KR20210103109A - 열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 및 이를 이용하는 열성 질환 원인체 동시 검출 방법을 제공하여 다양한 종류의 열성 질환을 동시에 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법{PRIMER AND PROBE SETS FOR DETECTING SUBJECTS CAUSING FEBRILE DISEASE, KIT COMPRISING THE SAME AND DETECTING METHOD USING THE SAME}
본 출원은 다양한 종류의 열성 질환 원인체를 동시에 정확하고 신속하게 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트와 이를 이용한 질환 원인체 검출 방법에 대한 것이다.
열성 질환은 10~11월 가을철이 되면 주의해야 하는 질환들로 초기 증상이 감기와 비슷하여 발견하지 못하고 치료시기를 놓친다면 합병증으로 이어질 수 있다. 이러한 질환들의 공통적인 증상으로는 열이 나면서 감기몸살과 같은 증상을 수반한다는 것이며, 심각한 경우 환자를 사망에 이르게 하기 때문에 빠른 시일 내에 적절한 치료를 받는 것이 중요하다.
바르토넬라(Bartonella spp.)는 그람음성의 소간균으로 운동성이 있는 절대 호기성 균으로 고양이가 할퀴거나 핥거나 무는 경우, 손상된 피부를 통하여 병원체가 감염된다. 열, 두통, 인후염, 결막염, 식욕부진 등의 증상이 동반할 수 있으며, 감염자는 보통 수 주내에 회복이 되지만, 어린이의 경우 경미한 만성 림프절염을 유발할 수 있다.
브루셀라(Brucella spp .)에 속하는 대표주로서는 염소유산균, 돼지유산균이 있으며 이들에 의한 질병을 브루셀라증이라고 한다. 그람음성의 구균에 가까운 소간균(0.6~1.5X0.5~0.7㎛)으로 아포, 편모가 없으며, S형균은 협막을 가진다. 보통 한천배지에는 발육불량이나, 간 엑기스나 혈청, 혈액을 포함한 배지에는 잘 발육하지만, 본래는 소, 양, 돼지 등의 병원균이나, 사람에도 감염되어 파상열을 일으킬 수 있고, 감염 시 식욕감퇴, 오한, 발한, 피곤, 쇠약, 두통, 발열 등 비 특이적 증상이 나타난다.
버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei , B. pseudomallei)는 그람음성간균으로써, 세균성 감염병인 유비저(Melioidosis)를 발병시킨다. 2010년 「감염병의 예방 및 관리에 관한 법률」에 의해 제4군감염병으로 지정되어 감시체계상 신고대상 질환으로 분류된 이후 매년 감염사례가 증가 추세에 있으며, 무증상 감염이 많고, 고열, 두통, 식욕부진, 발열, 간질 등의 증상이 나타나며, 사망률이 40%로 고위험 병원체이다.
렙토스피라(Leptospira spp.)은 트레포네마(Treponema) 등과 함께 스피로헤타 문(Phylum Spirochaetes)에 포함되는 속(Genus)으로 소수의 병원성 및 부생성 종 등 주로 동물에서 병을 일으키는 주요 종들을 포함하고 있다. 렙토스피라증은 인수공통감염병(zoonosis)로 사람과 동물 모두에게 영향을 미치고 광범위한 증상을 유발한다. 전형적인 전염원 동물은 생쥐나 쥐인데, 이들은 세뇨관에 렙토스피라균을 보유하고 있음에도 불구하고 특별한 증세가 없다.
또한, 감염된 사람의 대부분이 거의 증세가 없거나 발열, 두통, 오한, 근육통, 구토, 황달, 적목, 복통, 설사, 발진 등의 미약한 증세를 일으키지만 렙토스피라증 환자의 10% 정도는 심각한 형태로 발전하기도 하는데, 신장 손상, 수막염, 간 기능 장애 및 호흡기 질환 등 다양한 장기에 손상을 일으켜 매우 높은 치사율을 보이기도 한다.
말리리아(Malaria)는 플라스모디움(Plasmodium) 속에 속하는 말라리아 원충에 감염되어 발생하는 급성 열성 전염병으로, 얼룩날개 모기류(Anopheles species)에 속하는 모기에 의해서 말라리아 원충이 전파된다. 사람에 감염되는 말라리아 원충에는 5가지가 있는데, 열대열원충(Plasmodium falciparum , pf) 원숭이열 원충(Plasmodium knowlesi), 3일열 원충(Plasma vivax , pv), 난형열 원충(plasmodium ovale), 4일열 원충(plasma malariae)가 속한다. 말라리아는 감염된 모기에게 물린 후 증상이 나타날 때까지 잠복기를 가지며, 발명되면 오한, 발열, 구토, 설사 등의 증상이 순차적으로 나타난다. 적혈구가 파괴되면서 열이 주기적으로 발생하는데, 보통 3~4일 정도마다 발열이 일어난다.
쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi, OT)은 급성 발열성 질환으로, 진드기의 유충에 물려서 발생하며 발열, 두통, 피부발진으로 나타나고 진드기가 달라붙은 부위에 가피가 관찰되는 것이 특징이다. 진드기에 물리고 나서 6일 ~ 21일(보통 10일 ~ 12일) 정도의 잠복기가 지난 후에 증상이 나타난다. 발열, 발한, 두통, 결막충혈, 림프절 종대(림프절이 붓는 현상)의 증상이 나타나며 발열과 함께 암적색의 평평하거나 솟아 있는 발진이 몸통과 사지에 나타난다.
리케치아(Rickettsia spp.)은 발진열을 동반하는 급성 발열성 질환인 리케치아증을 유발하며, 자연에서 이, 진드기, 벼룩 등의 흡혈성 절지동물에 기생하면서 이들을 매개로 하여 감염된다. 사람에게 발병하는 리케치아증은 11가지 정도가 알려져 있으며 대표적으로 유행성 발진티푸스, 로키산열, 쯔쯔가무시증, 발진열 등이 있다. 발진열 군은 주로 전신 혈관염을 일으켜 피부발진과 뇌, 신장, 폐 기능을 저하시키기도 한다.
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)는 그람음성균으로 급성 전신성 열성 질환을 일으킬 수 있으며, 통성 혐기성이고, 무아포성으로 편모를 가지고 있어 운동성을 가진다. 다양한 혈청형에 따라 숙주 특이성, 항생제 내성 등의 다양한 특성을 가지며 수많은 혈청형들은 사람과 동물에 병원체로 작용하는데 주로, 구토 및 단순설사 등 초기증상이 나타나며 발열, 복통, 근육통 및 두통 증상이 나타나고, 이러한 증상들은 2일에서 1주간 지속하다가 자연적으로 회복된다.
폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 그람양성균으로, 폐렴의 주요 원인이다. 세계적으로 퍼져 있으며, 폐렴, 부비동염과 중이염, 수막염, 균혈증을 유발한다. 또한, 폐렴은 갑작스럽게 증상이 나타나며, 매우 떨리는 오한과 39~41℃로 지속되는 발열이 있으며, 폐렴에 의한 전체 사망률은 5%이다.
크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus)는 급성 열성 출혈성 질환을 유발한다. 주로 크림-콩고출혈열 바이러스를 보유한 진드기가 매개가 되어 발생되고, 이 진드기는 황소 등 뿔 달린 동물, 포유류, 조류, 설치류 등에 붙어 다닌다. 이 진드기에 물리면 2~14일의 잠복기를 거친 후에 첫 단계에서 39~40℃의 고열과 오한이 일어나면서 간혹 의식을 잃는 증세를 동반한 감기 증세가 나타난다. 일반적으로 출혈, 신경계 합병증, 폐출혈 등으로 인한 쇼크로 사망하며 치사율은 30~50%이다.
치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)는 토가바이러스 과(科) 알파바이러스 속(屬)에 속한 바이러스의 일종으로, 모기에 의하여 전파되며, 아프리카와 말레이시아 등에서 발견된다. 급성 발열성 질환인 치쿤구니야열을 유발하고, 열, 두통, 피로, 오심, 구토, 근육통, 발진, 관절통 등 증상이 갑자기 나타나지만, 감염에 의한 사망자는 극히 적다.
뎅기 바이러스(Dengue virus)는 Flavivirus속의 다른 바이러스와 마찬가지로 외피막을 가지는 정이십면체의 바이러스이다. Aedes 속의 모기에 의해 종간 전파되며, 이집트 숲모기, 흰줄숲모기가 주요 매개체이다. 잠복기는 평균 5~8일(3~15일)이며 증상이 나타나지 않는 경우가 70~80% 정도이다. 주요 증상으로는 갑작스러운 고열, 두통, 안구통, 근육통, 관절통이며 대부분 자연 치유된다. 발진은 반점 구진성(5반점 모양으로 피부에 작게 돋아 나는)형태로 발열 후 3~5일 뒤에 몸통에서 시작하여 팔다리, 얼굴로 퍼져 나간다. 중증 뎅기열(뎅기출혈열, 뎅기쇼크)은 성인보다 소아에서 주로 발생하며, 혈장 유출이 나타나고 이에 따른 혈색소의 급격한 상승, 복통, 지속적인 구토, 혈압 저하, 호흡 곤란, 점상 출혈, 잇몸 출혈 등 다양한 증상이 나타날 수 있고, 체액 저류, 흉수나 복수가 생기고 간 비대가 나타날 수 있다. 심한 경우 장기부전 등의 합병증으로 사망에 이르기도 한다.
E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus)는 오염된 물이나 음식을 통해 경구적으로 감염될 수 있으며, E형 간염이 된다. E형간염바이러스의 증상은 E형간염바이러스에 감염된 뒤 7~10일 간의 잠복기를 거치고 나타난다. 초기에는 황달이 나타나고 그 뒤를 이어 메스꺼움과 구토, 복통, 설사 같은 증상이 나타나고 흑뇨와 관절통증, 발진, 가려움증 같은 증상도 생긴다. 병이 진행되며 발열과 간 비대가 나타나기도 한다. 하지만 E형간염은 만성화 되거나 바이러스를 몸 안에 지니지만 증상이 나타나지는 않는 보균자 상태가 되지는 않는데, 이 점은 A형 간염과 유사하다.
지카 바이러스(Zika virus)는 정이십면체의 뉴클레오캡시드는 숙주세포의 소포체에서 유래한 외피막에 의해 둘러싸여 있으며, Aedes 속의 모기에 의해 전파된다. 감염에 의한 특징적인 증상은 반점 구진성(반점 모양으로 피부에 작게 돋아나는) 발진을 동반한 갑작스러운 발열이며, 관절통, 결막염, 근육통, 두통이 동반될 수 있다. 증상은 약 3~7일 정도 경미하게 진행된다. 일부 환자의 경우 길랭-바레 증후군, 뇌수막염, 급성 미만성뇌염과 같은 신경학적 합병증, 혈소판 감소 자반증, 백혈구 감소증과 같은 자가면역 합병증, 소두증, 태아 기형과 같은 증상이 보고되었다.
한편, 급성 열성 질환들은 최근 수년간 발생 빈도가 급격히 증가하는 양상을 보이고 있지만 질환들의 초기 증상이 서로 비슷하여 초기에 구별이 쉽지 않다는 문제가 있기 때문에 민감성과 특이성이 높고, 진단이 용이한 새로운 프라이머 및 프로브, 신속한 판단이 이루어질 수 있는 검출 방법의 개발이 필요하다.
또한, 열성 질환의 발생 시 병원체를 신속하게 분석하여 즉각적인 의사결정을 내릴 수 있는 현장진단법은 아직 도입되지 않은 실정이다. 또한, 여러 종의 병원체가 섞여 있는 경우 이들을 동시에 검출할 필요도 있다.
따라서, 여러 종의 열성 질환 병원체에 대하여 동시에 신속하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 출원에 따른 프라이머 및 프로브 세트는 상기한 바와 같은 종래 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 열성 질환 동시 검출용 키트, 이를 이용하는 열성 질환 원인체 동시 검출 방법을 제공하고자 한다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는, a) 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 및 b) 하기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 를 포함하고, 상기 프라이머 및 프로브 세트는, 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 바르토넬라(Bartonella spp.)의 검출을 위한 제1 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 브루셀라(Brucella spp.) 검출을 위한 제2 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 7 내지 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 검출을 위한 제3 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 10 내지 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 렙토스피라(Leptospira spp.) 검출을 위한 제4 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트 및 서열번호 19 내지 21의 프로브 세트를 포함하는 말라리아(Malaria) 검출을 위한 제5 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 22 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi, OT) 검출을 위한 제6 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 25 내지 26의 프라이머 세트 및 서열번호 27의 프로브를 포함하는 리케치아(Rickettsia spp.) 검출을 위한 제7 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 28 내지 29의 프라이머 세트 및 서열번호 30의 프로브를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출을 위한 제8 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 31 내지 32의 프라이머 세트 및 서열번호 33의 프로브를 포함하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 검출을 위한 제9 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 34 내지 35의 프라이머 세트 및 서열번호 36의 프로브를 포함하는 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) 검출을 위한 제10 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 37 내지 38의 프라이머 세트 및 서열번호 39의 프로브를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출을 위한 제11 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 40 내지 42의 프라이머 세트 및 서열번호 43 내지 44의 프로브 세트를 포함하는 뎅기 바이러스(Dengue virus) 검출을 위한 제12 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 45 내지 46의 프라이머 세트 및 서열번호 47의 프로브를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 검출을 위한 제13 프라이머 및 프로브 세트, 및 서열번호 48 내지 50의 프라이머 세트 및 서열번호 51 내지 52의 프로브 세트를 포함하는 지카 바이러스(Zika virus) 검출을 위한 제14 프라이머 및 프로브 세트이고, 상기 추출한 핵산이 RNA인 경우, 역전사 반응을 통해 주형 DNA를 합성하는 단계를 더 포함하고, 상기 역전사 반응 및 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 동시 또는 순차적으로 진행되며, 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 2종 이상의 열성 질환 원인체의 존재 또는 부존재를 동시에 검출하는, 열성 질환 원인체 동시 검출 방법을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서 상기 실시간 중합효소연쇄반응 중 변성 단계의 시간이 10초에서 20초일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 바르토넬라(Bartonella spp.) 검출을 위한 제1 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 브루셀라(Brucella spp.) 검출을 위한 제2 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 내지 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 검출을 위한 제3 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 내지 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 렙토스피라(Leptospira spp.) 검출을 위한 제4 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트 및 서열번호 19 내지 21의 프로브 세트를 포함하는 말라리아(Malaria) 검출을 위한 제5 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 22 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi, OT) 검출을 위한 제6 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 25 내지 26의 프라이머 세트 및 서열번호 27의 프로브를 포함하는 리케치아(Rickettsia spp.) 검출을 위한 제7 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 28 내지 29의 프라이머 세트 및 서열번호 30의 프로브를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출을 위한 제8 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 31 내지 32의 프라이머 세트 및 서열번호 33의 프로브를 포함하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 검출을 위한 제9 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 34 내지 35의 프라이머 세트 및 서열번호 36의 프로브를 포함하는 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) 검출을 위한 제10 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 37 내지 38의 프라이머 세트 및 서열번호 39의 프로브를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출을 위한 제11 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 40 내지 42의 프라이머 세트 및 서열번호 43 내지 44의 프로브 세트를 포함하는 뎅기 바이러스(Dengue virus) 검출을 위한 제12 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 45 내지 46의 프라이머 세트 및 서열번호 47의 프로브를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 검출을 위한 제13 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 48 내지 50의 프라이머 세트 및 서열번호 51 내지 52의 프로브 세트를 포함하는 지카 바이러스(Zika virus) 검출을 위한 제14 프라이머 및 프로브 세트;를 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 프로브의 5'말단은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texasred), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광물질로 표지 되며, 상기 프로브의 3'-말단은 BHQ-1(Black hole quencher 1), BHQ-2(Black hole quencher 2), BHQ-3(Black hole quencher 3), SFCQ, SFCQ1, MGBNFQ(Minor groove binding non-fluorescent quencher), ZEN/lowablackFQ, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광 억제 물질로 표지 될 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제5 프라이머 및 프로브 세트는, 서열번호 13 내지 14 및 19의 염기서열을 포함하는 18s rRNA에 특이적인 말라리아 전염병(malaria pandemics, Pan)을 유발하는 열대열원충(Plasmodium falciparum), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi), 3일열원충(Plasma vivax), 난형열원충(plasmodium ovale) 및 4일열원충(plasma malariae) 중 어느 하나 이상의 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 15 내지 16 및 20의 염기서열을 포함하는 유전자 Var에 특이적인 열대열원충(Plasmodium falciparum, Pf) 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 17 내지 18 및 21의 염기서열을 포함하는 유전자 Cox1에 특이적인 삼일열원충(Plasmodium vivax, Pv) 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 인 것일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트는 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 10 내지 100 copies/rxn일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 출원에 따른 열성 질환 유발 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 다양한 종류의 열성 질환을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 출원에 따른 열성 질환 유발 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 검사는 다양한 종류의 열성 질환을 교차 검출하지 않고, 동시에 구별하여 검출할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 출원에 따른 열성 질환 유발 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 검사 방법은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR)을 통해 높은 특이도와 높은 민감도로 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
그리고, 본 출원의 하나의 실시예에 따른 방법을 사용하면 신뢰성이 높고, 40분 내에 빠르고 용이하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.
이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 바르토넬라(Bartonella spp.) 검출을 위한 제1 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 브루셀라(Brucella spp.) 검출을 위한 제2 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 내지 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 검출을 위한 제3 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 내지 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 렙토스피라(Leptospira spp.) 검출을 위한 제4 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트 및 서열번호 19 내지 21의 프로브 세트를 포함하는 말라리아(Malaria) 검출을 위한 제5 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 22 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi, OT) 검출을 위한 제6 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 25 내지 26의 프라이머 세트 및 서열번호 27의 프로브를 포함하는 리케치아(Rickettsia spp.) 검출을 위한 제7 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 28 내지 29의 프라이머 세트 및 서열번호 30의 프로브를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출을 위한 제8 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 31 내지 32의 프라이머 세트 및 서열번호 33의 프로브를 포함하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 검출을 위한 제9 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 34 내지 35의 프라이머 세트 및 서열번호 36의 프로브를 포함하는 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) 검출을 위한 제10 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 37 내지 38의 프라이머 세트 및 서열번호 39의 프로브를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출을 위한 제11 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 40 내지 42의 프라이머 세트 및 서열번호 43 내지 44의 프로브 세트를 포함하는 뎅기 바이러스(Dengue virus) 검출을 위한 제12 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 45 내지 46의 프라이머 세트 및 서열번호 47의 프로브를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 검출을 위한 제13 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 48 내지 50의 프라이머 세트 및 서열번호 51 내지 52의 프로브 세트를 포함하는 지카 바이러스(Zika virus) 검출을 위한 제14 프라이머 및 프로브 세트;를 제공한다.
본 출원에서 용어 "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
또한 상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 “프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 SFTS 바이러스 및 쯔쯔가무시균을 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
본 출원에서 용어 “열성 질환”은 발열, 발진열, 열성출혈성 질환, 전신성 열성 질환을 포함하며, 공통적인 증상으로 열이 나면서 감기몸살과 같은 증상을 수반한다. 본 출원의 열성 질환은 급성 전염병에 의한 급성 열성 질환일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 프로브의 5'말단은 형광물질로 표지 되며, 상기 프로브의 3'-말단은 형광 억제 물질(소광제)로 표지 될 수 있다.
본 발명의 프로브 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프로브는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함하고, 5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하며, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.
상기 형광물질은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texasred), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 형광 억제 물질은 BHQ-1(Black hole quencher 1), BHQ-2(Black hole quencher 2), BHQ-3(Black hole quencher 3), SFCQ, SFCQ1, MGBNFQ(Minor groove binding non-fluorescent quencher), ZEN/lowablackFQ, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제5 프라이머 및 프로브 세트는, 서열번호 13 내지 14 및 19의 염기서열을 포함하는 18s rRNA에 특이적인 말라리아 전염병(malaria pandemics, Pan)을 유발하는 열대열원충(Plasmodium falciparum), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi), 3일열원충(Plasma vivax), 난형열원충(plasmodium ovale) 및 4일열원충(plasma malariae) 중 어느 하나 이상의 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 15 내지 16 및 20의 염기서열을 포함하는 유전자 Var에 특이적인 열대열원충(Plasmodium falciparum, Pf) 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 17 내지 18 및 21의 염기서열을 포함하는 유전자 Cox1에 특이적인 삼일열원충(Plasmodium vivax, Pv) 검출용 프라이머 및 프로브 세트;인 것일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트는 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트인 것일 수 있다.
본 출원에서 용어 “RT-PCR”은 역전사 중합효소 연쇄중합반응(reverse transcription polymerase chain reaction)의 약어로서, DNA를 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(PCR)의 한 종류로, RNA에 의해 생성된 상보적 DNA(cDNA)를 증폭하는 실험 기법이다. DNA의 특정 부분을 여러 번 복제하여 증폭하는 일반적인 실험 기법을 '중합효소 연쇄반응'(polymerase chain reaction, PCR)이라고 한다. 중합효소 연쇄반응은 검출을 원하는 특정 유전물질을 혈액이나 세포에서 분리한 미량의 DNA에서 짧은 시간 안에 20만~50만 배로 증폭시킬 수 있는 기술이다. 이에 비해 '역전사 중합효소 연쇄반응'은 DNA가 아닌 mRNA를 통해 실제 유전자의 발현 정도를 측정하고자 할 때 사용되는 기법으로, mRNA에서 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 인위적으로 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하고, 이 상보적 DNA로부터 중합효소 연쇄반응(PCR) 단계를 거치게 된다.
PCR은 통상적으로 3가지 반응단계로 이루어져 있다. 첫 번째는 DNA 변성단계로, 두 가닥의 DNA를 온도를 가하여 한 가닥의 DNA로 분리시키는 단계이며, 두 번째는 프라이머의 결합단계인 어닐링 단계로, 한 가닥으로 변성한 DNA와 프라이머를 공존시킨 후 온도를 낮추면 프라이머쌍이 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 결합되는 단계이고, 세 번째는 신장반응으로 4 종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서 DNA 중합효소를 작용시켜 프라이머를 신장시키는 연장 단계로 이루어져 있다. 상기 어닐링 단계와 연장 단계는 상이한 온도로 진행될 수도 있고, 동일한 온도로 진행될 수도 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서 상기 실시간 중합효소연쇄반응 중 변성 단계의 시간이 10초 이상, 30초 이하, 20초 이하일 수 있다. 10초 미만이면 14종이 동시에 검출되지 않을 수 있고, 30초가 초과하면 반응시간이 40분 이상으로 길어질 수 있다. 20초 이하이면 반응시간이 30분 이하로 빠른 시간 안에 14종을 동시에 검출할 수 있다.
상기 PCR은 통상적인 PCR 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 가장 일반적인 컨벤셔널(Conventional) PCR, 두 번의 PCR을 동시에 또는 연속해서 수행하는 듀플렉스(duplex) PCR 및 네스티드(nested) PCR, 실시간으로 결과를 확인할 수 있는 고가의 실시간(Real time) PCR을 모두 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 또는 리얼타임 PCR을 이용할 수 있다.
본 출원에서 용어 “실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time Polymerase chain reaction)"이란 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 하여 실시간으로 DNA를 증폭시키고, 증폭된 양의 측정을 동시에 하는 방법이다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 확인할 수 있기 때문에 추가적인 전기영동 분석방법을 이용하지 않아도 되며, 앤드 포인트(End point)에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR 법에 비해서 신속하고 간편하게 PCR을 해석할 수 있으며 오염의 위험성이 적다. 또한, 실시간 중합효소 연쇄 반응 증폭산물의 검출방법은 타켓 서열(target sequence)에 특이적이며 형광 염료(dye)가 결합된 프로브(Probe)를 이용하며, 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별하여 검출할 수 있다.
또한, DNA를 대상으로 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우에는 qPCR이라고 할 수 있으며, DNA 대신 RNA를 대상으로 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우에는 RT-qPCR이라고 할 수 있다.
또한, RT-PCR은 당 업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액(PCR 프리믹스)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다.
또한, PCR 완충용액은 트리스-HCl(tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR)은 감염의 초기 단계에서 바이러스의 검출을 위해 빠르고, 민감한 특정 방법으로서 매력적인 옵션이다. 표준 RT-qPCR 및 정량적 RT-qPCR은 바이러스의 조기 발견을 위한 빠르고 특수하고 민감한 방법을 제공할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 10 copies/rxn 내지 100 copies/rxn일 수 있고, 더욱 구체적으로 90 내지 100copies/rxn일 수 있으며, 더욱 더욱 더 구체적으로 100copies/rxn일 수 있다. 상기 범위에서 검출율은 90%~100%일 수 있다. 100copies/rxn 이상이면 검출률은 100% 이다.
본 출원에서 용어 “검출한계”는 분석과정을 실시한 후 분석대상물질의 유무를 확인할 수 있는 최소 검출 농도이며, 상기 범위에서 검출함으로써 본 출원의 제1 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 높은 민감도로 열성 질환을 유발하는 병원체(pathogen)들을 검출할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는, 상기 조성물을 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다.
하나의 실시예에서, 키트는 일회용 PCR 튜브와 같은 용기에 담겨있는 동결건조된(lyophilized) 프라이머를 포함할 수 있다. 본 출원의 키트는 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 PCR 튜브에 담겨있을 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1 내지 3의 프라이머와 프로브 세트가 동결건조분말 형태로 담겨있는 PCR 튜브 또는 채널과 서열번호 4 내지 6의 프라이머와 프로브 세트가 동결건조분말 형태로 담겨있는 PCR 튜브가 키트에 포함되어 총 14개 세트가 각각 담겨있는 총 14개의 튜브를 포함할 수 있다.
열성 질환을 유발하는 병원체들의 발현율을 확인하기 위한 증폭과정으로 별도의 PCR 튜브에 각각 넣어 반응을 동시에 진행함으로써, 동일한 형광 물질을 사용하는 경우에도 위치 구획에 따른 병원체들을 구분하여 반응정도를 실시간으로 확인할 수 있다는 장점이 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 각각의 프라이머 세트가 별도의 채널에 담겨있는 PCR 칩일 수 있다. 각각의 14개의 채널이 별도의 프라이머 세트를 포함하기 때문에 동일한 형광 염료를 사용하는 경우에도 14종의 열성 질환 유발 원인체들을 40분 내의 빠른 시간 내에 동시에 검출할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 각각의 프라이머 세트를 하나의 튜브에 넣고, 다른 형광 물질로 표지할 수 있다. 하나의 튜브 안에서도 14종의 열성 질환 유발 원인체들을 40분 내의 빠른 시간 내에 동시에 검출할 수 있다.
말라리아의 검출시에는, 말라리아 전염병(malaria pandemics, Pan)을 유발하는 열대열원충(Plasmodium falciparum), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi), 3일열원충(Plasma vivax), 난형열원충(plasmodium ovale) 및 4일열원충(plasma malariae) 중 어느 하나 이상의 원인체 검출을 위한 18s rRNA에는 형광 염료 Cy5로 표지할 수 있다. 열대열원충(Plasmodium falciparum, Pf) 검출을 위한 타깃 유전자 Var gene에는 형광 염료 FAM을 표지할 수 있다. 삼일열원충(Plasmodium vivax, Pv) 검출을 위한 타깃 유전자 Cox1에는 형광 염료 Texasred를 표지하여 3가지 형광 염료가 하나의 PCR 튜브에 담겨있어도 쉽게 구별하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에서 상기 열대열원충의 검출시에는, 하나의 PCR 튜브에서 Cy5와 FAM이 함께 표지 되고, Cox1는 표지 되지 않으며, 열대열원충이나 삼일열원충이 아닌 말라리아 전염병을 일으키는 원충의 검출시에는, Cy5 형광 염료만이 표지될 수 있어 다양한 열성 증상 질환들에 대한 교차 검출의 우려가 없고, 동시에 구별하여 검출할 수 있기 때문에 각각의 열성 질환 증상에 맞는 적절한 대응으로 환자의 치료에 도움을 줄 수 있다.
또한, 상기 검출용 키트 또는 검출용 조성물에는 상기 프라이머 및 프로브, 역전사 효소, 중합효소 및 버퍼를 포함하는 반응 혼합물이 액체 형태로 포함되어 있을 수 있다. 또는 이를 냉동 보관하였다가 필요시 해동하여 사용할 수 있다. 상기 검출용 키트 또는 조성물은 검체를 추가하는 것 외에 별도의 과정이 필요하지 않으므로 검출의 편의성 및 속성이 증대되는 장점이 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, a) 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 및
b) 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 를 포함하고, 상기 추출한 핵산이 RNA인 경우, 역전사 반응을 통해 주형 DNA를 합성하는 단계를 더 포함하고, 상기 역전사 반응 및 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 동시 또는 순차적으로 진행되며, 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 2종 이상의 열성 질환의 존재 또는 부존재를 동시에 검출하는 열성 질환 원인체 동시 검출 방법을 제공한다.
본 출원에서 용어 “생물학적 시료”는 열성 질환이 의심되는 검사 대상으로부터 채취한 체액 또는 조직 샘플일 수 있다. 상기 검사 대상은 인간, 야생동물, 가축, 반려동물 등을 포함하는 동물로부터 채취한 체액 또는 조직 샘플일 수 있다. 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 골수액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌추출 액, 척수액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 시료는 본 출원의 열성 질환 원인체 검출용 키트의 샘플 패드에 점적하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다.
이하, 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예들을 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이 실시예들은 오로지 본 출원을 예시하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 제조예 1> 타겟 유전자 선정 및 프라이머 및 프로브 제작
14종의 열성 질환 원인체를 한번에 동시 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 제작하였고, 각 서열은 아래 표 1과 같다. 하기 표 1과 같은 14가지 열성 질환을 한번에 동시 검출할 수 있는 프라이머를 선정하기 위해 다수의 프라이머 서열을 대상으로 실험적으로 성능을 평가한 후, 현저한 효과를 가지는 성능을 보이는 프라이머 서열들을 선택하였다.
하기 표 1의 프라이머와 프로브 서열은 동일한 조건에서 단시간 내에 한번의 반응으로 열성 질환 원인체의 동시 검출이 가능하며, 민감도가 우수하고, 표적 유전자 상의 교차반응이 일어나지 않았다. 또한, 상기 프라이머와 프로브 서열은 시료 내 포함되어 검출 결과에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응이 없었고, 재현성 있는 결과를 나타내었으며, 365일 동안의 보관 안정성을 보였다. 프로브의 5’ 말단에는 HEX, FAM, Cy5 및 Texasred로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질을 표지하였으며, 3’ 말단에는 BHQ-1, BHQ-2, SFCQ, SFCQ1, MGBNFQ 및 ZEN/lowablackFQ로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질을 결합시켰다.
No. 타겟 유전자 프라이머 -프로브 이름 5'-형광 3’
-Quencher 		프라이머 - 프로브 염기서열 5'-3' 길이 (bp) Tm
(℃)
1 Bartonella spp. ssrA Bar-ssr-F
(서열번호 1)		 GGCTAAATNAGTAGTTGCAAAYGACA 26 56.6
Bar-ssr-R
(서열번호 2)		 GCTTCTGTTGCCAGGTG 17 54
Bar-ssr-P
(서열번호 3)		 FAM BHQ1 ACCCCGCTTAAACCTGCGACG 21 62.5
2 Brucella spp. IS711 Bru-IS-F
(서열번호 4)		 CCGGAAGATATGCTTCGATCC 21 55.2
Bru-IS-R
(서열번호 5)		 CAAGGTTGTTRAAGGAGAACAG 22 52.7
Bru-IS-P
(서열번호 6)		 FAM BHQ1 TGCTCATCTGTAAGGCTTCGTCTGCT 26 61.7
3 Burkholderia pseudomallei TTS1 BP-TTS1-F
(서열번호 7)		 CGAATTGTCGTTGGACTTTCTTC 23 54.4
BP-TTS1-R
(서열번호 8)		 GCGAGCGTACTAACGGGAATC 21 57.8
BP-TTS1-P
(서열번호 9)		 FAM BHQ1 CATCCAGCGACGCATCGGGC 20 63.9
4 Leptospira spp. Lip32 Lep-Lip-F
(서열번호 10)		 CCCTANGGATCTGTRATCAACTA 23 53.9
Lep-Lip-R
(서열번호 11)		 GAACTCCCATTTCAGCGATT 20 53
Lep-Lip-P
(서열번호 12)		 FAM SFCQ AAAGCCAGGACAAGCGCCG 19 61.4
5 Malaria Pan/ Pf/Pv 18s rRNA
(Pan)		 N118F
(서열번호 13)		 GGTATTGACCTAACATGGCTATGAC 25 55.2
N121R
(서열번호 14)		 CTGCTGCCTTCCTTAGATGTG 21 55.6
N119P
(서열번호 19)		 Cy5 BHQ2 TCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGA 23 63.5
Var gene
(Pf)		 N110F
(서열번호 15)		 CCCATACACAACCAAYTGGA 20 53.8
N111R
(서열번호 16)		 TTCGCACATATCTCTATGTCTATCT 25 53
N112P
(서열번호 20)		 FAM MGBNFQ TRTTCCATAAATGGT 15 37.9
Cox1
(Pv)		 PvMt_cox1_Fw
(서열번호 17)		 TTATATCCACCATTAAGTACATCACTT 27 52.1
PvMt_cox1_Rw
(서열번호 18)		 AACCTTTAGATCTTAGATGCATTACA 26 52.2
PvMt_cox1_probe
(서열번호 21)		 Texasred BHQ2 CCTGTTGCAGTAGATGTTATCATTG 25 54
6 Orientia tsutsugamushi 47kDa protein (htrA), L11697 OT-N255F
(서열번호 22)		 GCTGTATCTTCAACTATGCTTAATTC 26 52.3
OT-N256R
(서열번호 23)		 ACCACAAGGCTTTGATCATTA 21 52.2
OT-N257P
(서열번호 24)		 FAM BHQ1 TTGTTGCTCACTATCCTCACCTT 23 56.1
7 Rickettsia spp. omp R17K128F2
(서열번호 25)		 GGGCGGTATGAAYAAACAAG 20 52.8
R17K238R
(서열번호 26)		 CCTACACCTACTCCVACAAG 20 53.5
R17K202TaqP
(서열번호 27)		 FAM BHQ1 CCGAATTGAGAACCAAGTAATGC 23 54.4
8 Salmonella enterica InvA
(Invasion protein)		 Sal-new-F1
(서열번호 28)		 GCAGCCGCTCAGTATTGAGGAA 22 59.5
Sal-new-R1
(서열번호 29)		 ACRGTACGGTCTCTGTAGAGACTTTATC 28 57.8
Sal-new-P1
(서열번호 30)		 FAM BHQ1 ATCGCCAATCAGTCCTAACGACGA 24 60
9 Streptococcu s pneumoniae lytA S.pne-F1
(서열번호 31)		 CCATGAAGACAGGCTGGGTCAA 22 59.4
S.pne-R1
(서열번호 32)		 TWCCGTCTGGTTTGAGGTAGTA 22 54.9
S.pne-P1
(서열번호 33)		 FAM BHQ1 CCTGTTCCGTCYGCKGACTGGA 22 63.3
10 Crimean-Congo haemorrhagic fever virus segment S CCHF-S1-F
(서열번호 34)		 GCCGTTCRGGAATAGCACTTGT 22 58.8
CCHF-S1-R
(서열번호 35)		 TGTTATCATGCTGTCRGCACT 21 55.5
CCHF-S1-P
(서열번호 36)		 FAM SFCQ1 CAACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGAC 28 65.3
11 Chikungunya virus structural polyprotein CHIKV-F1
(서열번호 37)		 TYTCCGCTACGGCGATGTCA 20 60
CHIKV-R1
(서열번호 38)		 CGACACGCATAGYACCACGA 20 58.4
CHIKV-P1
(서열번호 39)		 FAM ZEN/lowablackFQ ACCAGTCCCACACCTCCCGT 20 63.3
12 Dengue virus 3' UTR N027F
(서열번호 40)		 TGGGARAGACCAGAGATCCTG 21 56.8
N030R
(서열번호 41)		 CCTGTTGATTCAACAGCACCATTC 24 56.7
N031R
(서열번호 42)		 CCTGTTGGATCAACAACACCAATC 24 56.5
N028P
(서열번호 43)		 FAM SFCQ1 CAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCC 26 64
N029P
(서열번호 44)		 FAM SFCQ1 CAACATCAATCCAGGCACAGAGCGCC 26 64
13 Hepatitis E ORF HepE-ORF-F
(서열번호 45)		 GGTGGTTTCTGGGGTGAC 18 55.9
HepE-ORF-R
(서열번호 46)		 AGGGGTTGGTTGGATGAA 18 53.8
HepE-ORF-P
(서열번호 47)		 FAM SFCQ1 TGATTCTCAGCCCTTCGC 18 55
14 Zika virus MR766
Non-structural proteins-3		 ZIKV-F1
(서열번호 48)		 ACTGGCTTGAAGCAAGAATGCT 22 57.5
ZIKV-P1
(서열번호 51)		 FAM SFCQ1 ACCTCCARGATGGCCTCATAGCCTC 25 62.9
ZIKV-P2
(서열번호 52)		 FAM SFCQ1 CARGATGGCCTCATAGCCTCGCTCTA 26 62.4
ZIKV-R21
(서열번호 49)		 CCTAAGCTTGAACTCTCCCTCAAT 24 56.4
ZIKV-R22
(서열번호 50)		 CCTCAGCTTRAACTCTCCCTCAAT 24 57.4
(F; forward primer, R; reverse primer, P; probe, Tm; 융해온도(melting temperature)
< 실시예 1> 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 민감도 평가
제조예 1에서 제작한 총 504종의 염기서열로 나타나는 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)의 분석적 민감도를 평가하기 위해 No. 1 내지 9의 게놈(Genomic) DNA와 No. 10 내지 14의 RNA 전사체(transcriptome)를 이용하여 최소 검출한계(limit of detection, LoD)를 확인하였다. 실험은 식품의약품안전처의 '체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인'에 따라 수행하였고, 최소 검출한계는 가이드라인의 정의대로 표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도로 계산하였다.
구체적으로, 게놈(Genomic) DNA의 검출시, 3ul의 생물학적 시료(Template)에 2x 마스터 믹스(Master mix) 5ul, 제1 내지 33의 프라이머 및 프로브 세트를 포함한 혼합용액 1ul 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1ul(표 2)를 혼합(표 3)하고, RNA 전사체(transcriptome)의 검출시, 3ul의 생물학적 시료(Template)에 2x 역전사 마스터 믹스(rt-Master mix) 5ul, 제34 내지 52의 프라이머 및 프로브 세트를 포함한 혼합용액 1ul 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1ul(표 2)를 혼합(표 3)하였다.
그리고, 하기 표 4에 기재된 반응 조건으로 본 출원의 PCR 장치를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하였다. 동일한 조건으로 반복실험을 수행하여 측정한 Ct(cycle threshold)값의 평균(average), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV), 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다.
Figure pat00001
합성된 프라이머가 상기 열성 질환들을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 표 1의 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 3에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 4에 나타난 바와 같이 50℃에서 5분 동안 역전사 단계(Reverse-transcription) 1 사이클을 수행하고, 95℃에서 8초 동안 예비 변성단계(Pre-denaturation) 1 사이클을 수행하며, 95℃에서 13초 동안 변성단계(Denaturation), 56℃에서 13초 동안 어닐링(Annealing) 및 연장단계(Extention)로 구성된 PCR 주기를 45 사이클을 수행하였다.
Figure pat00002
Figure pat00003
본 출원의 각각의 프라이머 및 프로브 세트가 나타내는 PCR 스크리닝 효율을 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00004
그 결과, 프라이머 및 프로브 세트가 100%의 검출률로 14가지 열성 질환 원인체들이 100 copies/rxn에서 검출될 수 있으며, 반응성 및 민감성이 높음을 확인할 수 있었다.
< 비교예 1> 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 민감도 평가
실시예 1에서 표 1의 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 표 3의 PCR 반응 혼합물의 조성으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 표 6에 나타난 바와 같이 50℃에서 5분 동안 역전사 단계(Reverse-transcription) 1 사이클을 수행하고, 95℃에서 8초 동안 예비 변성단계(Pre-denaturation) 1 사이클을 수행하며, 95℃에서 9초 동안 변성단계(Denaturation), 56℃에서 13초 동안 어닐링(Annealing) 및 연장단계(Extention)로 구성된 PCR 주기를 45 사이클을 수행하였다.
Figure pat00005
본 출원의 각각의 프라이머 및 프로브 세트가 나타내는 PCR 스크리닝 효율을 하기 표 7에 나타내었다.
Figure pat00006
변성단계 온도를 10초 미만인 9초로 한 경우 14종이 동시에 검출되지 않음을 확인할 수 있었다. 이상과 같이 실시예와 비교예가 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
<110> MiCo BioMed Co., Ltd. <120> PRIMER AND PROBE SETS FOR DETECTING SUBJECTS CAUSING FEBRILE DISEASE, KIT COMPRISING THE SAME AND DETECTING METHOD USING THE SAME <130> 19P0102 <160> 55 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ggctaaatna gtagttgcaa aygaca 26 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gcttctgttg ccaggtg 17 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 accccgctta aacctgcgac g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 ccggaagata tgcttcgatc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 caaggttgtt raaggagaac ag 22 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 tgctcatctg taaggcttcg tctgct 26 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 cgaattgtcg ttggactttc ttc 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gcgagcgtac taacgggaat c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 catccagcga cgcatcgggc 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 10 ccctanggat ctgtratcaa cta 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 gaactcccat ttcagcgatt 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 aaagccagga caagcgccg 19 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 ggtattgacc taacatggct atgac 25 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 ctgctgcctt ccttagatgt g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 cccatacaca accaaytgga 20 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 ttcgcacata tctctatgtc tatct 25 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 ttatatccac cattaagtac atcactt 27 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 aacctttaga tcttagatgc attaca 26 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 tcgattccgg agagggagcc tga 23 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 trttccataa atggt 15 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 cctgttgcag tagatgttat cattg 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 22 gctgtatctt caactatgct taattc 26 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 23 accacaaggc tttgatcatt a 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 ttgttgctca ctatcctcac ctt 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 gggcggtatg aayaaacaag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 cctacaccta ctccvacaag 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 ccgaattgag aaccaagtaa tgc 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 28 gcagccgctc agtattgagg aa 22 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 29 acrgtacggt ctctgtagag actttatc 28 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 30 atcgccaatc agtcctaacg acga 24 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 ccatgaagac aggctgggtc aa 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 32 twccgtctgg tttgaggtag ta 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 cctgttccgt cygckgactg ga 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 34 gccgttcrgg aatagcactt gt 22 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 35 tgttatcatg ctgtcrgcac t 21 <210> 36 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 36 caacaggcct tgccaagctt gcagagac 28 <210> 37 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 37 tytccgctac ggcgatgtca 20 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 38 cgacacgcat agyaccacga 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 39 accagtccca cacctcccgt 20 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 40 tgggaragac cagagatcct g 21 <210> 41 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 41 cctgttgatt caacagcacc attc 24 <210> 42 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 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Claims (9)

  1. a) 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 및
    b) 하기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 를 포함하고,
    상기 프라이머 및 프로브 세트는, 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 바르토넬라(Bartonella spp.)의 검출을 위한 제1 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 브루셀라(Brucella spp.) 검출을 위한 제2 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 7 내지 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 검출을 위한 제3 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 10 내지 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 렙토스피라(Leptospira spp.) 검출을 위한 제4 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트 및 서열번호 19 내지 21의 프로브 세트를 포함하는 말라리아(Malaria) 검출을 위한 제5 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 22 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi , OT) 검출을 위한 제6 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 25 내지 26의 프라이머 세트 및 서열번호 27의 프로브를 포함하는 리케치아(Rickettsia spp .) 검출을 위한 제7 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 28 내지 29의 프라이머 세트 및 서열번호 30의 프로브를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출을 위한 제8 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 31 내지 32의 프라이머 세트 및 서열번호 33의 프로브를 포함하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 검출을 위한 제9 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 34 내지 35의 프라이머 세트 및 서열번호 36의 프로브를 포함하는 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) 검출을 위한 제10 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 37 내지 38의 프라이머 세트 및 서열번호 39의 프로브를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출을 위한 제11 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 40 내지 42의 프라이머 세트 및 서열번호 43 내지 44의 프로브 세트를 포함하는 뎅기 바이러스(Dengue virus) 검출을 위한 제12 프라이머 및 프로브 세트, 서열번호 45 내지 46의 프라이머 세트 및 서열번호 47의 프로브를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 검출을 위한 제13 프라이머 및 프로브 세트, 및 서열번호 48 내지 50의 프라이머 세트 및 서열번호 51 내지 52의 프로브 세트를 포함하는 지카 바이러스(Zika virus) 검출을 위한 제14 프라이머 및 프로브 세트이고,
    상기 추출한 핵산이 RNA인 경우, 역전사 반응을 통해 주형 DNA를 합성하는 단계를 더 포함하고,
    상기 역전사 반응 및 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 동시 또는 순차적으로 진행되며,
    상기 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 2종 이상의 열성 질환 원인체의 존재 또는 부존재를 동시에 검출하는, 열성 질환 원인체 동시 검출 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 실시간 중합효소연쇄반응 중 변성 단계의 시간이 10초에서 20초인 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 동시 검출 방법.
  3. 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 바르토넬라(Bartonella spp.) 검출을 위한 제1 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 브루셀라(Brucella spp.) 검출을 위한 제2 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 7 내지 8의 프라이머 세트 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 검출을 위한 제3 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 10 내지 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 렙토스피라(Leptospira spp.) 검출을 위한 제4 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트 및 서열번호 19 내지 21의 프로브 세트를 포함하는 말라리아(Malaria) 검출을 위한 제5 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 22 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 쯔쯔가무시증(Orientia Tsutsugamushi, OT) 검출을 위한 제6 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 25 내지 26의 프라이머 세트 및 서열번호 27의 프로브를 포함하는 리케치아(Rickettsia spp.) 검출을 위한 제7 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 28 내지 29의 프라이머 세트 및 서열번호 30의 프로브를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출을 위한 제8 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 31 내지 32의 프라이머 세트 및 서열번호 33의 프로브를 포함하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 검출을 위한 제9 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 34 내지 35의 프라이머 세트 및 서열번호 36의 프로브를 포함하는 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus) 검출을 위한 제10 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 37 내지 38의 프라이머 세트 및 서열번호 39의 프로브를 포함하는 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 검출을 위한 제11 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 40 내지 42의 프라이머 세트 및 서열번호 43 내지 44의 프로브 세트를 포함하는 뎅기 바이러스(Dengue virus) 검출을 위한 제12 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 45 내지 46의 프라이머 세트 및 서열번호 47의 프로브를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 검출을 위한 제13 프라이머 및 프로브 세트; 및
    서열번호 48 내지 50의 프라이머 세트 및 서열번호 51 내지 52의 프로브 세트를 포함하는 지카 바이러스(Zika virus) 검출을 위한 제14 프라이머 및 프로브 세트;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  4. 청구항 3에 있어서
    상기 프로브의 5'말단은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texasred), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광물질로 표지 되며,
    상기 프로브의 3'-말단은 BHQ-1(Black hole quencher 1), BHQ-2(Black hole quencher 2), BHQ-3(Black hole quencher 3), SFCQ, SFCQ1, MGBNFQ(Minor groove binding non-fluorescent quencher), ZEN/lowablackFQ, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광 억제 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 제5 프라이머 및 프로브 세트는,
    서열번호 13 내지 14 및 19의 염기서열을 포함하는 18s rRNA에 특이적인
    말라리아 전염병(malaria pandemics, Pan)을 유발하는 열대열원충(Plasmodium falciparum), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi), 3일열원충(Plasma vivax), 난형열원충(plasmodium ovale) 및 4일열원충(plasma malariae) 중 어느 하나 이상의 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
    서열번호 15 내지 16 및 20의 염기서열을 포함하는 유전자 Var에 특이적인 열대열원충(Plasmodium falciparum, Pf) 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및
    서열번호 17 내지 18 및 21의 염기서열을 포함하는 유전자 Cox1에 특이적인 삼일열원충(Plasmodium vivax, Pv) 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
    인 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트는 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트인 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  7. 청구항 3에 있어서,
    상기 제1 내지 14 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 10 내지 100 copies/rxn인 것을 특징으로 하는 열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  8. 청구항 3 내지 7 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 조성물.
  9. 청구항 3 내지 7 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 열성 질환 원인체 동시 검출용 키트.
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