KR101918140B1

KR101918140B1 - 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 항생제 내성균 판별 방법

Info

Publication number: KR101918140B1
Application number: KR1020180068300A
Authority: KR
Inventors: 김명석; 원경미; 도정완; 이덕찬; 한현자; 김나영; 조미영; 정승희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2018-11-16

Abstract

본 발명은 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 퀴놀론계 항생제 내성균 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 마커를 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 PNA를 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 퀴놀론계 항생제 내성균을 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 유무를 간단·신속·정확하게 판별할 수 있으므로, 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균이 유발하는 수산생물전염병인 비브리오병, 연쇄구균병 또는 에드워드병으로 인해 생기는 피해를 축소시키는데 유용하다.

Description

퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 항생제 내성균 판별 방법{PNA Probe for Discrimination of Quinolone Antibiotic Resistant Bacteria and Method for Discrimination of Antibiotic Resistant Bacteria Using the Same}

본 발명은 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브 및 퀴놀론계 항생제 내성균 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비브리오균, 연쇄구균 및 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 유무 판별을 위한 PNA 프로브와 이를 이용한 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 조성물, 키트 및 판별 방법에 관한 것이다.

우리나라의 넙치 양식 산업은 1980년대 초 생산 기술의 확립과 육상양식 방법이 개발됨에 따라 급격한 발전을 거듭하여 2011년에는 우리나라 어류 양식 생산량의 약 56%에 달하는 40,805 M/T의 생산고를 기록하는 등 우리나라의 대표적인 양식 산업으로 자리매김하고 있다 (Statistics Korea, 2011).

넙치 양식 산업에서도 타 어종과 마찬가지로 생존율이 경제성을 결정짓는 가장 큰 요인이다. 2000년대 후반으로 접어들면서 넙치 양식은 양적 생산을 위한 밀식, 양식장 부영양화, 수질환경 악화, 사료의 질 저하, 불량종묘를 포함한 종묘수급문제, 양식장 관리부족 등으로 양식 환경이 악화되고 있다. 2012년 전국적으로 5~10월 사이에 총 폐사 피해율은 27.18%로 집계되었고, 이 중 감염성 질병에 의한 폐사율은 22.64%, 고의적 또는 비감염성 원인에 의한 피해는 4.53%로 집계되었다. 피해 원인은 스쿠티카병 35.9%, 비감염성 원인에 의한 폐사 19.6%, 연쇄구균병 12.8%, 바이러스성 출혈성패혈증 9.2%, 고의적 폐사 피해 6.9%, 비브리오병 6.7%, 활주세균병 2.9%, 백점병 2.8%, 에드워드병 2.1%의 순으로 나타났다.

세균성 감염으로 인한 피해는 증가하고 있으며, 이를 예방하기 위해 항균 항생제의 사용량도 증가하고 있는 추세이다. 항생제는 축산이나 수산업에 있어서 질병에 대하여 예방의 차원 또는 성장촉진을 위해서 사용되거나 치료를 목적으로 빈번히 사용되어 왔다. 그러나 항생제의 과다사용으로 인하여 항생제에 내성을 가진 항생제 내성균의 발생이 증가하고 있을 뿐만 아니라, 상기 항생제 내성균은 축수산 식품을 통하여 사람에게 전파될 수 있으므로 항생제 내성균의 지속적인 검사가 요구되고 있다. 항생제 내성균은 신종 감염 질병류의 발병 위협과 함께 세계적으로 증가하고 있으며, 항생제 내성균의 빠른 확산은 세계 여러 나라의 큰 문제로 부상하고 있다.

항생제 내성균을 검사하기 위한 방법으로 MIC(minimal inhibitory concentration, 최저생육저지농도)를 측정하거나, 원판 확산법(Disc diffusion)을 이용하여 항생제 내성균의 표현형(phenotype)을 관찰하는 방법 등이 사용되고 있다. 그러나 상기 검사 방법은 시료의 양이 증가함에 따라 검사에 소요되는 시간이 산술적으로 증가하는 경향이 있어, 많은 시료를 검사하는 경우 결과를 얻기까지 많은 시간이 필요하다. 또한, 주관적 판단이 필요할 개연성을 가지고 있으며, 검사 기관에 따른 오차 발생이 가능하다.

이에, 본 발명자들은 넙치 주요 감염성 질병인 비브리오병, 연쇄구균병 또는 에드워드병을 일으키는 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 판별 방법의 개발을 위해 예의 연구 노력한 결과, 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 유전자를 정보를 확인하고, 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머 쌍을 이용하여 신속하고 정확하게 항생제 내성 유무를 판별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 이용한 퀴놀론계 항생제 내성균 판별 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, SNP(Single nucleotide polymorphism, 단일염기다형성)를 포함하는 gyrA, gyrB 및 parC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 표적 핵산에 포함된 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 마커 염기서열을 주형으로 SNP를 포함하는 gyrA, gyrB 및 parC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키고, 상기 증폭된 유전자 마커 염기서열에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 퀴놀론계 항생제 내성 유무를 판별하는 단계를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 수산생물전염병의 주요 원인 세균인 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균의 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 마커를 선정하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 온도별 융해곡선을 통해 퀴놀론계 항생제 내성 유무를 간단·신속·정확하게 판별할 수 있다. 따라서, 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균이 유발하는 비브리오병, 연쇄구균병 또는 에드워드병으로 인해 생기는 피해를 축소시키는데 유용하다.

도 1은 PNA 프로브의 구조적 특징을 나타낸 모식도이다.
도 2는 항생제 내성균 판별에 있어, 펩티드핵산을 이용한 혼성화 단계와 융해곡선을 얻는 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3 내지 도 9는 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 일부와 SNP 및 이로부터 도출된 펩티드핵산의 염기서열을 나타내는 염기서열도이다.
도 10 내지 도 12는 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 증폭 산물 상에서 펩티드핵산이 포함하고 있는 주요 염기변이 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 13은 항생제 내성균 판별을 위한 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 반응조건을 나타낸 것이다.
도 14는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 펩티드핵산 프로브 및 프라이머를 이용하여 얻은 S. parauberis , E. tarda 및 V. harveyi의증폭곡선 그래프이다.
도 15는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 펩티드핵산 프로브 및 프라이머를 이용하여 얻은 S. parauberis , E. tarda 및 V. harveyi의 증폭곡선 및 융해곡선 그래프이다.
도 16 내지 도 18은 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 펩티드핵산 프로브 및 프라이머를 이용하여 얻은 S. parauberis , E. tarda 및 V. harveyi의 온도별 융해곡선 그래프이다.
도 19는 융해 온도별 스코어 표로, Tm값을 기준으로 스코어 표와 비교하여 항생제 내성 여부를 판별할 수 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 비브리오균, 연쇄구균 또는 에드워드균 시료를 이용하여 퀴놀론계 항생제 내성을 가지게 하는 유전자 마커를 선별하였으며, 상기 유전자 마커에 대응되는 프라이머 쌍 및 PNA 프로브를 이용하여 퀴놀론계 항생제 내성균을 판별할 수 있었다. 더욱 상세하게는, 퀴놀론계 항생제 내성 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열 중 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 유전자 마커를 표적으로 선정하고, 상기 유전자 마커에 대응되는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 프라이머 쌍 및 PNA 프로브를 이용하여 퀴놀론계 항생제에 내성을 갖는 세균을 검출하고 판별할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.

PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Morpholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. 또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10 내지 15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 세균 종에 따른 특정 염기서열(예컨대, SNP)이 포함되도록 12 내지 18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이가 나타날 경우 염기서열의 변이와 일치시킬 수 없지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 염기 위치에 따른 Tm 값의 차이가 뚜렷하여 분석이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 퀴놀론계 항생제 내성균은 비브리오균(Vibrio harveyi), 연쇄구균(Streptococcus parauberis) 또는 에드워드균(Edwardsiella tarda)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, V. harveyi 분리균주의 퀴놀론계 항생제에 대한 MIC 값과 gyrA 유전자의 point mutation의 연관성을 조사하였다. 옥소린산과 플루메퀸에 내성을 갖는 V. harveyi FP4541의 gyrA 유전자에서 248번째 염기서열이 G에서 T로 변환되었고, gyrA 단백질의 83번째 아미노산은 Serine에서 Isoleucine으로 바뀌었다. V. harveyi의 퀴놀론 내성 결정 부위(quinolone resistance-determing region, QRDR)는 보고되어 있지 않지만, 본 실시예에 의하면, 퀴놀론계 항생제에 내성을 갖는 V. vulnificus와 Photobacterium damselae subsp . piscicida의 QRDR과 동일하여 gyrA 유전자의 248번째 염기가 V. harveyi의 QRDR로 추정된다(표 4).

본 발명의 일 실시예에서, S. parauberis는 241번째 염기가 C에서 T로 변이하여 81번째 아미노산이 Serine에서 Leucine으로 변하였고, parC와 parE 유전자에서 퀴놀론 내성 결정 부위(quinolone resistance-determing region, QRDR)로 보고된 부위에서 point mutation이 관찰되지 않았다(표 2).

본 발명의 일 실시예에서, E. tarda 분리 균주는 gyrA 유전자에서 249번째 염기가 A에서 G로 변환되어 gyrA 단백질의 83번째 아미노산이 Serine에서 Arginine으로 바뀌었고, 가장 높은 MIC 값을 갖는 FP3139 균주는 248번째 염기가 G에서 T로 변환되어 83번째 아미노산이 Isoleucine으로 바뀌었다. FP3139 균주의 parC 유전자에서 263번째 염기가 A에서 G로 바뀜으로 인해 parC 단백질의 88번째 아미노산이 Glutamic acid에서 Glycine으로 바뀌었는데 이 부위는 퀴놀론 내성 결정 부위(quinolone resistance-determing region, QRDR)로 보고되어 있지 않으나, MIC 값이 높은 FP3139에서만 확인되었기 때문에 E. tarda의 새로운 QRDR일 가능성이 높다. gyrB와 parC 유전자에서 QRDR로 보고된 부위에서 point mutation은 관찰되지 않았다(표 3).

본 발명은 다른 관점에서, SNP(Single nucleotide polymorphism, 단일염기다형성)를 포함하는 gyrA, gyrB 및 parC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 10 및 11의 염기서열쌍, 서열번호 12 및 13의 염기서열쌍, 서열번호 14 및 15의 염기서열쌍, 서열번호 16 및 17의 염기서열쌍, 서열번호 18 및 19의 염기서열쌍, 서열번호 20 및 21의 염기서열쌍 및 서열번호 22 및 23의 염기서열쌍으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열쌍으로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, SNP를 포함하는 gyrA, gyrB 및 parC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 특정 반응에서 사용되는 상기 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 세균의 퀴놀론계 항생제 내성 유무의 판별이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 표적 핵산에 포함된 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 마커 염기서열을 주형으로 SNP를 포함하는 gyrA, gyrB 및 parC로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키고, 상기 증폭된 유전자 마커 염기서열에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 퀴놀론계 항생제 내성 유무를 판별하는 단계를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 '검체 시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 비브리오균(V. harveyi), 연쇄구균(S. parauberis) 또는 에드워드균(E. tarda)과 혼합된 시료이거나 상기 세균에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '표적 핵산'은 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(SNP 포함)을 의미하며, 생리·생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 표적 유전자의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명에 있어서, 상기 '증폭'은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Real-Time PCR 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열의 유무로 항생제 내성균의 판별이 가능하게 한다.

PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 쌍 및 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법으로 사용 가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5 내지 1℃씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화(hybridization)는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.

상기 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, SNP뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.

PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe) 등이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '융해곡선 분석'은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법에 의한다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 Target하는 염기서열이 없거나 변이가 있다고 판단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선 분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 결과를 최적화하기 위한 기술적 방법으로는 Liquid type U-TOP 방법(시선바이오머티리얼스, 한국)으로, 표적 핵산의 단일 염기서열의 치환 및 염기의 결실 또는 삽입을 효과적으로 검출할 수 있는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 PNA 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법을 활용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 최소억제농도( MIC ) 측정을 통한 항생제 내성균의 선별 및 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 분석

국립수산과학원에서 보관 중인 연쇄구균(S. parauberis ), 에드워드균(E. tarda), 비브리오균(V. harveyi ) 시료를 이용하여 MIC 값을 측정하였다. 각 균주별로 이용된 항생제는 표 1에 나타내었다.

퀴놀론계 항생제 내성균 판별을 위한 항생제 종류

bacteria species	항생제
S. parauberis	Cipfloxacin
E. tarda	Oxolinic acid, Flumequine, Cipfloxacin
V. harveyi	Oxolinic acid, Flumequine

S. parauberis는 241번째 염기가 C에서 T로 변이하여 81번째 아미노산이 Serine에서 Leucine으로 변하였고, parC와 parE 유전자에서 퀴놀론 내성 결정 부위(quinolone resistance-determing region, QRDR)로 보고된 부위에서 point mutation이 관찰되지 않았다(표 2).

Ciprofloxacin에 대한 MIC와 S. parauberis gyrA, parC, parE 유전자에서 point mutation 비교

Strain	MIC(ug/ml)	gyrA		parC		parE
Strain	Cipfloxacin	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid
FP5227	0.06	TCA	Ser⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹
FP3059	0.13	TCA	Ser⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹
FP4031	0.25	TCA	Ser⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹
FP4029	0.5	TCA	Ser⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹
FP3227	1	TCA	Ser⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹
FPa4533	2	TTA	Leu⁸¹	GAA	Glu⁷⁹	CGT	Arg⁴⁴⁹

E. tarda 분리균주는 gyrA 유전자에서 249번째 염기가 A에서 G로 변환되어 gyrA 단백질의 83번째 아미노산이 Serine에서 Arginine으로 바뀌었고, 가장 높은 MIC 값을 갖는 FP3139 균주는 248번째 염기가 G에서 T로 변환되어 83번째 아미노산이 Isoleucine으로 바뀌었다. gyrB와 parC 유전자에서 QRDR로 보고된 부위에서 point mutation은 관찰되지 않았다(표 3).

퀴놀론계 항생제에 대한 MIC와 E. tarda gyrA, gyrB, parC 유전자에서 point mutation 비교

Strain	MIC(ug/ml)			gyrA				gyrB		parC
Strain	Oxolinic acid	Flumequine	Cipfloxacin	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid	Nucleotide	Amino acid
FP2240	<0.25	1	<0.06	Asp⁸⁷	GAC	Ser⁸³	AGC	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FP2074	4	8	0.13	Asp⁸⁷	GAC	Asp⁸³	AGA	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FP3071	8	16	0.25	Asp⁸⁷	GAC	Asp⁸³	AGA	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FP2243	16	32	0.5	Asp⁸⁷	GAC	Asp⁸³	AGA	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FP2130	64	64	1	Asp⁸⁷	GAC	Asp⁸³	AGA	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FPa4445	8	32	2	Asp⁸⁷	GAC	Asp⁸³	AGA	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC
FP3139	256	≥512	4	Asp⁸⁷	GAC	Ile⁸³	ATC	Ser⁴⁶⁴	TCG	Ser⁸⁴	AGC

V. harveyi 분리균주의 퀴놀론계 항생제에 대한 MIC 값과 gyrA 유전자의 point mutation의 연관성을 조사하였다. 옥소린산과 플루메퀸에 내성을 갖는 V. harveyi FP4541의 gyrA 유전자에서 248번째 염기서열이 G에서 T로 변환되었고, gyrA 단백질의 83번째 아미노산은 Serine에서 Isoleucine으로 바뀌었다. V. harveyi의 QRDR은 보고되어 있지 않지만, 본 실시예에 의하면, 퀴놀론계 항생제에 내성을 갖는 V. vulnificus와 Photobacterium damselae subsp . piscicida의 QRDR과 동일하여 gyrA 유전자의 248번째 염기가 V. harveyi의 QRDR로 추정된다(표 4).

퀴놀론계 항생제에 대한 MIC와 V. harveyi gyrA 유전자에서 point mutation 비교

Strain	MIC(ug/ml)		gyrA
Strain	Oxolinic acid	Flumequine	Nucleotide	Amino acid
FP3023	1	1	AGT	Ser⁸³
FP3031	1	2	AGT	Ser⁸³
FP3457	2	2	AGT	Ser⁸³
FP7021	1	1	AGT	Ser⁸³
FP8045	1	2	AGT	Ser⁸³
FP4541	8	16	ATT	Ile⁸³

실시예 2: 퀴놀론 내성균 판별을 위한 PNA 프로브 및 프라이머 제작

상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 총 9개의 퀴놀론계 항생제 내성을 가지게 하는 유전자를 선별하였다(도 3 내지 도 9). 도 3 내지 도 9는 각 유전자의 염기서열을 나타내기 위한 유전자 위치도이고, PNA 프로브 염기서열은 노란색 음영으로 나타냈으며, 프라이머 염기서열은 파란색 볼드체로 표기하였다.

도 10 내지 도 12는 본 발명에 따른 세균 유전자상에서 PNA 프로브를 포함 하고 있는 퀴놀론계 항생제 내성을 얻게 되는 염기변이 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다. 각 염기 번호는 protein으로 발현할 수 있는 유전자의 PCR product size를 기준으로 작성하였다.

수집한 자료를 분석하여 퀴놀론계 항생제 내성을 가지게 하는 유전자를 선별하였으며, 총 9개의 내성 유전자를 진단하기 위해 PNA 프로브를 디자인 하였고(표 5), 이를 증폭시키기 위한 염기쌍도 제조하였다(표 6).

퀴놀론계 PNA probe 염기서열 정보

서열번호	Probe name	PNA probe Sequence (5'->3')	Target gene
1	V.harveyi GyrA_Ile⁸³	Dabcyl-ACGGTGATATTGCTGT-O-K(Cy5)	V. harveyi GyrA _ Ile ⁸³
2	S.parauberis GyrA_Ser⁸¹	Dabcyl-GGCGATTCATTAATTTATG-O-K(FAM)	S. parauberis GyrA _ Ser ⁸¹
3	S.parauberis ParC_Gln⁷⁹	Dabcyl-TTACAAGTTCAAGCAG-O-K(HEX)	S. parauberis ParC _ Gln ⁷⁹
4	S.Parauberis ParE_Ser⁴⁴⁹	Dabcyl-GTCGTGATAGTAAGTTCC-O-K(TxR)	S. Parauberis ParE _ Ser ⁴⁴⁹
5	E.tarda GyrB_Leu⁴⁶⁴	Dabcyl-GCTCTCCTTGCAGG-O-K(HEX)	E. tarda GyrB _ Leu ⁴⁶⁴
6	E.tarda ParC_Gly⁸⁸	Dabcyl-TGCTATGGGGCGAT-O-K(TxR)	E. tarda ParC _ Gly ⁸⁸
7	E.tarda GyrA_Ser⁸³	Dabcyl-TGACAGCGCGGTT-O-K(FAM)	E. tarda GyrA _ Ser ⁸³
8	E.tarda ParC_Ile⁸⁴	Dabcyl-GCGACATCGCCTG-O-K(HEX)	E. tarda ParC _ Ile ⁸⁴
9	E.tarda GyrA_Asp⁸⁷	Dabcyl-CGGTTTATGACACTATCG-O-K(TxR)	E. tarda GyrA _ Asp ⁸⁷

primer 염기서열 정보

bacteria species	서열번호	name	Sequence (5'->3')	PCR product size
V. harveyi	10	gyrA_F	CTTCCAGATGTGCGTGATG	197
V. harveyi	11	gyrA_R	CGAAGTGAGAACGGCTGAG	197
S. parauberis	12	gyrA_F	AGTGTAATCGTGGCCAGAGC	272
	13	gyrA_R	CACCGTCACCATCCATAG	272
	14	parC_F	CGTGATTTGATTACAATGTTG	203
	15	parC_R	CCACTACGGGTTACACTTAC	203
	16	parE_F	CGGCAAGAAGAACAAGAAGG	340
	17	parE_R	ATATGGGCACCATCGGTATC	340
E. tarda	18	gyrA_F	CTGGGCAATGACTGGAAC	211
	19	gyrA_R	GCCATGCGCACTTCGGT	211
	20	gyrB_F	CGTAACCGTAAGAATCAGGC	170
	21	gyrB_R	CTGTGGTAGCGCAGCTTATC	170
	22	parC_F	GTGTATGCGATGTCTGAGCT	158
	23	parC_R	GGATAGCGATAGGAGAAGG	158

Real-time PCR 장비가 한 번에 검출할 수 있는 형광이 제한적이라, 세 개의 tube에 나누어 진단에 사용하였고, tube당 각기 다른 형광이 달린 펩티드핵산을 포함시켰다. Set 1의 경우 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4가 포함되며, Set 2의 경우 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7이 포함되고, Set 3의 경우 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 9가 포함되어 있다.

Primer도 Set 별로 나눠서 사용하였다. Set 1의 경우 서열번호 12 내지 17까지 사용하고, Set 2의 경우 서열번호 18 내지 23까지 사용하며, Set 3의 경우 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 23을 사용하였다.

본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다(표적 핵산과의 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다).

실시예 3: 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 PNA 프로브를 이용한 증폭곡선 및 융해곡선의 도출

실시예 2의 PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여 S. parauberis , E. tarda , V. harveyi의 DNA 샘플에 대하여 증폭곡선 및 융해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 퀴놀론계 항생제 내성균을 판별하고자 하였다.

세균으로부터 DNA를 추출하여 실험에 사용하였으며, DNA 추출은 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen사, 미국)를 이용하였다. 증폭반응은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였다. Set 별로 동시 진행하여 세 개의 튜브에 동시 제조하여 실험에 사용하였다. PCR용 반응물의 조성은 다음과 같다; 2X qPCR PreMix buffer(enzynomics사, 한국) 10㎕, forward primer(each forward primer) 2 pmol 0.5㎕ 및 reverse primer(each reverse primer) 20 pmol 0.5㎕, DNA시료 1㎕, 2.5 pmol 펩티드핵산 each 0.5㎕, 20X SSB buffer (시선바이오머티리얼스, 한국) 및 증류수로 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다.

도 13은 퀴놀론계 항생제 내성균의 판별을 위한 real-time PCR의 반응조건을 도시한 것으로, 퀴놀론계 항생제 내성 유전자를 증폭 및 혼성화시키고, 상기 혼성화 산물의 온도를 높이는 과정을 그래프로 나타내었다. 여기서, real-time PCR 과정은 다음과 같다. 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 45초(형광 촬영), 72℃에서 45초 동안 반응시켰으며, 이를 45 cycle 반복하면서 증폭곡선을 얻었다. 그 이후 PNA 프로브와의 혼성화 및 융해곡선을 얻기 위하여 95℃에서 5분, 75℃에서 1분, 55℃에서 1분, 45℃에서 1분의 시간을 준 뒤 40℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시키며 5초간 정지 상태를 유지하며 형광을 측정하여 융해곡선 분석을 수행한다.

증폭곡선의 결과를 도 14에 나타내었다. 유전자 증폭이 되고 있는지 여부를 확인할 수 있으며, 형광별로 sample이 증폭되고 있는 것을 확인할 수 있다. 실시예 3에 따른 Set 1, 2 및 3에 따른 증폭곡선 및 융해곡선 그래프는 도 15에 나타내었다.

도 16은 연쇄구균 시료별 온도별 융해곡선 그래프로서, Set 1 조합에 대한 결과이다. 기타 시료란, 에드워드균과 비브리오균 시료를 의미한다. 도 17은 에드워드균 시료별 온도별 융해곡선 그래프로서, Set 2 조합에 대한 결과이다. 기타 시료란, 연쇄구균과 비브리오균 시료를 의미한다. 도 18은 에드워드균과 비브리오균 시료별 온도별 융해곡선 그래프로서, Set 3 조합에 대한 결과이다. 기타 시료란 연쇄구균을 의미한다.

실시예 4: 융해형광 및 온도별 스코어에 따른 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 판별 방법

본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 퀴놀론계 항생제 내성 유전자를 판별하고자 하는 경우 융해 온도별 스코어 표를 미리 만들어 놓고, 이를 활용하는 것이 가능하다.

상기 실시예 3에서와 같이 융해곡선 분석을 수행한 다음, 도출한 형광 signal 및 Tm값을 상보성이 완전한 때(perfect match)의 온도에 맞추어 디지털화하였다(도 19). 즉, perfect match 온도의 ±2℃ 범위를 만들고, 세균 DNA 샘플에 대한 Tm값이 상기 범위 안에 들면 해당 유전자를 가지고 있고, 퀴놀론계 항생제 내성을 가지는 것으로 판별할 수 있다

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> PNA Probe for Discrimination of Quinolone Antibiotic Resistant Bacteria and Method for Discrimination of Antibiotic Resistant Bacteria Using the Same <130> P18-B133 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 acggtgatat tgctgt 16 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 ggcgattcat taatttatg 19 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 ttacaagttc aagcag 16 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 gtcgtgatag taagttcc 18 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 gctctccttg cagg 14 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 tgctatgggg cgat 14 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 tgacagcgcg gtt 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 gcgacatcgc ctg 13 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 cggtttatga cactatcg 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cttccagatg tgcgtgatg 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgaagtgaga acggctgag 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agtgtaatcg tggccagagc 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caccgtcacc atccatag 18 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgtgatttga ttacaatgtt g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccactacggg ttacacttac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cggcaagaag aacaagaagg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atatgggcac catcggtatc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctgggcaatg actggaac 18 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gccatgcgca cttcggt 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgtaaccgta agaatcaggc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctgtggtagc gcagcttatc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtgtatgcga tgtctgagct 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggatagcgat aggagaagg 19

Claims

퀴놀론계 항생제에 대해 내성을 보이는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 판별을 위한 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브.
제1항에 있어서, 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher) 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
gyrA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 제1항의 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 12 및 13의 염기서열쌍으로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
gyrA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 제1항의 PNA 프로브를 포함하는 퀴놀론계 항생제 내성균 판별용 키트.
제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 12 및 13의 염기서열쌍으로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 키트.
다음 단계를 포함하는 퀴놀론계 항생제에 대해 내성을 보이는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 판별 방법:
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 마커 염기서열을 주형으로 gyrA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키고, 상기 증폭된 유전자 마커 염기서열에 제1항의 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 퀴놀론계 항생제 내성 유무를 판별하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 12 및 13의 염기서열쌍으로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.