游引物序列5’-CACGTAGGAATGTGGCAACTTTACAAGCTG-3’
(SEQ ID NO.1)；
下游引物序列5’-CTTAGGTATGCCAGGTATGTCAACACATAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
未修饰的探针为：5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGGTAATCACTGGGTTACAT-3’(SEQ ID NO.3)。
所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数34bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AA，其中第一个A碱基用四氢呋喃残基替换。经过修饰的探针为：
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGG(FAM-DT)(THF)A(BHQ1-DT)CACTGGGTTACAT-3’；
其中，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃残基。该探针标识为探针0。
对SEQ ID NO.3所示的探针采用不同的修饰方法进行灵敏度比对：
1、荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数34bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AA，不作四氢呋喃残基替换修饰。经过修饰的探针为
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGG(FAM-DT)AA(BHQ1-DT)CACTGGGTTACAT-3’标识为探针1；
2、荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数34bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AA，第二个碱基A用四氢呋喃残基替换修饰。经过修饰的探针为
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGG(FAM-DT)A(THF)(BHQ1-DT)CACTGGGTTACAT-3’标识为探针2；
3、荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数23bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数26bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AG，第一个碱基A用四氢呋喃残基替换修饰。经过修饰的探针为
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTG(FAM-DT)(THF)G(BHQ1-DT)AAGGTAATCACTGGGTTACAT-3’标识为探针3；
4、荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数34bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数38bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基CAC，第二个碱基A用四氢呋喃残基替换修饰。经过修饰的探针为
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGGTAA(FAM-DT)C(THF)C(BHQ1-DT)GGGTTACAT-3’标识为探针4；
对以上不同修饰的探针进行验证。采用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物三个核酸稀释样品106、109、1010，加样量为5μL。
具体实施方法为：
(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制这4组引物探针组溶液，准备好核酸稀释样品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪徇器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，将配制好的引物探针与F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液混合，每43μL通用反应缓冲液中加入1μL配制好的探针和1μL引物混合，得到本发明所述的反应缓冲液；将配制好的45μL试剂加入到F00R01冻干反应单元中，使其充分溶解并混均；实际进行配制时的具体操作为：4对引物探针组分别用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物核酸的梯度稀释进行灵敏度及适应性筛选，按同一对引物探针对三个浓度核酸进行筛选，与原探针比选出最好的修饰方法，每次5个扩增反应体系进行配制，用移液器吸取215μL通用反应缓冲液中加入5μL配制好的探针和5μL引物混合，再按每个反应单元中加入45μL重溶。
(4)用核酸进行引物探针筛选时为了提高灵敏度加样量为5μL。将5μL工作标准品加入所述步骤(3)中得到的反应扩增体系，放入RAA-B6100仪器中进行混匀后，放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；
(5)有扩增曲线的为阳性，没有荧光增长的为阴性；比较每个浓度的起峰情况。
图11是1号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本均未有扩增。图12是2号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见有二个梯度106、109的核酸稀释样本有扩增，且阴性对照明显有翘尾现象，存在假阳性风险。图13是3号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本只有106有扩增，且起峰时间更晚。图14是4号探针对106、109、1010三个核酸稀释样本扩增图，从图中可见三个梯度的核酸稀释样本只有106有扩增且起峰时间更晚。
经过本轮比对探针上的各种位置修饰灵敏度均没有0号探针灵敏，也没有0号探针起峰快，通过本轮的筛选和评价，最终确定为0号探针。
由以上的比对实验得出结论，如荧光报告基团与淬灭基团之间不作四氢呋喃残基修饰，检测不到荧光，其他的在探针上的任何修饰均达不到快速、灵敏的效果。只能按以下修饰才能满足要求：荧光报告基团选FAM，荧光淬灭基团选BHQ1，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离5'端碱基数34bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AA，其中第一个A碱基用四氢呋喃残基替换。经过修饰的探针为：
5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGG(FAM-DT)(THF)A(BHQ1-DT)CACTGGGTTACAT-3’；其中，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团，THF为四氢呋喃残基。
实施例3检测新型冠状病毒试剂盒的灵敏度验证
本发明提供的检测新型冠状病毒试剂盒中，含有反应单元及反应缓冲液两部分；反应缓冲液中含有实施例2确定的新型冠状病毒SARS-CoV-2特异性引物探针组。
反应缓冲液是在江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液中加入本申请所述的特异性引物探针组配制而成，反应缓冲液中组份为：上游引物、下游引物、探针、Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000；
反应单元为江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应单元，主要包括以下组分：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
用50μL的移液器吸取本发明所述的反应缓冲液加入冻干反应单元中配制成扩增体系，再加入1-5μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA样本，在等温条件下，混匀并进行逆转录4-10分钟后，放入荧光检测仪中进行实时检测。引物探针采用实施例2确定的5号引物探针组合，修饰探针为0号探针。
新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒阳性标准品制备好的不同浓度的工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有1.0×105Copies/μL新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒。工作标准品(阳性质控品)2，含有1.0×104Copies/μL新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒。工作标准品3-6，分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100Copies/μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组DNA质粒。
实施方法：(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制7个反应单元(第7反应单元加入样品为阴性质控品，第1-6个单元加入样品分别为工作标准品1-6)的引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液管里吸取330μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入8μL配制好的探针和8μL引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备7个F00R01荧光反应单元，吸取步骤(3)中混匀的反应缓冲液48μL分别加入到准备好的7个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系。
(5)加样反应:在以上7个配制好的反应扩增体系中分别加入2μL阴性质控品、2μL工作标准品6、2μL工作标准品5、2μL工作标准品4、2μL工作标准品3、2μL工作标准品2、2μL工作标准品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
将反应管放入RAA-B6100振荡混匀仪中进行混匀，再放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间10分钟。检测结果如图15所示。结果显示最快1分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，最低灵敏度可以达到2.0×100Copies/测试，表明本发明灵敏度高，检测时间短。
(6)有扩增曲线的为阳性，没有荧光增长的为阴性；
实施例4检测新型冠状病毒试剂盒的重复性验证
引物探针及阳性质控品序列与实施例3相同。
实施方法：(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制7个反应单元的引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液管里吸取380μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入9μL配制好的探针和9μL引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备9个F00R01荧光反应单元，吸取步骤3中混匀的反应缓冲液48μL分别加入到准备好的9个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系，并作好标记。
(5)加样反应:在以上9个配制好的反应扩增体系中其中1个反应扩增体系中加入2μL阴性质控品、其他8个反应扩增体系中均加入2μL工作标准品4为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
将反应管放入RAA-B6100振荡混匀仪中进行混匀，再放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间10分钟。检测结果如图16所示。结果显示扩增反应重复性好。
实施例5检测新型冠状病毒试剂盒的特异性验证
引物探针及阳性质控品序列与实施例3相同。
特异性实验中样本选择为常见的呼吸道病毒及细菌和人类冠状病毒，具体为：冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌及新型冠状病毒SARS-CoV-2。
其中冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌样本核酸以及新型冠状病毒SARS-CoV-2样本核酸由中国疾病预防控制中心提供。
实施方法：(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度进行配制16个反应单元的引物探针组溶液，准备好冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌样本核酸以及新型冠状病毒SARS-CoV-2样本核酸和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为39℃，反应时间：10min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液管里吸取760μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入16μL配制好的探针和16μL引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备16个F00R01荧光反应单元，吸取步骤3中混匀的反应缓冲液48μL分别加入到准备好的16个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系，并作好标记。
(5)加样反应:在以上16个配制好的反应扩增体系中分别加入2μL阴性质控品、各2μL冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌样本核酸以及新型冠状病毒SARS-CoV-2样本核酸、2μL阳性质控品，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
将反应管放入RAA-B6100振荡混匀仪中进行混匀，再放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间10分钟。检测结果如图17所示。
结果显示除了阳性质控品和新型冠状病毒SARS-CoV-2样本核酸有明显的扩增外，其他冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、人博卡病毒、副流感病毒、合胞病毒、人偏肺病毒、衣原体、流感病毒、肺炎链球菌及阴性质控品均无荧光增加，显示特异性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江苏奇天基因生物科技有限公司
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法
<130> KHP201111089.3
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtaggaa tgtggcaact ttacaagctg 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttaggtatg ccaggtatgt caacacataa ac 32
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taacaggact ctttaaagat tgtagtaagg taatcactgg gttacat 47
<210> 4
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 60
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 480
<210> 5
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agattttggg actaccaact caaactgttg attcatcaca gggctcagaa tatgactatg 60
tcatattcac tcaaaccact gaaacagctc actcttgtaa tgtaaacaga tttaatgttg 120
ctattaccag agcaaaagta ggcatacttt gcataatgtc tgatagagac ctttatgaca 180
agttgcaatt tacaagtctt gaaattccac gtaggaatgt ggcaacttta caagctgaaa 240
atgtaacagg actctttaaa gattgtagta aggtaatcac tgggttacat cctacacagg 300
cacctacaca cctcagtgtt gacactaaat tcaaaactga aggtttatgt gttgacatac 360
ctggcatacc taaggacatg acctatagaa gactcatctc tatgatgggt tttaaaatga 420
attatcaagt taatggttac cctaacatgt ttatcacccg cgaagaagct ataagacatg 480
tacgtgcatg gattggcttc gatgtcgagg g 511
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttggttagat gatgatagtc aacaaactgt tggtcaacaa gacggcag 48
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatggtactg aagatgatta ccaaggtaaa c 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgaacctca acaattgttt gaatagtagt 30
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaacctgaa gaagagcaag aagaagattg g 31
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagtctgaac aactggtgta agttccatct ct 32
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagttgcaa tttacaagtc ttgaaattcc acg 33
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttctatagg tcatgtcctt aggtatgcca g 31
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caatttacaa gtcttgaaat tccacgtagg aatg 34
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catcatagag atgagtcttc tataggtcat gtc 33

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
3.根据权利要求2所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；和/或所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
4.含有权利要求1-3任一所述特异性引物探针组的试剂盒。
5.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-3任一所述的特异性引物探针组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，上游引物浓度为0.02-0.05mM，下游引物浓度为0.02-0.05mM；优选上游引物浓度为0.03mM，下游引物浓度为0.03mM。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，探针浓度为0.01-0.03mM，优选0.02mM。
8.如权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序是以待测样品基因组RNA为模板，利用特异性引物探针组，进行RT-RAA荧光扩增，根据荧光信号判定结果。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，扩增检测在等温条件下温度为37-42℃，优选39℃，扩增检测时间为10-15min。
10.一种检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测方法，其特征在于，以待测样品基因组RNA为模板，利用特异性引物探针组，进行RT-RAA荧光扩增，根据荧光信号判定结果。
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