CN114080455A

CN114080455A - SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒

Info

Publication number: CN114080455A
Application number: CN202080025979.1A
Authority: CN
Inventors: 安田二朗; 吉川禄助; 阿部遥
Original assignee: Nagasaki University NUC; Canon Medical Systems Corp
Current assignee: Nagasaki University NUC; Canon Medical Systems Corp
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-02-22
Also published as: US20220010389A1; WO2021255787A1; JP6905235B1; BR112021016179B1; BR112021016179A2; JPWO2021255787A1; US11345971B2

Abstract

本发明提供一种能够通过SARS‑CoV‑2来源的核酸的特异性扩增来迅速检测SARS‑CoV‑2的技术。更具体而言，本发明提供一种涉及SARS‑Co V‑2检测用引物组以及该引物组的用途的技术，所述SARS‑CoV‑2检测用引物组包含以SARS‑CoV‑2基因组中的1个以上的开放阅读框(ORF)区域为靶的多个LAMP用引物，其中，1个以上的ORF区域选自Orf1b、OrfM、OrfN和OrfS。

Description

SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、 SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒

技术领域

本发明涉及SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒。

背景技术

已清楚新型冠状病毒感染病即COVID-19是以冠状病毒SARS-CoV-2(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，重症急性呼吸综合征冠状病毒2)为原因的感染病。

SARS-CoV-2是具有单链的正链RNA基因组的包膜病毒，属于β-冠状病毒属的SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV)。虽然认为该病毒并不是2003年在中国流行的SARS冠状病毒即SARS-CoV的直接子孙，但以SARS-CoV被命名为SARS-CoV-2。

目前，作为通过冠状病毒来源的核酸的特异性扩增来检测冠状病毒的技术，RT-PCR法已被实用化。实际上，即使在SARS-CoV-2的检测中，RT-PCR法也早被实用化。但是，通过RT-PCR法进行的冠状病毒的检测若还考虑检样的前处理时间，则需要长时间(典型地为约6～8小时)，因此缺乏迅速性。关于这一点，作为能够进行基于冠状病毒来源的核酸的特异性扩增的冠状病毒的迅速检测的技术，报告了使用特定的引物组的LAMP法(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5740112号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，由于上述已报告的LAMP法不是以SARS-CoV-2为靶的，因此存在对SARS-CoV-2的检测有障碍的课题。

因此，本发明的目的在于提供一种能够进行通过SARS-CoV-2来源的核酸的特异性扩增进行SARS-CoV-2的迅速检测的技术。

用于解决课题的手段

本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过使用了特定引物的RT-LAMP法，能够在特异性扩增SARS-CoV-2来源的核酸的同时，迅速地检测SARS-CoV-2。本发明者们还发现，这样的RT-LAMP法的灵敏度和简便性优异，并且能够实现高的诊断灵敏度和诊断特异性等，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

〔1〕一种SARS-CoV-2检测用引物组，其包含以SARS-CoV-2基因组中的1个以上的开放阅读框(ORF)区域为靶的多个LAMP用引物，其中，

1个以上的ORF区域选自Orf1b、OrfM、OrfN和OrfS。

〔2〕根据〔1〕所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域选自下述(1)～(6)：

(1)与相对于序列号5的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的Orf1b中的部分区域；

(2)与相对于序列号3的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的Orf1b中的部分区域；

(3)与相对于序列号7的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfM中的部分区域；

(4)与相对于序列号9的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfN中的部分区域；

(5)与相对于序列号11的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfS中的部分区域；以及

(6)与相对于序列号12的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfS中的部分区域。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物。

〔4〕根据〔3〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物选自下述(1)～(6)：

(1)分别包含序列号13～16的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物；

(2)分别包含序列号19～22的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物；

(3)分别包含序列号25～28的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物；

(4)分别包含序列号31～34的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物；

(5)分别包含序列号37～40的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物；以及

(6)分别包含序列号43～46的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物。

〔5〕根据〔1〕或〔2〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物和LB引物。

〔6〕根据〔5〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物选自下述(1)～(6)：

(1)分别包含序列号13～18的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物；

(2)分别包含序列号19～24的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物；

(3)分别包含序列号25～30的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物；

(4)分别包含序列号31～36的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物；

(5)分别包含序列号37～42的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物；以及

(6)分别包含序列号43～48的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物。

〔7〕根据〔1〕所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域包含ORF1b。

〔8〕根据〔2〕所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域包含(1)与相对于序列号5的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的ORF1b中的部分区域。

〔9〕根据〔4〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含(1)分别包含序列号13～16的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物。

〔10〕根据〔6〕所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含(1)分别包含序列号13～18的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物。

〔11〕一种用于检查SARS-CoV-2的方法，其包含在RT-LAMP法中使用〔1〕～〔10〕中任一项所述的引物组，在从受检对象得到的检样中检测SARS-CoV-2。

〔12〕根据〔11〕所述的方法，其中，所述检样是鼻腔拭子、咽头拭子、或痰。

〔13〕根据〔11〕或〔12〕所述的方法，其中，在检样加热处理后检测SARS-CoV-2。

〔14〕一种SARS-CoV-2的检查试剂，其包含〔1〕～〔10〕中任一项所述的引物组。

〔15〕一种SARS-CoV-2的检查试剂盒，其包含下述(1)～(3)：

(1)〔1〕～〔10〕中任一项所述的引物组；

(2)链置换型DNA聚合酶；以及

(3)逆转录酶。

发明效果

根据本发明，能够在特异性地扩增SARS-CoV-2来源的核酸的同时，迅速地检测SARS-CoV-2。本发明的灵敏度和简便性优异，并且能够实现高的诊断灵敏度和诊断特异性等。

附图说明

图1是表示与编码SARS-CoV-2基因组中的Orf1b的碱基序列(序列号1)中的第1～4080位的核苷酸序列对应的Orf1b的部分碱基序列(序列号2)的图。下划线部分表示实施例中编码用LAMP用引物扩增的第一部分区域(245个碱基长)的碱基序列(序列号3)。

图2是表示与编码SARS-CoV-2基因组中的Orf1b的碱基序列(序列号1)中的第4081～8088位的核苷酸序列对应的Orf1b的部分碱基序列(序列号4)的图。下划线部分表示实施例中编码用LAMP用引物扩增的第二部分区域(256个碱基长)的碱基序列(序列号5)。

图3是表示编码SARS-CoV-2基因组中的OrfM的碱基序列(序列号6)的图。下划线部分表示实施例中编码用LAMP用引物扩增的区域(215个碱基长)的碱基序列(序列号7)。

图4是表示编码SARS-CoV-2基因组中的OrfN的碱基序列(序列号8)的图。下划线部分表示实施例中编码用LAMP用引物扩增的区域(231个碱基长)的碱基序列(序列号9)。

图5是表示编码SARS-CoV-2基因组中的OrfS的碱基序列(序列号10)的图。下划线部分表示实施例中编码用LAMP用引物扩增的第一部分区域(229个碱基长)的碱基序列(序列号11)、以及编码第二部分区域(266个碱基长)的碱基序列(序列号12)。

图6是表示靶核酸与4个LAMP用引物的关系的图。

图7是表示靶核酸与6个LAMP用引物的关系的图。

具体实施方式

本发明提供一种SARS-CoV-2检测用引物组，其包含以SARS-CoV-2基因组中的1个以上的开放阅读框(ORF)区域为靶的多个LAMP用引物。作为靶的1个以上的ORF区域选自Orf1b、OrfM、OrfN和OrfS。

在本发明中作为靶的SARS-CoV-2基因组是SARS-CoV-2的任意病毒株中的RNA基因组。作为这样的病毒株，例如可举出L型和S型的主要病毒株、以及它们的亚病毒株。作为SARS-CoV-2基因组，报告了多种病毒株中的RNA基因组。例如，对于这样的多种病毒株的SARS-CoV-2基因组，可以参照流感病毒基因数据库GISAID(Global Initiative onSharing All Influenza Data，全球流感共享数据库)的公开信息(https://www.gisaid.org/epiflu-applications/next-hcov-19-app/)。

LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification，环介导等温扩增)法是能够利用等温反应进行靶核酸的扩增的方法。LAMP法具有能够通过包含6个区域的4个以上的引物特异性扩增靶核酸的特征。

多个LAMP用引物可以设计成能够与SARS-CoV-2基因组中的靶RNA及其cDNA的特定区域结合。在LAMP用引物的设计中，确定表达为F3c区域、F2c区域、F1c区域、B1区域、B2区域和B3区域的靶RNA中的区域(从3’侧向5’侧的朝向)、以及表达为F3区域、F2区域、F1区域、B1c区域、B2c区域和B3c区域的cDNA中的区域(从5’侧向3’侧的朝向)。这里，F1区域和F1c区域、F2区域和F2c区域、F3区域和F3c区域、B1区域和B1c区域、B2区域和B2c区域、B3区域和B3c区域是由互补的碱基序列构成的区域。

多个LAMP用引物包含F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(图6)。F3引物包含F3区域的碱基序列。B3引物包含B3区域的碱基序列。FIP引物从5’侧向3’侧包含F1c区域的碱基序列和F2区域的碱基序列。BIP引物从5’侧向3’侧包含B1c区域的碱基序列和B2区域的碱基序列。用箭头表示与这些引物的各碱基序列对应的模板核酸中的区域。箭头的方向表示对应的引物在各碱基序列上的方向性，箭头的起点表示5’端、箭头的终点表示3’端。

多个LAMP用引物除了F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物以外，还可以包含LF引物和/或LB引物作为环状引物(图7)。通过并用环状引物，能够进一步提高扩增效率。LF引物和LB引物可以分别包含LFc区域和LB区域的碱基序列。另外，环状引物也可以设计为可与扩增产物的环状部分结合。作为环状部分，例如可举出从F2c区域的5’端到比F1c区域的3’端更靠3’侧的核苷酸残基为止的范围、以及从B2区域的3’端到比B1区域的5’端更靠5’侧的核苷酸残基为止的范围。

多个LAMP用引物可以包含上述区域的碱基序列或其互补碱基序列中的连续的至少13个核苷酸残基。多个LAMP用引物还可以包含上述区域的碱基序列或其互补碱基序列中的连续的至少14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸残基。

在一个实施方式中，作为靶的1个以上的ORF区域包含Orf1b。作为编码Orf1b的碱基序列，报告有序列号1的碱基序列(对应于GenBank登记号：MN908947中的第13468～21555位的核苷酸残基)。病毒的进化速度快，容易蓄积多个突变。另一方面，仅显示小于90％的同源性的碱基序列在病毒学上可以认为不是同一病毒来源的碱基序列。根据这样的观点，为了覆盖可在SARS-CoV-2病毒株间产生的基因组序列的差异，同时避免与不同的病毒(例如SARS-CoV)的交叉反应，可以基于相对于靶区域的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列来设计多个LAMP用引物。因此，在以Orf1b为靶的情况下，可以基于相对于序列号1的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列来设计多个LAMP用引物。

优选的是，Orf1b上的靶是与相对于序列号3的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的ORF1b中的第一部分区域(245个碱基长)、或与相对于序列号5的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的ORF1b中的第二部分区域(256个碱基长)。对于这样的第一部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号19～22的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号23和24的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。另外，对于这样的第二部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号13～16的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号17和18的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。

在另一实施方式中，作为靶的1个以上的ORF区域包含OrfM。作为编码OrfM的碱基序列，报告有序列号6的碱基序列(对应于GenBank登记号：：MN908947中的第26523～27191位的核苷酸残基)。在以OrfM为靶的情况下，可以基于相对于序列号6的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列来设计LAMP用引物。

优选的是，OrfM上的靶是与相对于序列号7的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfM中的部分区域(215个碱基长)。对于这样的部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号25～28的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号29和30的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。

在另一实施方式中，作为靶的1个以上的ORF区域包含OrfN。作为编码OrfN的碱基序列，报告有序列号8的碱基序列(对应于GenBank登记号：MN908947中的第28274～29533位的核苷酸残基)。在以OrfN为靶的情况下，可以基于相对于序列号8的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列来设计LAMP用引物。

优选的是，OrfN上的靶是与相对于序列号9的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfN中的部分区域(231个碱基长)。对于这样的部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号31～34的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号35和36的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。

在又一实施方式中，作为靶的1个以上的ORF区域包含OrfS。作为编码OrfS的碱基序列，报告有序列号10的碱基序列(对应于GenBank登记号：MN908947中的第21563～25384位的核苷酸残基)。在以OrfS为靶的情况下，可以基于相对于序列号10的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列来设计LAMP用引物。

优选的是，OrfS上的靶是与相对于序列号11的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfS中的第一部分区域(229个碱基长)、或与相对于序列号12的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的OrfS中的第二部分区域(266个碱基长)。对于这样的第一部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号37～40的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号41和42的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。另外，对于这样的第二部分区域，可以设计F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物(例如分别包含序列号43～46的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物)、以及根据需要的LF引物和LB引物(例如分别包含序列号47和48的碱基序列、或它们的互补序列的2个环状引物)。

在特定的实施方式中，包含以上述1个以上的ORF区域为靶的多个LAMP用引物的引物组可以确定为包含下述由(a)～(d)表示的4个引物以及根据需要的下述由(e)和(f)表示的2个环状引物的引物组：

(a)包含由上述1个以上的ORF区域中的F3区域内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或其互补碱基序列的第一引物(相当于F3引物或其互补引物)；

(b)包含由上述1个以上的ORF区域中的B3区域内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或其互补碱基序列的第二引物(相当于B3引物或其互补引物)；

(c)包含在上述1个以上的ORF区域中，从5’侧向3’侧的由F1c区域内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、以及由F2区域的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或它们的互补碱基序列的第三引物(相当于FIP引物或其互补引物)；

(d)包含在上述1个以上的ORF区域中，从5’侧向3’侧的由B1c区域内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、以及由B2区域的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或它们的互补碱基序列的第四引物(相当于BIP引物或其互补引物)；

(e)包含在上述1个以上的ORF区域中，由位于从F2c区域的5’端到比F1c区域的3’端更靠3’侧的核苷酸残基为止的范围的区域(例如LFc区域)内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或其互补碱基序列的第五引物(相当于LF引物或其互补引物)；以及

(f)包含在上述1个以上的ORF区域中，由位于从B2区域的3’端到比B1区域的5’端更靠5’侧的核苷酸残基为止的范围的区域(例如LB区域)内的连续的至少13个核苷酸残基构成的碱基序列、或其互补碱基序列的第六引物(相当于LB引物或其互补引物)；

在上述特定的实施方式中，在期望以Orf1b的上述部分区域为靶的情况下，也优选基于下述区域来设计第一～六引物。

(i)F3c区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第23～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第58～40位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第122～98位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第175～151位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第226～205位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号2的碱基序列中的第256～234位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以ORF1b的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号13～18的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

在上述特定的实施方式中，在期望以Orf1b的上述部分区域为靶的情况下，也优选基于下述区域来设计第一～六引物：

(i)F3c区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第20～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第50～31位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第105～81位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第163～139位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第217～199位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号4的碱基序列中的第245～224位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以Orf1b的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号19～24的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

在上述特定的实施方式中，在期望以OrfM的上述部分区域为靶的情况下，也优选基于下述区域来设计第一～六引物：

(i)F3c区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第19～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第39～22位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第97～75位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第123～100位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第183～165位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号6的碱基序列中的第215～195位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以OrfM的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号25～30的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

在上述特定的实施方式中，在期望以OrfN的上述部分区域为靶的情况下，也优选基于下述区域来设计第一～六引物：

(i)F3c区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第18～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第57～37位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第109～87位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第143～122位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第203～183位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号8的碱基序列中的第231～214位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以OrfN的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号31～36的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

在上述特定的实施方式中，在期望以OrfS的上述部分区域为靶的情况下，也优选基于下述区域来设计第一～六引物：

(i)F3c区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第18～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第40～22位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第92～70位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第149～125位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第200～179位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号10的碱基序列中的第229～207位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以OrfS的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号37～42的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

(i)F3c区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第20～1位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(ii)F3区域：编码F3c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(iii)F2c区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第59～41位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(iv)F2区域：编码F2c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(v)F1c区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第114～93位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(vi)F1区域：编码F1c区域的碱基序列的互补碱基序列；

(vii)B1区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第165～141位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(viii)B1c区域：编码B1区域的碱基序列的互补碱基序列；

(ix)B2区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第222～199位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；

(x)B2c区域：编码B2区域的碱基序列的互补碱基序列；

(xi)B3区域：相对于由序列号12的碱基序列中的第266～243位的核苷酸残基构成的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列；以及

(xii)B3c区域：编码B3区域的碱基序列的互补碱基序列；

更优选的是，以OrfS的上述部分区域为靶的第一～六引物为分别包含序列号43～48的碱基序列或它们的互补序列的6个引物。

相对于序列号1～12的各碱基序列的同源性百分数如上所述为90％以上，优选为91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或99.5％以上。同源性百分数可以通过根据Huang和Mille的算法的LALIGN来确定(Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357)。LALIGN在作为Bioinfomatics Resource Portal的ExPASy中公开(https://embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.htm)。因此，简便而言，同源性百分数可以通过以默认设定利用如上述公开的程序即LALIGN来确定。LALIGN的默认设定如下。Choose the alignment method：local；Number of reported sub-alignments：3；E-value threshold：10.0；Scoring matrix：BLOSUM50；Opening gappenalty：-12；Extending gap penalty：-2。

对于如上述那样算出的同源性百分数而言，相对于序列号1～12的各碱基序列的全长，允许10％以下的个数的核苷酸残基的突变(即替换、附加、缺失及插入、以及它们的组合)。例如，在相对于序列号X的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列中，如果碱基序列X的碱基序列的全长为1000个碱基长度，则允许至多100个的突变，另外，如果碱基序列X的碱基序列的全长为100个碱基长度，则允许至多10个的突变。所允许的突变的个数根据所期望的同源性百分数的程度、以及所期望的碱基序列X的全长而变动，例如为100个以下、优选为80个以下、更优选为60个以下、更进一步优选为40个以下、特别优选为30个以下、25个以下、20个以下、15个以下、12个以下、10个以下、8个以下、6个以下、5个、4个、3个、2个、或1个。更具体而言，在期望以ORF1b中的上述部分区域(256个碱基长)为靶的情况下，在相对于序列号2的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列中所允许的突变的个数为25个以下，在相对于序列号2的碱基序列显示92％以上同源性的碱基序列中所允许的突变的个数为20个以下，在相对于序列号2的碱基序列显示94％以上同源性的碱基序列中所允许的突变的个数为15个以下，在相对于序列号2的碱基序列显示96％以上同源性的碱基序列中所允许的突变的个数为10个以下，在相对于序列号2的碱基序列显示98％以上同源性的碱基序列中所允许的突变的个数为5个以下。

在特定的实施方式中，本发明中使用的引物组也可以包含选自下述(A)～(D)中的1种以上的引物组。

(A)以ORF1b为靶的选自下述(A1)～(A4)中的1个以上的引物组：

(A1)分别包含序列号13～16的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；

(A2)分别包含序列号13～18的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物；

(A3)分别包含序列号19～22的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(A4)分别包含序列号19～24的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物。

(B)以OrfM为靶的选自下述(B1)和(B2)中的1个以上的引物组：

(B1)分别包含序列号25～28的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(B2)分别包含序列号25～30的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物。

(C)以OrfN为靶的选自下述(C1)和(C2)中的1个以上的引物组：

(C1)分别包含序列号31～34的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(C2)分别包含序列号31～36的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物。

(D)以OrfS为靶的选自下述(D1)～(D4)中的1个以上的引物组：

(D1)分别包含序列号37～40的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；

(D2)分别包含序列号37～42的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物；

(D3)分别包含序列号43～46的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(D4)分别包含序列号43～48的碱基序列或它们的均等序列、或它们的互补序列的6个引物。

均等排列是相对于对象碱基序列包含选自替换、附加、缺失及插入中的1～5个(优选为1～3个、更优选为1或2个、更进一步优选为1个)碱的修饰的碱基序列。

在优选的特定的实施方式中，本发明中使用的引物组也可以包含选自下述(A’)～(D’)中的1个以上的引物组。

(A’)以ORF1b为靶的选自下述(A1’)～(A4’)中的1个以上的引物组：

(A1’)分别包含序列号13～16的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；

(A2’)分别包含序列号13～18的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物；

(A3’)分别包含序列号19～22的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(A4’)分别包含序列号19～24的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物。

(B’)以OrfM为靶的选自下述(B1’)和(B2’)中的1个以上的引物组：

(B1’)分别包含序列号25～28的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(B2’)分别包含序列号25～30的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物。

(C’)以OrfN为靶的选自下述(C1’)和(C2’)中的1个以上的引物组：

(C1’)分别包含序列号31～34的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(C2’)分别包含序列号31～36的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物。

(D’)以OrfS为靶的选自下述(D1’)～(D4’)中的1个以上的引物组：

(D1’)分别包含序列号37～40的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；

(D2’)分别包含序列号37～42的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物；

(D3’)分别包含序列号43～46的碱基序列、或它们的互补序列的4个引物；以及

(D4’)分别包含序列号43～48的碱基序列、或它们的互补序列的6个引物。

在上述的1个以上的ORF区域中，优选以Orf1b为靶的区域，特别优选以Orf1b的部分区域(序列号5)为靶的区域。通过以Orf1b或其部分区域(序列号5)为靶，能够高灵敏度地检测SARS-CoV-2。

本发明还提供用于检查SARS-CoV-2的方法。本发明的方法包含在RT-LAMP法中使用包含上述那样的多个LAMP用引物的引物组，在从受检对象得到的检样中检测SARS-CoV-2。

作为可得到检样的受检对象，可以利用可感染SARS-CoV-2的任意的受检对象。作为这样的受检对象，例如可举出哺乳动物(例如人、猴等灵长类；小鼠、大鼠、兔等啮齿类；牛、猪、山羊、马、绵羊等家畜或驱使动物、狗、猫等宠物)、鸟类(例如鸡)。优选受检对象是人等哺乳动物。从临床应用的观点出发，受检对象优选为人。

作为检样，可以利用可含有SARS-CoV-2的任意的生物学试样。作为这样的检样，例如可举出鼻腔拭子、咽头拭子、痰、唾液、清洗液(例如鼻腔清洗液、口腔内清洗液、支气管清洗液、肺清洗液)、血液(例如全血、血浆、血清)、脑脊髓液、以及其他检样(例如包含感染细胞的检样)。从以低侵袭性、迅速且简便地获得可含有大量SARS-CoV-2的检样的观点出发，检样优选为鼻腔拭子、咽头拭子、唾液、或痰。

检样可以在供于RT-LAMP法之前，实施RNA提取(例如利用苯酚/氯仿等有机溶剂进行的提取、以及利用市售的试剂盒进行的提取)的工序，但也可以省略RNA提取。通过省略RNA提取而直接将检样供于RT-LAMP法，能够更迅速地检测SARS-CoV-2。根据本发明的方法，确认了即使在将检样直接供于RT-LAMP法的情况下，也能够高灵敏度地检测SARS-CoV-2。在省略RNA提取的情况下和/或以病毒灭活为目的的情况下，可以对检样进行加热处理。例如，可以1)将检样放入带盖的试管中，接着，2)将试管中的检样在高温(例如95℃)下加热处理规定的时间(例如1～30分钟)，然后，3)将通过冰冷等冷却了的检样供于RT-LAMP法。

逆转录(RT)反应和LAMP反应可以并行也可以分开进行。RT反应中，需要逆转录酶和逆转录反应用引物。但是，LAMP反应中使用的LAM P用引物也可以兼用作逆转录反应用引物。因此，在RT反应中，LAMP用引物可以用作逆转录反应用引物。作为逆转录酶，已知有许多逆转录酶。在本发明中，可以适当使用任意的逆转录酶。例如，作为逆转录酶，可以使用禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus：AMV)来源的逆转录酶(AMV-RT)。

LAMP反应可以在能够扩增SARS-CoV-2靶核酸的任意条件下进行。LAMP反应可以在等温条件下扩增靶核酸。因此，在本发明中，例如可以在50～80℃(优选60～70℃)的等温条件下进行LAMP反应。LAMP反应时间可以设定为足以检测扩增产物的时间(例如约7～10分钟)。LAMP反应中，作为DNA聚合酶，优选使用链置换型DNA聚合酶。本发明中，可以适当使用任意的链置换型DNA聚合酶，但优选使用耐热性链置换型DNA聚合酶。

扩增产物的检测例如可以以荧光为指标进行。在该情况下，扩增产物的检测例如可以通过使用包含钙黄绿素的荧光试剂或嵌入剂等根据扩增产物或扩增反应的存在而产生荧光的试剂，通过检测所产生的荧光来进行。扩增产物的检测例如在随时间经过或开始扩增反应后的特定的时间点进行。另外，核酸的扩增及扩增产物的检测也可以使用装置进行。另外，核酸的扩增及扩增产物的检测也可以通过一个装置简便地进行。例如，通过使用Genelyzer(注册商标)FIII(佳能医疗系统株式会社)，能够简便且迅速地检测扩增产物。

检样中是否包含SARS-CoV-2的判定例如可以以在特定的时间点扩增产物是否达到预先设定的阈值以上为基准来进行。例如，在测定到预先设定的值以上的强度的荧光时，判定在检样中包含SARS-CoV-2。另外，在测定到预先设定的值以上的强度的荧光为止所需的时间比预先设定的时间短的情况下，也可以判定在检样中包含SARS-CoV-2。或者，在利用市售的试剂盒进行RT-LAMP法的情况下，也优选根据附在该试剂盒中的使用说明书的推荐条件判定在检样中包含SARS-CoV-2。

在特定的实施方式中，本发明的方法还可以进一步包含对判定为SAR S-CoV-2阳性的受检对象给予能够对新型冠状病毒感染病(COVID-19)起效的药物。作为这样的药物，例如可举出瑞德西韦(Remdesivir)、法匹拉韦(Favipiravir)、环索奈德(Ciclesonide)、洛匹那韦(Lopinavir)、磷酸氯喹、羟基氯喹、萘莫司他(Nafamostat)、卡莫司他(Camostat)、伊维菌素(Ivermectin)、抗白介素-6受体抗体(例如Sarilumab、托珠单抗(TocilizuMab))、针对SARS-CoV-2的中和抗体、免疫球蛋白制剂(例如，以高浓度含有从恢复的患者的血浆中采集的病原体特异性抗体的制剂)。

本发明还提供一种SARS-CoV-2的检查试剂盒，其包含：(A)包含上述那样的包含多个LAMP用引物的引物组的SARS-CoV-2的检查试剂、以及(B)(1)包含上述那样的多个LAMP用引物的引物组、(2)链置换型DNA聚合酶(例如耐热性链置换型DNA聚合酶)、及(3)逆转录酶。本发明的检查试剂和检查试剂盒还可以含有无机焦磷酸酶(例如耐热性无机焦磷酸酶)、荧光试剂、dNTPs等基质、缓冲液。本发明的检查试剂和检查试剂盒可以以隔离在各个容器(例如试管)的形态包含各成分，也可以在同一容器中将2种以上的成分预先混合。

实施例

以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1：利用以SARS-CoV-2基因组中的6个区域为靶的RT-RAMP法进行SARS-CoV-2的检测

作为LAMP用引物，设计了以SARS-CoV-2基因组中的ORF区域即Orf1b、OrfM、OrfN、及OrfS为靶的6个引物组。引物组的设计时，参照SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1的基因组序列(GenBank登记号：MN908947)。所设计的引物组的详细情况如表1～6所示。这些引物组被设计为对由图1～5所示的碱基序列表示的各种ORF区域中的部分区域(参照图1～5中的下划线部分)进行扩增。

[表1]

表1.针对SARS-CoV-2基因组中的Orf1b的引物组(其1)

[表2]

表2.针对SARS-CoV-2基因组中的Orf1b的引物组(其2)

[表3]

表3.针对SARS-CoV-2基因组中的OrfM的引物组

[表4]

表4.针对SARS-CoV-2基因组中的OrfN的引物组

[表5]

表5.针对SARS-CoV-2基因组中的OrfS的引物组(其1)

[表6]

表6.针对SARS-CoV-2基因组中的OrfS的引物组(其2)

作为检样，使用人工合成RNA。人工合成RNA的碱基序列对应于序列号3、5、7、9、11和12(其中，胸腺嘧啶被转换为尿嘧啶)。对于人工合成RNA，合成具有对应的碱基序列的DNA，接着以合成DNA为基础制备RNA。

RT-LAMP法的详细情况如下所述。

首先，制备包含上述引物组的引物混合液(2.5μL)。将引物混合液的组成示于表7。

[表7]

表7.引物混合液的组成

接着，制备包含引物混合液(2.5μL)的反应主混合液(Master Mix)(20μL)。将反应主混合液的组成示于表8。

[表8]

表8.反应主混合液的组成(μL)

对于各扩增反应液，使用等温基因扩增检测装置Genelyzer(注册商标)FIII(佳能医疗系统株式会社制)进行扩增反应及检测。

温度控制如下进行。

1)预热(Preheat)：40℃

2)扩增(Amplification)：68℃(序列号5)、67℃(序列号3)、65℃(序列号7、9、11、12)

3)融化(Melt)：95～75℃、0.1℃/秒

在每个反应体系中、在500个、50个、5个或无(水：阴性对照)的条件下使用模板核酸。将结果示于表9。

[表9]

表9.使用各引物的RT-LAMP法的比较

其结果，在以SARS-CoV-2基因组中的上述6个ORF区域为靶的情况下，均检测到了SARS-CoV-2，其中在以Orf1b为靶的情况下良好地检测到了SARS-CoV-2。特别是在以Orf1b(序列号5)为靶的情况下，高灵敏度地检测到了SARS-CoV-2。因此确认了，在RT-LAMP法中，作为靶的ORF区域优选Orf1b，特别优选为Orf1b(序列号5)。

实施例2：利用RT-LAMP法进行的SARS-CoV-2检测灵敏度的研究(1)

使用具有SARS-CoV-2基因组序列的一部分(256个碱基长)的合成RNA(单链)作为模板核酸。在每个反应体系中，在500个、50个、5个或无(水：阴性对照)的条件下使用该模板核酸。

RT-LAMP法与实施例1同样地进行。作为RT-LAMP法中的引物组，使用了针对SARS-CoV-2基因组中的Orf1b(序列号5)的引物组(参照实施例1)。将结果示于表10。

[表10]

表10.RT-LAMP法的灵敏度和检测时间

其结果，在反应体系中存在50个拷贝以上的目标RNA的情况下，以100％的概率检测到了目标RNA。另外，未发现非特异反应。

实施例3：利用RT-LAMP法进行的SARS-CoV-2检测灵敏度的研究(2)

将具有SARS-CoV-2基因组全部序列的病毒RNA(单链)用作模板核酸。对该病毒核酸进行阶段稀释，研究了能够检测病毒RNA至何种程度的稀释倍率。

另外，将RT-LAMP法的灵敏度与RT-定量PCR(qPCR)法的灵敏度进行比较。在RT-qPCR法中，使用1)日本的国立感染病研究所(NIID)用于SARS-CoV-2检查的针对ORF区域(N基因)的一对引物、以及世界卫生组织(WHO)用于SARS-CoV-2检查的针对ORF区域(E基因)的一对引物。

[表11]

表11.NIID用的一对引物

[表12]

表12.WHO用的一对引物

RT-LAMP法与实施例1同样地进行。作为RT-LAMP法中的引物组，使用了针对SARS-CoV-2基因组中的Orf1b(序列号5)的引物组(参照实施例1)。RT-qPCR法按照NIID推荐的方案(Development of Genetic Diagnostic Methods for Novel Coronavirus 2019(nCoV-2019)in Japan；Advance Publication by J-STAGE；Japanese Journal of InfectiousDiseases；Published online：February 18,202)和WHO推荐的方案(Diagnosticdetection of Wuhan coronavirus 2019by real-time RT-PCR；-Protocol andpreliminary evaluation as of Jan 13,2020-)进行。将结果示于表13。

[表13]

表13.RT-qPCR与RT-LAMP法的灵敏度比较

其结果，RT-LAMP法与RT-qPCR法(NIID和WHO)同样地，以100％的概率检测到了10^-4稀释的病毒RNA(约20个拷贝)。另外，RT-LAMP法在约10分钟的短时间内检测到了10^-4稀释的病毒RNA。另一方面，关于按照NIID和WHO进行的RT-qPCR法的检测时间，达到约31和约29的Ct值分别需要23分钟和22分钟。因此，对于SARS-CoV-2的检测，确认了本发明与现有方法相比，能够在短时间内实现与现有方法同等的检测灵敏度。

实施例4：与SARS-CoV的交叉反应性的研究

对于SARS-CoV-2和作为近缘病毒的SRAS-CoV，通过使用了以Orf1b(序列号5)为靶的引物组的RT-LAMP法评价是否显示交叉反应性。使用具有SRAS-CoV和SARS-CoV-2基因组全部序列的病毒RNA(单链)作为模板核酸。RT-LAMP法与实施例1同样地进行。用于检测SARS-CoV的RT-qPCR是按照WHO推荐的上述方案进行的。将结果示于表14。

[表14]

表14.RT-LAMP法对SARS-CoV的交叉反应性

其结果，RT-LAMP法中，没有发现与SARS-CoV的交叉反应性。

实施例5：直接RT-LAMP法的研究

迄今为止的检查方法大多需要从检样中提取RNA。但是，RNA提取需要昂贵的RNA提取试剂盒、设备，另外，需要一定水平的熟练技术人员。另外，RNA提取需要30分钟～1小时左右的时间。因此，研究了对于患者检样，能否在不提取RNA的情况下直接用于扩增反应。

方法如下进行。首先，在混合有健康人的鼻腔拭子及咽头拭子的检样中，将SARS-CoV-2进行阶段稀释，为了病毒灭活，在95℃下进行10分钟的热处理。接着，研究了使用针对Orf1b的部分区域(序列号5)的引物组，能够检测病毒RNA至何种程度的稀释倍率。以热处理检样为模板直接用于扩增反应的方法是直接RT-LAMP。另外，与实施例1同样地实施通常的RT-LAMP，进行了灵敏度比较。此外，与RT-qPCR法的灵敏度(NIID)进行了比较。此时，将热处理检样作为模板直接用于RT-qPCR的扩增反应的方法是直接RT-qPCR。将结果示于表15和16。表15和16中使用的鼻腔拭子和咽头拭子使用同一人不同日采集的拭子。

[表15]

表15.直接RT-LAMP法的检测灵敏度(1)

[表16]

表16.直接RT-LAMP法的检测灵敏度(2)

其结果，直接RT-LAMP法与RT-LAMP法同样地以100％的概率检测到了2×10^-6稀释病毒(约90个拷贝)。另外，直接RT-LAMP法在约10分钟的短时间内检测到了2×10^-6稀释病毒。另一方面可知，在使用了热处理检样的RT-qPCR中，根据检样的状态，与将RNA作为模板使用的RT-qPCR相比，灵敏度下降了约10倍。由此确认了，通过直接RT-LAMP法，不需要从SARS-CoV-2RNA的检样中进行提取即能够良好且迅速地检测SARS-CoV-2RNA。

序列表

<110> 长崎大学

佳能医疗系统株式会社

<120> SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒

<130> PCYA-21017

<150> PCT/JP2020/023401

<151> 2020-06-15

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8088

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

cgggtttgcg gtgtaagtgc agcccgtctt acaccgtgcg gcacaggcac tagtactgat 60

gtcgtataca gggcttttga catctacaat gataaagtag ctggttttgc taaattccta 120

aaaactaatt gttgtcgctt ccaagaaaag gacgaagatg acaatttaat tgattcttac 180

tttgtagtta agagacacac tttctctaac taccaacatg aagaaacaat ttataattta 240

cttaaggatt gtccagctgt tgctaaacat gacttcttta agtttagaat agacggtgac 300

atggtaccac atatatcacg tcaacgtctt actaaataca caatggcaga cctcgtctat 360

gctttaaggc attttgatga aggtaattgt gacacattaa aagaaatact tgtcacatac 420

aattgttgtg atgatgatta tttcaataaa aaggactggt atgattttgt agaaaaccca 480

gatatattac gcgtatacgc caacttaggt gaacgtgtac gccaagcttt gttaaaaaca 540

gtacaattct gtgatgccat gcgaaatgct ggtattgttg gtgtactgac attagataat 600

caagatctca atggtaactg gtatgatttc ggtgatttca tacaaaccac gccaggtagt 660

ggagttcctg ttgtagattc ttattattca ttgttaatgc ctatattaac cttgaccagg 720

gctttaactg cagagtcaca tgttgacact gacttaacaa agccttacat taagtgggat 780

ttgttaaaat atgacttcac ggaagagagg ttaaaactct ttgaccgtta ttttaaatat 840

tgggatcaga cataccaccc aaattgtgtt aactgtttgg atgacagatg cattctgcat 900

tgtgcaaact ttaatgtttt attctctaca gtgttcccac ctacaagttt tggaccacta 960

gtgagaaaaa tatttgttga tggtgttcca tttgtagttt caactggata ccacttcaga 1020

gagctaggtg ttgtacataa tcaggatgta aacttacata gctctagact tagttttaag 1080

gaattacttg tgtatgctgc tgaccctgct atgcacgctg cttctggtaa tctattacta 1140

gataaacgca ctacgtgctt ttcagtagct gcacttacta acaatgttgc ttttcaaact 1200

gtcaaacccg gtaattttaa caaagacttc tatgactttg ctgtgtctaa gggtttcttt 1260

aaggaaggaa gttctgttga attaaaacac ttcttctttg ctcaggatgg taatgctgct 1320

atcagcgatt atgactacta tcgttataat ctaccaacaa tgtgtgatat cagacaacta 1380

ctatttgtag ttgaagttgt tgataagtac tttgattgtt acgatggtgg ctgtattaat 1440

gctaaccaag tcatcgtcaa caacctagac aaatcagctg gttttccatt taataaatgg 1500

ggtaaggcta gactttatta tgattcaatg agttatgagg atcaagatgc acttttcgca 1560

tatacaaaac gtaatgtcat ccctactata actcaaatga atcttaagta tgccattagt 1620

gcaaagaata gagctcgcac cgtagctggt gtctctatct gtagtactat gaccaataga 1680

cagtttcatc aaaaattatt gaaatcaata gccgccacta gaggagctac tgtagtaatt 1740

ggaacaagca aattctatgg tggttggcac aacatgttaa aaactgttta tagtgatgta 1800

gaaaaccctc accttatggg ttgggattat cctaaatgtg atagagccat gcctaacatg 1860

cttagaatta tggcctcact tgttcttgct cgcaaacata caacgtgttg tagcttgtca 1920

caccgtttct atagattagc taatgagtgt gctcaagtat tgagtgaaat ggtcatgtgt 1980

ggcggttcac tatatgttaa accaggtgga acctcatcag gagatgccac aactgcttat 2040

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<211> 4080

<212> DNA

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<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

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gaagccgtaa aaacacagtt caattattat aagaaagttg atggtgttgt ccaacaatta 2640

cctgaaactt actttactca gagtagaaat ttacaagaat ttaaacccag gagtcaaatg 2700

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tatgccttcg aacatatcgt ttatggagat tttagtcata gtcagttagg tggtttacat 2820

ctactgattg gactagctaa acgttttaag gaatcacctt ttgaattaga agattttatt 2880

cctatggaca gtacagttaa aaactatttc ataacagatg cgcaaacagg ttcatctaag 2940

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gtcgcaaaat atactcaact gtgtcaatat ttaaacacat taacattagc tgtaccctat 3300

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gcatttttaa ttggatgtaa ttatcttggc aaaccacgcg aacaaataga tggttatgtc 3780

atgcatgcaa attacatatt ttggaggaat acaaatccaa ttcagttgtc ttcctattct 3840

ttatttgaca tgagtaaatt tccccttaaa ttaaggggta ctgctgttat gtctttaaaa 3900

gaaggtcaaa tcaatgatat gattttatct cttcttagta aaggtagact tataattaga 3960

gaaaacaaca gagttgttat ttctagtgat gttcttgtta acaactaa 4008

<210> 5

<211> 256

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 5

ggttttttca cttacatttg tgggtttata caacaaaagc tagctcttgg aggttccgtg 60

gctataaaga taacagaaca ttcttggaat gctgatcttt ataagctcat gggacacttc 120

gcatggtgga cagcctttgt tactaatgtg aatgcgtcat catctgaagc atttttaatt 180

ggatgtaatt atcttggcaa accacgcgaa caaatagatg gttatgtcat gcatgcaaat 240

tacatatttt ggagga 256

<210> 6

<211> 669

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 6

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg 60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc 120

aacaggaata ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta 180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt 240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 300

agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc 360

aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa 540

ttgggagctt cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg 600

attggcaact ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt 660

gtacagtaa 669

<210> 7

<211> 215

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 7

ttctttcaga ctgtttgcgc gtacgcgttc catgtggtca ttcaatccag aaactaacat 60

tcttctcaac gtgccactcc atggcactat tctgaccaga ccgcttctag aaagtgaact 120

cgtaatcgga gctgtgatcc ttcgtggaca tcttcgtatt gctggacacc atctaggacg 180

ctgtgacatc aaggacctgc ctaaagaaat cactg 215

<210> 8

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 8

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 9

<211> 231

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 9

gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc 60

atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc 120

tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt 180

gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa caacaaggcc a 231

<210> 10

<211> 3822

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 10

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 11

<211> 229

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 11

ttggcagaga cattgctgac actactgatg ctgtccgtga tccacagaca cttgagattc 60

ttgacattac accatgttct tttggtggtg tcagtgttat aacaccagga acaaatactt 120

ctaaccaggt tgctgttctt tatcaggatg ttaactgcac agaagtccct gttgctattc 180

atgcagatca acttactcct acttggcgtg tttattctac aggttctaa 229

<210> 12

<211> 266

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 12

tattgctgct agagacctca tttgtgcaca aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc 60

tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac 120

ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc 180

ttataggttt aatggtattg gagttacaca gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat 240

tgccaaccaa tttaatagtg ctattg 266

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的F3引物

<400> 13

ggttttttca cttacatttg tgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的B3引物

<400> 14

tcctccaaaa tatgtaattt gca 23

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 15

gcgaagtgtc ccatgagctt ataaactagc tcttggaggt tccg 44

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 16

aatgcgtcat catctgaagc attttcataa ccatctattt gttcgcg 47

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的LF引物

<400> 17

tcagcattcc aagaatgttc tgt 23

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号5)的部分区域为靶的LB引物

<400> 18

attggatgta attatcttgg caaacc 26

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的F3引物

<400> 19

aacctgagtt ttatgaggct 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的B3引物

<400> 20

tcctaagtaa agttgagtca ca 22

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 21

tgcaagcacc acatcttaat gaagtcgcat acagtcttac aggct 45

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 22

acgaccatgt catatcaaca tcacaacatc acaacctgga gcat 44

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的LF引物

<400> 23

caaagaacac aagccccaac 20

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号3)的部分区域为靶的LB引物

<400> 24

gtcttgtctg ttaatccgta tgtttg 26

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的F3引物

<400> 25

ttctttcaga ctgtttgcg 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的B3引物

<400> 26

cagtgatttc tttaggcagg t 21

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 27

ggtcagaata gtgccatgga gtgtacgcgt tccatgtggt c 41

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 28

accgcttcta gaaagtgaac tcgtcagcgt cctagatggt gtc 43

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的LF引物

<400> 29

gcacgttgag aagaatgtta gtttc 25

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号7)的部分区域为靶的LB引物

<400> 30

cggagctgtg atccttcgt 19

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的F3引物

<400> 31

gccaaaaggc ttctacgc 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的B3引物

<400> 32

tggccttgtt gttgttgg 18

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 33

cctactgctg cctggagttg aatcagtcaa gcctcttctc gttc 44

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 34

gctagaatgg ctggcaatgg cgacattttg ctctcaagct ggt 43

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的LF引物

<400> 35

cttgaactgt tgcgactacg tgatg 25

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号9)的部分区域为靶的LB引物

<400> 36

gctttgctgc tgcttgacag at 22

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的F3引物

<400> 37

ttggcagaga cattgctg 18

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的B3引物

<400> 38

ttagaacctg tagaataaac acg 23

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 39

gacaccacca aaagaacatg gtgctactga tgctgtccgt ga 42

<210> 40

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 40

ccaggttgct gttctttatc aggataggag taagttgatc tgcatga 47

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的LF引物

<400> 41

tcaagaatct caagtgtctg tgga 24

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号11)的部分区域为靶的LB引物

<400> 42

gcacagaagt ccctgttgct 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的F3引物

<400> 43

tattgctgct agagacctca 20

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的B3引物

<400> 44

caatagcact attaaattgg ttgg 24

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的FIP引物

<400> 45

gtacccgcta acagtgcaga agggccttac tgttttgcca c 41

<210> 46

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的BIP引物

<400> 46

caggtgctgc attacaaata ccatttagag aacattctgt gtaactcca 49

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的LF引物

<400> 47

tgagcaatca tttcatctgt gagc 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以 SARS-CoV-2基因组中的Orf1b (序列号12)的部分区域为靶的LB引物

<400> 48

tgctatgcaa atggcttata ggtt 24

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以SARS-CoV-2基因组中的E基因为靶的正向引物，其被用于WHO的推荐方案中

<400> 49

aaattttggg gaccaggaac 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以SARS-CoV-2基因组中的E基因为靶的反向引物，其被用于NIID的推荐方案中

<400> 50

tggcacctgt gtaggtcaac 20

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 51

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 52

atattgcagc agtacgcaca ca 22

Claims

1.一种SARS-CoV-2检测用引物组，其包含以SARS-CoV-2基因组中的1个以上的开放阅读框(ORF)区域为靶的多个LAMP用引物，其中，

1个以上的ORF区域选自Orf1b、OrfM、OrfN和OrfS。

2.根据权利要求1所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域选自下述(1)～(6)：

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物。

4.根据权利要求3所述的引物组，其中，多个LAMP用引物选自下述(1)～(6)：

5.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物和LB引物。

6.根据权利要求5所述的引物组，其中，多个LAMP用引物选自下述(1)～(6)：

7.根据权利要求1所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域包含ORF1b。

8.根据权利要求2所述的引物组，其中，1个以上的ORF区域包含(1)与相对于序列号5的碱基序列显示90％以上同源性的碱基序列对应的ORF1b中的部分区域。

9.根据权利要求4所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含(1)分别包含序列号13～16的碱基序列、或它们的互补碱基序列的4个引物。

10.根据权利要求6所述的引物组，其中，多个LAMP用引物包含(1)分别包含序列号13～18的碱基序列、或它们的互补碱基序列的6个引物。

11.一种用于检查SARS-CoV-2的方法，其包含在RT-LAMP法中使用权利要求1～10中任一项所述的引物组，在从受检对象得到的检样中检测SARS-CoV-2。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述检样是鼻腔拭子、咽头拭子、唾液、或痰。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，在检样加热处理后检测SARS-CoV-2。

14.一种SARS-CoV-2的检查试剂，其包含权利要求1～10中任一项所述的引物组。

15.一种SARS-CoV-2的检查试剂盒，其包含下述(1)～(3)：

(1)权利要求1～10中任一项所述的引物组；

(2)链置换型DNA聚合酶；以及

(3)逆转录酶。