CN107365843B - 用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫的lamp引物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫的LAMP引物组合及其应用。用于检测导致犊牛腹泻的牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的LAMP引物组合为引物组Ⅰ和/或引物组Ⅱ；所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ‑F3、引物Ⅰ‑B3、引物Ⅰ‑FIP、引物Ⅰ‑BIP、引物Ⅰ‑LF和引物Ⅰ‑LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ‑F3、引物Ⅱ‑B3、引物Ⅱ‑FIP、引物Ⅱ‑BIP、引物Ⅱ‑LF和引物Ⅱ‑LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示。本发明提供的引物组合用于检测常见的导致犊牛腹泻的两种寄生虫，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

Description

用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫的LAMP引物组合及 其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫的LAMP引物组合及其应用。
背景技术
随着我国人民生活水平的提高，牛肉及牛奶的消费需求日益见长，促进了养牛业的发展，然而具有传染性的寄生虫病的爆发也呈上升趋势，且严重影响了牛的生长发育，给养殖户带来巨大的经济损失。造成严重后果的寄生虫主要为球虫和隐孢子虫。
牛球虫病可以感染各种品种的牛，尤其是2岁一下的犊牛发病率和死亡率最高，腹泻是该病的主要临床特征，且发病的牛感染的球虫数量越多，引起的症状就越严重。病原为艾美尔科、艾美尔属球虫。其中牛艾美尔球虫为我国最为常见的牛球种类，且致病性最强。隐孢子虫是一种重要的人兽共患原虫。其中微小隐孢子虫主要感染断奶前犊牛，且感染率高，几乎是感染断奶前犊牛的唯一虫种。寄生于小肠，引起犊牛水样腹泻、脱水甚至死亡。
目前关于对造成犊牛腹泻的寄生虫检测方法主要有以下几种：传统的球虫检测方法主要包括粪便样品的显微镜检查、饱和食盐水漂浮法和麦克马斯特法，后两种方法是最常用的球虫检测法。传统的隐孢子虫检测方法主要包括粪便样品的显微镜检查、水样的EPA1623检查。但传统的检测方法仍然存在耗时较长等缺陷。随着免疫学和现代分子生物学的不断发展，很多先进的检测技术如酶联免疫检测技术、免疫荧光技术、PCR、实时荧光定量PCR和环介导的等温扩增技术(LAMP)等不断涌现和应用于临床实践。
传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；Sanger DNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在反应时间还是仪器要求方面，都比PCR技术更有优势。在这些众多等温扩增技术中，又以环介导的等温扩增技术(LAMP)的应用最为成熟、最为广泛，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫(牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫)的LAMP引物组合及其应用。
本发明首先提供了用于检测导致犊牛腹泻的牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的LAMP引物组合，所述引物组合为引物组Ⅰ和/或引物组Ⅱ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示。
所述引物是针对18s rRNA基因设计，首先本发明根据收集得到的临床菌株样品进行了基因序列分析，并收集NCBI等公共数据库中发表的基因序列，经过序列整理得到有保守性的基因序列区段。再通过特异性分析去除有和其它微生物基因序列有高端同源的区段，得到牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的代表性基因序列区段。因为LAMP引物设计没有比较好的软件，因此本发明针对上述分析得到 的代表性基因序列区段，通过人工设计多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，得到灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫具有极高的特异性和灵敏度。
在上述基础上，含有本发明所述引物组合的试剂和试剂盒也属于本发明的保护范围。相应的，使用本发明所述引物组合、所述试剂和所述试剂盒进行的应用，也属于本发明的保护范围。
进一步地，当应用本发明所述引物组合制备试剂盒时，所述引物之间具有优选的摩尔用量比：所述引物组Ⅰ中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1；所述引物组Ⅱ中，所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1。
例如，所述引物组Ⅰ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅰ-F3、0.5μmol所述引物Ⅰ-B3、2.0μmol所述引物Ⅰ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅰ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅰ-LF和1.0μmol所述引物Ⅰ-LB。
所述引物组Ⅱ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅱ-F3、0.5μmol所述引物Ⅱ-B3、2.0μmol所述引物Ⅱ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅱ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅱ-LF和1.0μmol所述引物Ⅱ-LB。
在制备试剂盒时，内含的各条引物需单独包装。
所述试剂盒的工作程序为环介导等温扩增，反应条件为65℃恒温50min。
所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)制备用于检测导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的试剂盒；
(e2)鉴定导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫；
(e3)检测待测样本中是否含有导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫。
进一步地，本发明还提供了一种检测待测寄生虫是否为牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测寄生虫的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫为或候选为牛艾美尔球虫；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫为或候选为微小隐孢子虫。
进一步地，本发明还提供了一种检测待测样本中是否含有寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛艾美尔球虫；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有微小隐孢子虫。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)制备用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫，牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫的试剂盒；
(e2)鉴定导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫，牛艾美尔球虫和/ 或微小隐孢子虫；
(e3)检测待测样本中是否含有导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫，牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫。
所述试剂盒还可包括反应液，所述反应液具体可为博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。
所述待测样本可为牛(bovine)的粪便。
上文中，所述实现环介导等温扩增具体可体现为：在利用荧光定量PCR进行检测时可出现环介导等温扩增曲线。所述环介导等温扩增曲线可为为典型的“S型”扩增曲线。
本发明还保护所述引物组合在检测待测寄生虫是否含有寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有寄生虫牛艾美尔球虫和/或微小隐孢子虫中的应用。
上文中，寄生虫牛艾美尔球虫ITS-2基因的Genebank号为(AB769731.1)。寄生虫微小隐孢子虫SSU RNA基因的Genebank号为(AF093490.1)。寄生虫牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫均属导致犊牛腹泻的两种寄生虫，这两种寄生虫均导致不同品种的犊牛发生腹 泻。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的碳青霉烯类耐药基因。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明提供的引物组合鉴定用于检测常见的导致犊牛腹泻的两种寄生虫，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
附图说明
图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的检测结果。
图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的检测结果。
图3为实施例4中样本一的检测结果。
图4为实施例4中样本二的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
反应液为博奥生物集团有限公司产品，产品目录号为CP.440020。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式:
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。
实施例1、引物组Ⅰ和引物组Ⅱ的制备
试剂盒由两个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种导致犊牛腹泻的寄生虫。
用于检测寄生虫牛艾美尔球虫ITS-2基因的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列1)：TTCTACATGTTTGATGCCTTC；
外引物B3(序列2)：CCAAACCAAACAATGCTCAA；
内引物FIP(序列3)：GGAAAAGAAAGGATATGGGCTTGTACGCGGTGTGTCAGAAGT；
内引物BIP(序列4)：GGTGGATGGATTCTAAGTATTCTCCACAACACCACCACAGCT；
环引物LF(序列5)：AGCCATTCATACAACAACAGCAAT；
环引物LB(序列6)：ATCTCATATTTTAGGAGTTTGGCGA。
用于检测寄生虫微小隐孢子虫SSU RNA基因的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列7)：CGAAAGCATTTGCCAAGG；
外引物B3(序列8)：AGGCTCCACTCCTGGTG；
内引物FIP(序列9)：CAACCTCCAATCTCTAGTTGGCGAACGAAAGTTAGGGGATCG；
内引物BIP(序列10)：ATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGCCCTTCCGTCAATTCCT；
环引物LF(序列11)：GACTACGACGGTATCTGATCGTCT；
环引物LB(序列12)：GAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACT。
用于检测寄生虫牛艾美尔球虫ITS-2基因的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测寄生虫微小隐孢子虫SSU RNA基因的引物组命名为引物组Ⅱ。
检测导致犊牛腹泻的寄生虫的引物组合由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成，该引物组合中，各单链DNA各自独立包装。
引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
实施例2、引物组合的特异性
一、待测样本的制备
待测样本1：牛艾美尔球虫ITS-2基因质粒。
待测样本2：微小隐孢子虫SSU RNA基因质粒。
各质粒的制备方法如下：
牛艾美尔球虫ITS-2基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为AB769731.1的核苷 酸序列所示的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为牛艾美尔球虫ITS-2基因质粒。
微小隐孢子虫SSU RNA基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为AF093490.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为耐药基因SSU RNA基因质粒。
二、待测样本的检测
各个待测样本分别进行如下步骤进行检测：
以步骤一的质粒DNA为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ和引物组Ⅱ对步骤一制备的两个质粒—牛艾美尔球虫ITS-2基因质粒和微小隐孢子虫SSU RNA基因质粒进行环介导等温扩增检测，每个引物组合均检测两种质粒。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ和引物组Ⅱ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测样本为牛隐孢子虫ITS-2基因质粒的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图1中牛艾美尔球虫ITS-2所指曲线)。当待测样本为待测样本2的时候均不显示阳性扩增曲线。图1中为待测样本1的结果；图1中非“S型”扩增曲线中有一条为待测样本2的结果，其余均为未添加模板的结果。
采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测样本为微小隐孢子虫SSU RNA基因质粒的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图2中微小隐孢子虫ITS-2所指曲线)。当待测样本为待测样本1的时候均不显示阳性扩增曲线。图2中为待测样本2的结果；图2中非“S型”扩增曲线中有有一条为待测样本1的结果，其余均为未添加模板的结果。
以上结果表明，本发明提供的导致犊牛腹泻的寄生虫的引物组合中的两个引物组分别对其靶标基因有很高的特异性。
实施例3、引物组合的灵敏性
待测样本1：实施例2的牛艾美尔球虫ITS-2基因质粒。
待测样本2：实施例2的微小隐孢子虫SSU RNA基因质粒。
1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ和引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。
待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、102或101)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ或引物组Ⅲ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如 果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
引物组Ⅰ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅱ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。
实施例4、检测临床样本
待测样本为如下样本一或样本二：
样本一：已通过显微镜检查法鉴定及PCR测序鉴定确认含有牛艾美尔球虫的牛的粪便；
样本二：已通过显微镜检查法鉴定及PCR测序鉴定确认含有微小隐孢子虫的牛的粪便。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组对这两个样本进行环介导等温扩增，每个引物组合均检测两种样本。
反应体系与反应条件均同实施例2。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
样本一的结果见图4。只有采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的另一个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图4为引物组Ⅰ的结果；图4中非“S型”扩增曲线中有一条为引物组Ⅱ的结果，其余均为未添加模板的结果。
样本二的结果：只有采用引物组Ⅱ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的另一个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。
以上结果表明，利用本发明提供的导致犊牛腹泻的寄生虫的引 物组合可以进行两种常见的导致犊牛腹泻的寄生虫的检测，结果准确可靠。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京莱博泰克生物技术有限公司 河南省奶牛生产性能测定中心
<120> 用于检测导致犊牛腹泻的两种主要寄生虫的LAMP引物组合及其应用
<130> KHP171113872.1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctacatgt ttgatgcctt c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaaccaaa caatgctcaa 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaaaagaaa ggatatgggc ttgtacgcgg tgtgtcagaa gt 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtggatgga ttctaagtat tctccacaac accaccacag ct 42
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agccattcat acaacaacag caat 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atctcatatt ttaggagttt ggcga 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgaaagcatt tgccaagg 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggctccact cctggtg 17
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caacctccaa tctctagttg gcgaacgaaa gttaggggat cg 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atcaaagtct ttgggttctg gggggccctt ccgtcaattc ct 42
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gactacgacg gtatctgatc gtct 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gagtatggtc gcaaggctga aact 24

Claims (9)

1.用于检测导致犊牛腹泻的牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合为引物组Ⅰ和引物组Ⅱ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1~6所示；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.7~12所示。
2.含有权利要求1所述引物组合的试剂。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组Ⅰ中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；
所述引物组Ⅱ中，所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，各条引物单独包装。
6.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为环介导等温扩增，反应条件为65℃恒温50min。
7.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒的用途为如下（e1）或（e2）或（e3）：
（e1）制备用于检测导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫的试剂盒；
（e2）鉴定导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫；
（e3）检测待测样本中是否含有导致犊牛腹泻的寄生虫牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫。
8.一种非诊断目的的检测待测寄生虫是否为牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测寄生虫的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫为或候选为牛艾美尔球虫；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测寄生虫为或候选为微小隐孢子虫。
9.一种非诊断目的的检测待测样本中是否含有寄生虫牛艾美尔球虫和微小隐孢子虫的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样本的总DNA；
（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛艾美尔球虫；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有微小隐孢子虫。
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