CN114790490A - 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法，其中可识别所有种布鲁氏菌的特异性核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：1；用于检测牛种布鲁氏菌的特异性分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；用于检测羊种布鲁氏菌的特异性分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。本发明还通过用于检测上述特异性核算片段的引物对和探针。本发明制备的BSCP引物和探针具有通用性，可检测所有种的布鲁氏菌，引物探针不但可以独立使用，也可以制备成三重实时荧光定量PCR方法，用于布鲁氏菌种的鉴定。检测的样品可以是分离的菌株，也可以是临床收集的流产物、奶、拭子、组织等样品，而且具有高敏感性、高特异性等特点。
Description
技术领域
本发明属于病原体分子检测技术领域，具体涉及一种可区分牛种和羊种 布鲁氏菌的分子标记，以及检测该分子标记的实时荧光定量PCR引物、探针 及检测方法。
背景技术
布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的重 要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病， 《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病。该病不仅危害牛、 羊、猪等各种动物，造成严重经济损失，还会通过发病动物或畜产品将疾病 传染给人，造成人的发热、睾丸炎、流产和关节炎等病症，严重者甚至丧失 劳动和生育能力，对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁。
在世界范围内，布鲁氏菌共有11个种(含23个生物型)，最常见的种 有牛种布鲁氏菌(B.abortus)、羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、猪种布 鲁氏菌(B.suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠布鲁氏菌(B. neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)。我国以牛、羊布病的发病率最高， 地理分布最为广泛，其致病因子分别是牛种和羊种布鲁氏菌。牛种和羊种布 鲁氏菌也是我国人布病的主要致病因子，99％的人布病是由它们引起的。我国 猪和犬布病呈散发态势，其致病因子分别为猪种和犬种布鲁氏菌，这两种布 鲁氏菌偶尔也可感染人，但其对人的危害程度远没有牛种和羊种布鲁氏菌严 重。目前，除了牛、羊、猪、犬这四种布鲁氏菌外，其他种的布鲁氏菌在我 国尚未被发现。由此可见，在我国，消除牛、羊布病是阻止布病从动物向人 传播的关键。
目前，常规的布鲁氏菌病原学检测手段是病原分离鉴定。因为要进行细 菌培养，工作人员有感染的风险，因此病原分离鉴定必须在生物安全三级实 验室内进行，限制了该方法的推广应用。另一方面，细菌培养和鉴定至少需 要两周时间，既费时又费力，不能满足目前疫情处理快速高效的要求。所以， 准确、快速的病原学诊断技术是目前布病防控所急需解决的问题之一。实时 荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是目前最广泛使用的病原学诊 断方法之一，具有很高的敏感性和特异性。与其他的分子检测方法相比(如 数字PCR、恒温或等温PCR等)，实时荧光定量PCR技术更成熟，稳定性更 高，更易于推广。
发明内容
本发明提供了一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法， 即一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记，以及检测该标记的实时荧光 定量PCR引物、探针及检测方法。
本发明首先提供一种可识别所有种布鲁氏菌(包括牛种、羊种、猪种和 犬种)的特异性核苷酸片段，其核苷酸序列如下：
CCGGAGCCTATAAGGACGTGGCGGAAACACCGACCCTTGCCGTTGCCGCACAGTGGGTGACG AGCGCCAAGCAGCCGGACGACCTCATCTATAACATCACCAAGGTTCTCTGGAACGAGGATACACGC AA(SEQ ID NO：1)
本发明还提供用于扩增SEQ ID NO：1所述序列片段的引物对，其一种核 苷酸序列如下：
上游引物：5′-CCGGAGCCTATAAGGACGTG-3′(SEQ ID NO：2)；
下游引物：5′-TTGCGTGTATCCTCGTTCCAG-3′(SEQ ID NO：3)；
本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，其序列如下：
5′-ACCGACCCTTGCCGTTGCCGC-3′(SEQ ID NO：4)；
本发明还提供一种用于检测牛种布鲁氏菌的特异性分子标记，所述的分 子标记，其核苷酸序列如下：
CAGTTCTCGAACAAGCTGACGGGCAGCGGCACGCTTGCTGTGTCGGGTTCTGGCACGCTGATCCTTTCGGCGGCCAATGATTATAG(SEQ ID NO:5)；
本发明还提供用于检测上述牛种布鲁氏菌的特异性分子标记的引物对， 其一种引物对包含有：
上游引物：5′-CAGTTCTCGAACAAGCTGACG-3′(SEQ ID NO：6)；
下游引物：5′-CTATAATCATTGGCCGCCGAAAG-3′(SEQ ID NO：7)；
本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，序列如下：
5′-CAGCGTGCCAGAACCCGACACAGC-3′(SEQ ID NO：8)；
本发明还提供一种羊种布鲁氏菌的特异性分子标记，所述的分子标记， 其核苷酸序列如下：
AGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTA TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTTTCTGACAA TTTCCAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAG(SEQ ID NO:9)；
本发明还提供用于检测上述羊种布鲁氏菌特异性分子标记的引物对，所 述引物对包含有：
上游引物：5′-AGCGAGATTGGAATAGCTTACCC-3′(SEQ ID NO：10)；
下游引物：5′-CTGGTTACGTTGAATGCAGACAC-3′(SEQ ID NO：11)；
本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，序列如下：
5′-CGCCCTGCCACCAGCCAATAACGG-3′(SEQ ID NO：12)；
所述探针采用荧光报告和淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针 序列5′端,淬灭基团修饰在探针序列3′端。
进一步，所述荧光报告基团为FAM、VIC和Cy5；淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
上述的引物和探针可用于制备牛种和羊种布鲁氏菌鉴别诊断试剂盒。
附图说明
图1：牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组模板三重实时荧光定量 PCR扩增曲线图(FAM通道)；
图2：牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组模板三重实时荧光定量 PCR扩增曲线图(VIC通道)；
图3：牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组模板三重实时荧光定量 PCR扩增曲线(Cy5通道)；
图4：牛种布鲁氏菌特异性引物探针的敏感性检测和标准曲线的绘制图；
图5：羊种布鲁氏菌特异性引物探针的敏感性检测和标准曲线的绘制图；
图6：羊种布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图7：牛种布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图8：布鲁氏菌临床分离菌株三重实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图9：牛流产物样品三重实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图10：牛奶和脾脏三重实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图11：羊阴道拭子三重实时荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR检测方法，可快速识 别并区分牛种和羊种布鲁氏菌，同时克服了传统病原学鉴定方法费时、费力、 生物安全风险高的缺点，可为我国畜间布病防控和净化提供重要的技术支持。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述。如无特别说明，本发明所涉及的布鲁氏菌均为我国当前 流行的菌株。
实施例1：布鲁氏菌特异性核酸片段的选择及引物、探针设计
布鲁氏菌31kDa免疫原性蛋白基因Bcsp31是一个布鲁氏菌特异性基因， 存在于所有种类的布鲁氏菌基因组中，且高度保守。该基因位于布鲁氏菌I 号染色体(817,132-818,121)，共990个碱基。利用AlleleID 6软件，获 得了一套针对上述序列的特异性引物和Taqman探针，引物所扩增的序列为：
CCGGAGCCTATAAGGACGTGGCGGAAACACCGACCCTTGCCGTTGCCGCACAGTGGGTGACG AGCGCCAAGCAGCCGGACGACCTCATCTATAACATCACCAAGGTTCTCTGGAACGAGGATACACGC AA(SEQ ID NO：1)
上游引物：5′-CCGGAGCCTATAAGGACGTG-3′(SEQ ID NO：2)；
下游引物：5′-TTGCGTGTATCCTCGTTCCAG-3′(SEQ ID NO：3)；
探针序列：5′-ACCGACCCTTGCCGTTGCCGC-3′(SEQ ID NO：4)；
根据实时荧光定量PCR仪的性能，探针的荧光修饰基团可选择为FAM、 Texared、VIC或Cy5等，本探针优先选择FAM，淬灭基团为BHQ1。
该组引物探针可以检测所有种的布鲁氏菌，以下实施例中也称为通用型 布鲁氏菌引物探针，用BCSP表示。
实施例2：牛种布鲁氏菌属特异性核酸片段的选择和引物、探针设计
由于我国目前仅有牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的报道，根据NCBI 基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)中的牛种、羊种、 犬种和猪种布鲁氏菌基因组序列，通过分析比较，筛选出一个在牛种布鲁氏 菌基因组中高度保守而在其他种的布鲁氏菌基因组中缺失的位点。该位点位 于牛种布鲁氏菌II号染色体(B.abortus 2308菌株为例：157624-157704)， 其核苷酸片段的序列如下：
CAGTTCTCGAACAAGCTGACGGGCAGCGGCACGCTTGCTGTGTCGGGTTCTGGCACGCTGATCCTTTCGGCGGCCAATGATTATAG(SEQ ID NO：5)。检测结果表明该序列在所有牛种 布鲁氏菌基因组均存在，而与其他种布鲁氏菌的基因组序列同源性很低。
利用AlleleID 6软件分析，获得了一对针对上述序列的特异性引物和 Taqman探针：
上游引物：5′-CAGTTCTCGAACAAGCTGACG-3′(SEQ ID NO：6)；
下游引物：5′-CTATAATCATTGGCCGCCGAAAG-3′(SEQ ID NO：7)；
探针序列：5′-CAGCGTGCCAGAACCCGACACAGC-3′(SEQ ID NO：8)；
根据实时荧光PCR仪的性能，探针的荧光修饰基团可选择为FAM、VIC或 Cy5等。为了建立三重实时荧光定量PCR检测试剂盒的需要，本探针优先选 择VIC标记，淬灭基团为BHQ1。
该组引物和探针特异地识别牛种布鲁氏菌，以下实施例中也称为牛种布 鲁氏菌特异性引物探针，用BA表示。
实施例3羊种布鲁氏菌属特异性核酸片段的选择和引物、探针设计
同样，通过NCBI布鲁氏菌基因组数据库中牛种、羊种、犬种和猪种布鲁 氏菌基因组的序列比较分析，筛选出一个在羊种布鲁氏菌基因组中高度保守 而在其他种的布鲁氏菌基因组中缺失的位点。该位点位于羊种布鲁氏菌I号 染色体(B.melitensis 16M菌株为例：1209463-1209635)，其核苷酸片段 的序列如下：
AGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTATCGC TGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTTTCTGACAATTTC CAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAG(SEQ ID NO：9)。将该序列 输入NCBI网站用Blast功能进行检索，该序列在所有羊种布鲁氏菌基因组均 存在，而与其他种布鲁氏菌的基因组序列同源性很低。
利用AlleleID 6软件分析，获得了一对针对上述序列的特异性引物和 Taqman探针：
上游引物：5′-AGCGAGATTGGAATAGCTTACCC-3′(SEQ ID NO：10)；
下游引物：5′-CTGGTTACGTTGAATGCAGACAC-3′(SEQ ID NO：11)；
探针序列：5′-CGCCCTGCCACCAGCCAATAACGG-3′(SEQ ID NO：12)；
根据实时荧光PCR仪的性能，探针的荧光修饰基团可选择为FAM、VIC或 Cy5等。为了建立三重实时荧光定量PCR检测试剂盒的需要，本探针优先选 择Cy5标记，淬灭基团为BHQ2。
该组引物和探针特异地识别羊种布鲁氏菌，以下实施例中也称为羊种布 鲁氏菌特异性引物探针，用BM表示。
实施例4布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR实验室验证
1.DNA样品的准备
布鲁氏菌基因组DNA均由本实验室(中国动物卫生与流行病学中心人兽共 患病监测室)保存和提供。牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌中国流行菌株 各1株，菌株编号分别为DT20、XJ18、S20和CQ19。DNA样品浓度在0.5～ 5ng/μL之间。
2.引物和探针的合成和修饰。实施例1、2、3中设计的引物和探针由通 用生物系统(安徽)有限公司合成。实施例1中通用型布鲁氏菌引物分别命名 为BCSP-F和BCSP-R，探针命名为BCSP-P,5’端用FAM基团修饰。实施例2 中牛种布鲁氏菌特异性引物分别命名为BA-F和BA-R，探针命名为BA-P,5’ 端用VIC基团修饰。实施例3中羊种布鲁氏菌特异性引物分别命名为BM-F 和BM-R，探针命名为BM-P,5’端用Cy5基团修饰。合成的引物和探针用无Rnase和Dnase的双蒸水进行溶解，稀释成10μM的工作浓度。
3.反应体系的配制。单个反应按表1配制，反应体积为20μL。
表1：三重实时荧光定量PCR反应体系的配制表
上述反应体系充分混匀后，置QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪上，按 照下列条件运行：95℃预热5min；然后95℃10s,60℃30s,共40个循环， 60℃结束时收集信号。以双蒸水作为阴性对照，每种基因组模板重复三个反 应。
4.结果：每个基因组模板检测的Ct值见表2。结果显示，BCSP引物和探 针(FAM)能有效扩增牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组DNA，具有布 鲁氏菌检测的通用性(图1)。BA引物和探针(VIC)只扩增牛种布鲁氏菌基 因组DNA，对羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组DNA均不扩增，具有种特异 性(图2)。BM引物和探针(Cy3)只扩增羊种布鲁氏菌基因组DNA，对牛种、 猪种和犬种布鲁氏菌基因组DNA均不扩增，也具有种特异性(图3)。阴性 对照(双蒸水)无扩增。
以上结果证明，本发明设计的三重实时荧光定量PCR不但可以检测所有种 类的布鲁氏菌，而且可以有效区分牛种和羊种布鲁氏菌。
表2：牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR结果表
注：-表示无扩增。
实施例5布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR与其他细菌的交叉反应试验
选取牛、羊等家畜常见的其他细菌性病原微生物，验证布鲁氏菌三重实 时荧光定量PCR的特异性。
1.细菌基因组DNA样品的准备
致病性大肠杆菌(O157)、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌、人苍白杆菌氏 菌、单增李斯特氏菌、产气荚膜梭菌的基因组DNA均由本实验室(中国动物 卫生与流行病学中心人兽共患病监测室)保存。基因组DNA样品浓度稀释成 10ng/μL浓度备用。
2.三重实时荧光定量PCR反应体系的配制和反应条件按实施例4中的方 法进行操作。
3.结果显示：本发明设计的三组引物和探针对致病性大肠杆菌(O157)、 沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌、人苍白杆菌氏菌、单增李斯特氏菌、产气荚 膜梭菌的基因组DNA均不能扩增。表明，利用本发明引物探针所建立的布鲁 氏菌三重实时荧光定量PCR具有非常好的特异性。
实施例6布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR的灵敏度分析
1.DNA标准品的准备
以羊种布鲁氏菌XJ18和牛种布鲁氏菌DT20株(中国动物卫生与流行病学 中心人兽共患病监测室生物安全三级实验室保存)制备DNA标准品。XJ18和 DT20菌株经培养、回收菌体、灭活后，用细菌基因组提取试剂盒(天根生化 科技有限公司)纯化基因组DNA，用新弈生物TD-1数字PCR平台对基因组DNA 含量进行测定。然后，将XJ18和DT20菌株的基因组稀释为2000copies/μ L溶液，并做10倍梯度稀释，备用。阴性对照为无Rnase和Dnase的双蒸水。
2.单重实时荧光定量PCR反应体系的配制和扩增。按照表3分别配制通 用型布鲁氏菌反应体系(BCSP)、牛种布鲁氏菌反应体系(BA)和羊种布鲁 氏菌反应体系(BM),并按照实施例4中3所示的程序进行扩增。每个样品稀 释度做3个重复。
表3：单重实时荧光定量PCR反应体系的配制表
| 组份 | 加样量(μL) |
| 2XqPCR预混液 | 10 |
| 上游引物(10μM) | 0.4 |
| 下游引物(10μM) | 0.4 |
| 探针(10μM) | 0.2 |
| 基因组模板 | 5 |
| 双蒸水 | 4 |
3.三重实时荧光定量PCR反应体系的配制和扩增。体系的配制和反应按 照实施例4中3所示进行，并做适当调整。模板的添加量为5μL，水的加入 量为2μL。每个样品稀释度做3个重复。
4.单重实时荧光定量PCR检测结果。
(1)通用型布鲁氏菌引物探针对不同拷贝数的羊种(XJ18)和牛种(DT20) 布鲁氏菌基因组的检测结果如表4所示。对于羊种布鲁氏菌，含量为10000 copies/μL的基因组对应的平均Ct值为26.58，经10倍连续稀释为含1拷 贝的浓度后，其对应的Ct值为36.05。而稀释到1个拷贝以下(等同于1个 拷贝)的Ct值范围为35.2～37.13。对于牛种布鲁氏菌，检测的Ct值与羊 种布鲁氏菌近似，单个拷贝的牛种布鲁氏菌基因组对应的Ct值为36.74。因此，本发明提供的布鲁氏菌属特异性引物和探针检测的布鲁氏菌基因组最低 限为1个拷贝，阈值设定为38，Ct值<38的样品可诊断为阳性。
表4：通用型引物探针对不同基因组拷贝数的牛种、羊种布鲁氏菌基因 组的检测结果表
(2)牛种布鲁氏菌引物探针对不同拷贝数的牛种(DT20)布鲁氏菌基因组 的检测结果如表5所示。含量为10000copies/μL的基因组对应的平均Ct 值为23.94，经10倍连续稀释为含1拷贝的浓度后，其对应的Ct值为37.57。 连续10倍稀释的基因组扩增曲线和标准曲线如图4所示。基于此数据，本发 明设计的牛种布鲁氏菌特异性引物和探针检测的基因组最低限设定为1个拷 贝，阈值设定为38，Ct值<38的样品可诊断为阳性。
表5：牛种布鲁氏菌引物探针对不同拷贝数的牛种布鲁氏菌基因组的检 测结果表
(3)羊种布鲁氏菌引物探针对不同拷贝数的羊种(XJ18)布鲁氏菌基因 组的检测结果如表6所示。含量为10000copies/μL的基因组对应的平均 Ct值为23.71，经10倍连续稀释为含1拷贝的浓度后，其对应的Ct值为 37.44。连续10倍稀释的基因组扩增曲线和标准曲线如图5所示。基于此数 据，本发明设计的牛种布鲁氏菌特异性引物和探针检测的基因组最低限设定 为1个拷贝，阈值设定为38，Ct值<38的样品可诊断为阳性。
表6羊种布鲁氏菌引物探针对不同拷贝数的羊种布鲁氏菌基因组的检测 结果表
| 拷贝数 | Ct1 | Ct2 | Ct3 | 平均Ct |
| 10000 | 23.91 | 23.79 | 23.42 | 23.71 |
| 1000 | 26.93 | 26.76 | 26.81 | 26.83 |
| 100 | 30.3 | 29.71 | 30.17 | 30.06 |
| 10 | 34.51 | 33.27 | 33.85 | 33.88 |
| 1 | 37.01 | 37.77 | 38.06 | 37.61 |
| 0.1 | - | - | 37.44 | 37.44 |
| 0.01 | - | - | - | - |
| 0.001 | - | - | - | - |
5.三重实时荧光定量PCR检测结果。
(1)不同拷贝数的羊种布鲁氏菌(XJ18)基因组三重实时荧光定量PCR 检测结果如表7所示。羊种布鲁氏菌基因组可同时被BCSP引物和探针和BM 引物和探针扩增，不被BA引物和探针扩增。因此，在扩增图谱上只出现绿色 (FAM)和深红色(Cy5)两种颜色的扩增曲线(图6)。当反应体系中，羊种 布鲁氏菌的基因组拷贝数大于等于10时，BCSP和BM引物探针都出现特征性 的扩增曲线，而且BCSP的Ct值低于BM。而当反应体系中，羊种布鲁氏菌的 基因组拷贝数≤1时，BCSP引物探针无扩增，而BM引物探针可有效扩增，平 均Ct值为36.82。因此，本发明设计的三重实时荧光定量PCR用于羊种布鲁 氏菌检测时，检测的布鲁氏菌基因组最低限为10个拷贝，阈值设定为38， Ct值<38的样品可诊断为阳性。
表7：羊种布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR检测结果表
(2)不同拷贝数的牛种(DT20)布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR 检测结果如表8所示。羊种布鲁氏菌基因组可同时被BCSP和BA引物和探针 扩增，不被BM引物和探针扩增。因此，在扩增图谱上只出现绿色(FAM)和 粉红色(VIC)两种颜色的扩增曲线(图7)。当反应体系中，羊种布鲁氏菌 的基因组拷贝数大于等于10时，BCSP和BA引物探针都出现特征性的扩增曲 线，而且BCSP的Ct值低于BA。而当反应体系中，羊种布鲁氏菌的基因组拷 贝数≤1时，BA引物探针的三个重复均可有效扩增，平均Ct值为37.51，但 BCSP引物探针虽有扩增，但重复样品中仅1个出现扩增。因此，本发明设计 的三重实时荧光定量PCR用于羊种布鲁氏菌检测时，检测的布鲁氏菌基因组 最低限为10个拷贝，阈值设定为38，Ct值<38的样品可诊断为阳性。
表8：牛种布鲁氏菌基因组三重实时荧光定量PCR检测结果表
综上，本发明所设计的三对引物和探针如果单独用于扩增布鲁氏菌的基 因组DNA时，其敏感性很高，可以有效检测一个拷贝的基因组。当这三对引 物探针用于同一体系中，以三重实时荧光定量PCR方式扩增布鲁氏菌的基因 组DNA时，可以有效检测至少10个拷贝的基因组DNA。考虑到多重PCR引物 探针对不同目的片段的扩增效率会存在微小的差异，当目的基因组含量极低 时，如仅有一个或数个基因组拷贝，扩增效率高的引物探针会优先与目的片 段结合并扩增，从而掩盖了另一对引物和探针的扩增。而本发明所提供的三 重实时荧光定量PCR仍然可以有效扩增至少10个拷贝的目的基因组DNA，与 普通PCR方法和传统的病原分离鉴定方法相比，具有很高的优势，完全可以 满足检测的需要。
实施例7布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR用于临床分离菌株的检测
1.临床分离布鲁氏菌菌株的准备
布鲁氏菌中国流行菌株由本实验室(中国动物卫生与流行病学中心人兽共 患病监测室)保存和提供。选择了羊种布鲁氏菌25株、牛种布鲁氏菌10株、 猪种布鲁氏菌2株、犬种布鲁氏菌2株，以及布鲁氏菌A19(牛种)、Rev1 (羊种)、M5(羊种)、S2(羊种)疫苗株。这些流行菌株的种类和生物型 均通过传统的生化方法进行了鉴定，包括H2S产生试验、氧化酶反应试验、 染料抑菌试验、CO2需求试验等。同时，也用传统的多重PCR(Bruce-ladder) 方法进行了符合。这些流行菌株和疫苗株在中国动物卫生与流行病学中心人 兽共患病监测室生物安全三级实验室内复苏、扩大培养后，提取纯化基因组 DNA并稀释成1～10μg/μL左右的浓度备用。
2.PCR体系的配制和反应按照实施例4中3所示进行。每个样品做1个 重复。以Rnase和Dnase的双蒸水为阴性对照。
3.结果判定。阴性对照无扩增，检测样品如果出现标准的扩增曲线，且Ct值小于38。
结果显示，三重实时荧光定量PCR对所有流行菌株和疫苗的种属都能有效 识别，阳性Ct值范围在13～22之间(图8)。FAM通道可以识别所有的布鲁 氏菌流行菌株及疫苗株，VIC通道特异性识别牛种布鲁氏菌流行菌株和A19 疫苗株，Cy5通道特异性识别羊种布鲁氏菌流行菌株和Rev1、M5疫苗株，而 猪种和犬种布鲁氏菌不被识别，具体结果见下表9。
表9：布鲁氏菌流行菌株和疫苗株三重实时荧光定量PCR检测结果表
| 样本种类 | FAM | VIC | Cy3 |
| 牛种(10株) | 10/10 | 10/10 | - |
| 羊种(25株) | 25/25 | - | 25/25 |
| 猪种(2株) | 2/2 | - | - |
| 犬种(2株) | 2/2 | - | - |
| A19(牛种) | + | + | - |
| Rev1(羊种) | + | - | + |
| M5(羊种) | + | - | + |
| S2(猪种) | + | - | - |
注：+表示阳性结果；n/n表示阳性菌株的个数；-表示无扩增。
以上结果证明，本发明设计的引物和探针可替代传统病原学鉴定方法(生 化鉴定和多重PCR)对布鲁氏菌的种进行鉴定。
实施例8布鲁氏菌三重实时荧光定量PCR用于临床样品的检测
1.临床样品的选择。布病感染动物的流产物、奶、阴道分泌物、肝脾组 织中等含有大量病原菌，是实时荧光定量PCR检测的理想样品。本实验选取 某地发病牛的流产物(胎衣或羊水)34份、奶8份、脾脏8份，某地发病羊 群的阴道拭子10份。经传统的布鲁氏菌病原分离鉴定，从发病牛的这些样品 中已经分离到牛种布鲁氏菌野毒株，从发病羊群的患病羊子宫组织已分离到 羊种布鲁氏菌野毒株，确认该羊群感染了布鲁氏菌。
2.DNA的提取。
流产物的处理：取羊水或研磨后的胎衣200μL，12000转/分钟，离心 10分钟，弃去上层液体，沉淀按照细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有 限公司)的方法提取DNA。
奶的处理：取200μL奶转移至1mL离心管中，加入800μL生理盐水， 混合均匀，12000转/分钟，离心10分钟，弃去上层液体，用无菌棉签将脂 肪层涂抹干净，剩余的沉淀用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。
阴道拭子的处理：将拭子浸入1mL无菌生理盐水，震荡10秒，弃去拭子， 12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，沉淀用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。
脾脏的处理：取肝脏10克置25mL研磨管中，加入5mL无菌生理盐水， 研磨1分钟；取200μL研磨上清，12000转/分钟离心5分钟，弃去上清， 沉淀用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。
3.PCR体系的配制和反应按照实施例4中3所示进行，除了模板的添加 量改为5μL，用2μL双蒸水补足体积至20μL。
4.结果。
(1)34份牛的流产物(胎衣或羊水)经三重实时荧光定量PCR检测，有 30份为BSCP和BA阳性，确认为这些发病动物为牛种布鲁氏菌感染；有3份 样品呈现BSCP和BA双阴性，说明样品中没有检出布鲁氏菌的核酸；有1份 样品BSCP阳性，但BA为阴性，说明该样品中存在其他种布鲁氏菌的核酸(见 表10)。34份样品中有23份经病原分离鉴定分离出牛种布鲁氏菌，与实时 荧光定量PCR检测方法一致；11份未分离到布鲁氏菌的样品包括3个三重实 时荧光定量PCR阴性的样品(样品5、12、18)，和1个BSCP阳性BA阴性 的样品(样品14),其他7个样品虽然三重实时荧光定量PCR阳性，但没有 分离到布鲁氏菌，这是由于传统的病原学分离鉴定敏感性较低所致。实时荧 光定量PCR检测的Ct值的范围在24.24～35.35之间，根据标准曲线可以估 算出样品中布鲁氏菌的含量，大约在5～7000个CFU之间。三重实时荧光定量PCR扩增曲线见图9。
表10：牛流产物样品三重实时荧光定量PCR检测结果
| 样品编号 | BSCP | BA | BM | 病原分离 | 样品编号 | BSCP | BA | BM | 病原分离 |
| 1 | 30.55 | 30.35 | - | + | 18 | - | - | - | - |
| 2 | 34.85 | 34.68 | - | - | 19 | 29.29 | 28.56 | - | + |
| 3 | 28.08 | 24.48 | - | + | 20 | 26.26 | 28.56 | - | + |
| 4 | 29.29 | 26.52 | - | + | 21 | 30.30 | 32.64 | - | - |
| 5 | - | - | - | - | 22 | 26.26 | 26.52 | - | + |
| 6 | 34.34 | 28.56 | - | + | 23 | 31.31 | 32.64 | - | + |
| 7 | 35.35 | 32.64 | - | + | 24 | 32.32 | 34.68 | - | - |
| 8 | 34.34 | 32.64 | - | - | 25 | 24.24 | 24.48 | - | + |
| 9 | 30.10 | 30.60 | - | + | 26 | 26.26 | 28.56 | - | + |
| 10 | 26.26 | 28.56 | - | + | 27 | 28.28 | 28.56 | - | + |
| 11 | 32.32 | 30.60 | - | + | 28 | 32.32 | 34.68 | - | - |
| 12 | - | - | - | - | 29 | 28.28 | 29.58 | - | + |
| 13 | 30.30 | 26.52 | - | + | 30 | 26.26 | 28.56 | - | + |
| 14 | 29.29 | - | - | - | 31 | 26.26 | 28.56 | - | + |
| 15 | 28.28 | 28.56 | - | + | 32 | 26.26 | 26.52 | - | + |
| 16 | 26.77 | 28.56 | - | + | 33 | 32.83 | 34.68 | - | - |
| 17 | 33.84 | 34.68 | - | - | 34 | 29.29 | 28.56 | - | + |
(2)牛奶样和脾脏检测结果。经三重实时荧光定量PCR检测，8个牛奶 样品中有7个呈牛种布鲁氏菌阳性，8个牛脾脏样品均检出牛种布鲁氏菌核 酸(表11)。在所有样品中均分离出牛种布鲁氏菌，因此，该实时荧光定量 PCR检测结果与病原分离鉴定结果基本一致。奶样和脾脏实时荧光定量PCR 检测的Ct值的范围在25.07～37.57之间，说明样品中的含菌量低于流产物 中的含菌量。三重实时荧光定量PCR扩增曲线见图10。
表11：牛奶和牛脾脏样品三重实时荧光定量PCR检测结果表
(3)羊阴道拭子检测结果。10个羊阴道拭子中有5份呈BSCP阳性，而 BSCP和BM均呈阳性的样品仅有1份(样品1)，也仅从该羊的子宫角中分离 到羊种布鲁氏菌野毒株。虽然这10个拭子来自于布病阳性羊群，但并不意味 着每个羊都感染了布鲁氏菌。而且，即使布病感染羊也并不意味着可以从阴 道排出布鲁氏菌，因为阴道排菌与羊的怀孕状态有着很大的关系，怀孕后期 和围产期排菌量大，不怀孕或怀孕早期不排菌或排菌较少。因此，仅有部分 阴道拭子检出布鲁氏菌符合该病的发病特点。而且，该数据显示，实时荧光 定量PCR检测方法的敏感性要大于传统的病原分离鉴定。三重实时荧光定量 PCR扩增曲线见图11。
表12：羊阴道拭子三重实时荧光定量PCR检测结果表
| 样品编号 | BCSP | BM | BA | 病原分离 |
| 1 | 29.03 | 31.27 | - | + |
| 2 | 36.59 | - | - | - |
| 3 | 34.38 | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | 36.45 | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | 36.86 | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | - | - | - | - |
| 10 | - | - | - | - |
综上，本发明制备的BSCP引物和探针具有通用性，可检测所有种的布鲁 氏菌，BA和BM引物和探针具有种特异性，可分别检测牛种和羊种布鲁氏菌。 这三对引物探针不但可以独立使用，也可以制备成三重实时荧光定量PCR方 法，用于布鲁氏菌种的鉴定。检测的样品可以是分离的菌株，也可以是临床 收集的流产物、奶、拭子、组织等样品，而且具有高敏感性、高特异性等特 点。该发明所建立的实时荧光定量PCR不但可以用于布病病原学检测，最重 要的是可以特异性地识别牛种和羊种布鲁氏菌，为我国布病检测和防控提供 重要的技术支持。基于此，本文所描述的实施例仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggagccta taaggacgtg gcggaaacac cgacccttgc cgttgccgca cagtgggtga 60
cgagcgccaa gcagccggac gacctcatct ataacatcac caaggttctc tggaacgagg 120
atacacgcaa 130
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggagccta taaggacgtg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgcgtgtat cctcgttcca g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accgaccctt gccgttgccg c 21
<210> 5
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagttctcga acaagctgac gggcagcggc acgcttgctg tgtcgggttc tggcacgctg 60
atcctttcgg cggccaatga ttatag 86
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagttctcga acaagctgac g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctataatcat tggccgccga aag 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcgtgcca gaacccgaca cagc 24
<210> 9
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcgagattg gaatagctta cccgccaatc ttcgccctgc caccagccaa taacggcaat 60
tatcgctgtc actgttgcaa gtatggcagc gagcgctcta gcgtgacgaa gcactgtctt 120
tctgacaatt tccagattca cccctagggc gtgtctgcat tcaacgtaac cag 173
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcgagattg gaatagctta ccc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctggttacgt tgaatgcaga cac 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgccctgcca ccagccaata acgg 24
Claims (10)
1.一种用于鉴别牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌的特异性核酸片段，其特征在于，所述的特异性核酸片段的序列为SEQ ID NO：1。
2.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的引物对，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：2，下游引物的序列为SEQ ID NO：3。
3.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的探针，其特征在于，所述的探针的序列为SEQ ID NO：4。
4.一种用于检测牛种布鲁氏菌的特异性核酸片段，其特征在于，所述的特异性核酸片段的序列为SEQ ID NO：5。
5.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的引物对和探针，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：6，下游引物的序列为SEQ ID NO：7；所述的探针的序列为SEQ ID NO：8。
6.一种用于检测羊种布鲁氏菌的特异性核酸片段，其特征在于，所述的特异性核酸片段的序列为SEQ ID NO：9。
7.用于检测权利要求9所述的特异性核酸片段的引物对和探针，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：10，下游引物的序列为SEQ ID NO：11；所述的探针的序列为SEQ ID NO：12。
8.如权利要求3、权利要求5和权利要求7中所述的探针，其特征在于，所述探针采用荧光报告和淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列5′端,淬灭基团修饰在探针序列3′端。
9.权利要求2、权利要求3、权利要求5和权利要求7中所述的引物对和探针在制备牛种和羊种布鲁氏菌鉴别诊断试剂盒中的应用。
10.一种牛种和羊种布鲁氏菌鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求2、权利要求3、权利要求5和权利要求7中所述的引物对和探针。
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|---|---|---|---|---|
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-
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