TWI659106B - 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法 - Google Patents

檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI659106B
TWI659106B TW106134725A TW106134725A TWI659106B TW I659106 B TWI659106 B TW I659106B TW 106134725 A TW106134725 A TW 106134725A TW 106134725 A TW106134725 A TW 106134725A TW I659106 B TWI659106 B TW I659106B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sequence
virus genotype
yellow head
identification number
head virus
Prior art date
Application number
TW106134725A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201814053A (zh
Inventor
趙眉英
朴明愛
池寶榮
黃晟敦
韓賢子
金明石
鄭丞姬
Original Assignee
大韓民國國立水産科學院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大韓民國國立水産科學院 filed Critical 大韓民國國立水産科學院
Publication of TW201814053A publication Critical patent/TW201814053A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI659106B publication Critical patent/TWI659106B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明涉及一種檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記和使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法，更具體地說涉及一種用於擴增黃頭病毒基因一型(YHV1)特異性核酸的方法，雜合肽核酸(PNA)特異性識別擴增產物，根據溫度控制雜合產物的溫度以獲得一熔解曲線，然後檢測黃頭病毒基因一型或藉由分析熔解曲線並確認熔解溫度來識別蝦是否感染病毒。根據本發明，可以通過簡單、快速和準確檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)在早期阻斷被認為是對養殖蝦的最大威脅的黃頭病毒基因一型(YHV1)的感染和由該病毒引起的黃頭病的傳染。

Description

檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
本發明關於一種用於檢測黃頭病毒基因一型(yellow head virus genotype 1，YHV1)的遺傳標記和檢測黃頭病毒基因一型的方法，更具體地說，涉及一種擴增黃頭病毒基因一型的特異性核酸(specific nucleic acid)的方法，雜合肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)特異性識別擴增產物，根據溫度控制雜合產物的溫度獲得一熔解曲線，然後檢測黃頭病毒基因一型或者藉由分析熔解曲線並確認熔解溫度來識別蝦是否感染病毒。
蝦佔全球貿易量的17%，75%的蝦是由水產養殖生產的(糧農組織，2009年)。雖然全球蝦養殖業大幅成長，但因為疾病爆發造成蝦類的損失也在持續增加。事實上，自1994年以來，病毒性疾病造成的蝦的損失估計每年約為30億美元以上。
尤其是近年來，由於新疾病和病毒性疾病造成的損害不僅在亞洲，在世界各地也都有所增加，導致蝦的水產養殖產量大幅下降等嚴重的問題(Walker and Mohan,2009；Tran et al.,2013)，各個國家保護水產養殖業和水生生態系統的檢疫和消毒日益增加。
黃頭病毒基因一型(yellow head virus genotype 1，YHV1)是導致黃頭病(yellow head disease，YHD)的病毒之一，這是一種由世界動物衛生組織和水生動物疾病控制法規定的蝦病，是一種會產生連鎖反應的傳染病。
黃頭病毒基因一型和其他包含在病毒黃頭症候群中的基因型被 國際分類病毒委員會(International committee on taxonomy viruses)分類為屬於諾迪卡雷爾氏病(genus okavirus)的桿狀套病毒科(family roniviridae)中屬於野生型屬的單一物種(鰓相關病毒)，黃頭病毒基因一型被稱為是黃頭症候群的八種基因型之一，是已知引起黃頭病的一種獨特病原體。
黃頭病毒基因一型在被稱為水產養殖蝦(Penaeus Japonicus)的蝦類物種中具有很高的傳染性，據報導，草蝦(Penaeus monodon)(即黑虎蝦)和白蝦(Peneus setiferus)(水產養殖蝦的一種)是自然的感染了YHV1。
感染了YHV1的蝦的症狀如下：i)在預定時間內，蝦的飼料的消耗量顯著增加，但突然之間，蝦不再吃食物，導致死亡率上升，ii)發現處於昏昏欲睡狀態或死亡狀態的蝦在水面，以及在邊緣發現緩慢且不規則地游泳的蝦，iii)在蝦的胸部下方有明亮的黃色，使得蝦的頭孢菌素呈黃色，以及肝臟和胰腺變得異常柔軟，iv)蝦的整體顏色異常的亮或是脫色。
目前，在黃頭病毒基因一型(YHV1)的診斷方法中，開發了使用分子診斷的診斷方法和試劑盒等，以及進行一般聚合酶連鎖反應(General polymerase chain reaction，PCR)法的方法，然後藉由使用螢光探針(fluorescent probe)或SYBR Green，確認使用電泳的反應的擴增產物或通過即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法等確認擴增產物。
尤其是為了診斷黃頭病毒基因一型(YHV1)，在進行一般常規的PCR或巢式即時RT-PCR(Nest RT-PCR)方法後，然後根據世界動物衛生組織(OIE)的水生動物衛生法典，藉由電泳確認PCR擴增產物，進行克隆擴增產物並再次使用桑格(Sanger)測序法等確認純化質粒DNA的鹼基序列的方法。因此這程序因複雜而存在分析診斷疾病需要很長時間的缺點。
此外，根據OIE的標準使用電泳確認PCR擴增產物時，不可能進行客觀分析的PCR擴增產物(灰色區域)或不明確的PCR擴增產物進行使用克隆載體並重新確認擴增產物的鹼基序列等的克隆驗證步驟。該驗證步驟是確認和驗證非特定PCR頻帶的序列的步驟，其分析過程複雜並且耗時。特別是在通 過常規PCR方法(序列確定之前)確認擴增產物為陽性的情況下，這種情況對應於存在感染水生動物傳染病的風險的情況，進行預防流行病；當擴增產物隨後通過測序確定為假陽性時，檢驗機構的可靠性可能惡化，漁民可能遭受損失。因此，迫切需要一個改進方法用來快速準確地診斷指定的法定傳染病。
針對這一技術背景，本發明人發現，藉由用來識別和/或檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記，可簡單、快速、準確地識別黃頭病毒基因一型(YHV1)，使用遺傳標記特異性的肽核酸和引子(primer)進行擴增，得到熔解曲線(melting curve)，從而證實了本發明。
本發明的目的是為了提供用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記和肽核酸(PNA)探針。
本發明的另一個目的是提供一種用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的組合物和試劑盒，包含用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的引子和上述的PNA探針。
本發明另一個目的是提供一種檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)是否發生感染的方法，藉由使用上述引子生成單鏈遺傳標記序列片段，將PNA探針與生成的遺傳標記序列片段雜合，並根據PNA探針的雜合獲得熔解溫度(Tm)值。
根據本發明的一個方面，提供了一種用於檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記，由序列識別號為1的鹼基序列表示。
根據本發明的另一方面，提供了一種用於檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的肽核酸(PNA)探針，其中PNA探針由序列識別號為3的鹼基序列與上述遺傳標記互補地結合。
根據本發明的另一方面，提供了一種用於檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的組合物和試劑盒，其包含由序列識別號為2的鹼基序列表示的引子和前述的PNA探針。
根據本發明的另一方面，提供了一種用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的方法，包括：(a)從一測試樣品中提取目標核酸；(b)使用由序列識別號為2的鹼基序列表示的一引子和以該目標核酸作為模板的黃頭病毒基因一型的基因序列，生成一單鏈遺傳標記序列片段(single strand genetic maker sequence fragement)；(c)將由序列識別號為3的鹼基序列表示的PNA探針與所生成的該單鏈遺傳標記序列片段雜合(hybridizing)；(d)在增加與步驟(c)的該PNA探針雜合的產物的溫度的同時，獲得取決於溫度的一熔解曲線(melting curve)；以及(e)通過分析步驟(d)所獲得的該熔解曲線並確認一熔解溫度(melting temperature)來檢測黃頭病毒基因一型。
在本發明中，選擇了用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記，使用PNA探針和用於遺傳標記的引子可簡單、快速、準確地檢測病毒。因此，本發明具有在早期有效阻斷被認為是對養殖蝦最大威脅的病毒的感染和擴散。
圖1是顯示了常規熔解陣列(MeltingArray)法的每個步驟和根據本發明的熔解陣列法的每個步驟的技術特徵的概念圖。
圖2是表示本發明的熔解陣列法與常規熔解陣列法比較的效果的示意圖。
圖3顯示了根據本發明用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的一共有序列，包含一遺傳標記、一引子和一肽核酸。
圖4顯示了根據OIE的標準用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的一PCR方法，獲得擴增產物的電泳結果。
圖5顯示一種用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的方法，根據使用針對病毒的一引子和肽核酸獲得一擴增曲線和一熔解曲線。
圖6顯示了根據OIE標準藉由PCR檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的結果，與使用本發明的引子和的肽核酸檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的結果之間，比較靈敏度的結果。
除非本文另有定義，否則本說明書中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的技術人員所理解的具有相同的含義。通常，本說明書中使用的術語是本領域公知的和通常使用的。
本發明人已經嘗試開發一種檢測作為世界動物衛生組織(OIE)的水生動物法典中闡述的感染性病毒的黃頭病毒基因一型(YHV1)的方法，無需測序步驟或在測序步驟之前，藉由確定用於病毒特異性的遺傳標記的PCR擴增產物是否會特異性/非特異性擴增，並且檢測感染病毒的個體(例如，蝦)。結果，使用對於黃頭病毒基因一型(YHV1)具有特異性的核苷酸序列的一標記，和對應於標記的引子和肽核酸探針病毒檢測，黃頭病毒基因一型(YHV1)可以用簡單、快速和準確的方式進行檢測。
更具體地說，使用包含以下成分(1)和(2)的組合物或試劑盒(包括熔解陣列)，其可檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)： (1)包含用於檢測的PNA探針(序列識別號為3)和用於檢測的引子(序列識別號為2)的低聚物混合物，其對於黃頭病毒基因一型(YHV1)是特異性的；以及 (2)一單鏈產生緩衝液(single-strand generation buffer，SSG buffer)，其用於生成使用引子產生的PCR擴增產物作為模板的單鏈DNA，並將PNA探針與單鏈DNA雜合。
因此，根據一方面，本發明涉及檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記，其由序列識別號為1的鹼基序列表示。
另一方面，本發明涉及檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的一引子，其由序列識別號為2的鹼基序列表示。
根據另一方面，本發明涉及一種用於檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的肽核酸(PNA)探針，其由序列識別號為3的鹼基序列表示。
本發明中，一螢光報導體(fluorescent reporter)和能夠使報導體的螢光猝滅的一螢光淬熄體(fluorescent quencher)可以與PNA探針的兩個末端連接。報導體可以選自6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein，FAM)、德克薩斯紅(Texas red)、2',4',5',7','-四氯-6-羧基-4,7-二氯螢光素(十六烷基(HEX))、JOE、Cy3和Cy5組成的群組中的其中一者或多者；而淬滅體可選自6-羧基四甲基-羅丹明(TAMRA)、BHQ1、BHQ2和Dabcyl組成的群組中的其中一者或多者，但不限於此。優選地，可以使用FAM標記的達克萊(Dabcyl)。
肽核酸(PNA)是具有藉由肽鍵而不是磷酸鍵連接的核酸核苷酸的DNA類似物，最早是由尼爾森(Nielsen)等人在1991年合成。PNA是通過化學方法人工合成的，在自然系統中沒有發現。
PNA是識別基因的物質之一，如鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)或嗎啉代核酸(morpholino nucleic acid，MNA)。它具有由聚醯胺組成的骨架。PNA具有絕佳的親和性和選擇性的優點，且對核酸酶具有高穩定性，因此不會被現有的限制酶切割。此外，有利的是，PNA在熱和化學上高度穩定，使得其易於儲存並且不容易降解。
PNA藉由雜合具有與其互補的核苷酸序列的天然核酸而形成一雙鏈體。當它們的長度相等時，PNA/DNA雙鏈體比DNA/DNA雙鏈體更穩定，並且PNA/RNA雙鏈體比DNA/RNA雙鏈體更穩定。此外，當PNA具有使得雙鏈不穩定的單鹼基錯配時，PNA檢測單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)的能力優於天然核酸。
此外，PNA-DNA的結合親和力遠高於DNA-DNA的結合親和力，因此即使在存在一個核苷酸失配的情況下，也存在約10℃至15℃的熔點差 異。使用這種結合親和力的差異，可以檢測SNP和In/Del核苷酸變化。
儘管根據本發明的PNA核苷酸序列的長度沒有特別限制，但是可以構建其長度為12至18聚體的長度，以便包含取決於病毒的種類的特定的核苷酸序列(例如核苷酸變異(nucleotide variation)或單核苷酸多態性(SNP))。在本發明中，通過調整PNA探針的長度，可以將PNA探針設計成期望的Tm值，且即使在具有相同長度的PNA探針的情況下，也可以通過改變核苷酸序列調整Tm值。此外，由於PNA探針具有比DNA探針更高的結合親和力，所以具有較高的Tm值。因此，PNA探針可以設計成具有比DNA探針短的長度，使得它甚至可以檢測相鄰的核苷酸變異或SNPs。在常規高解析度熔解曲線(high resolution melt，HRM)方法中，目標核酸的Tm值的差異低至約0.5℃，因此需要額外的分析程序或在溫度上進行微小的更改或更正，為此，當出現兩個或多個核苷酸變異或SNPs時，難以進行分析。然而，根據本發明的PNA探針將不受PNA探針序列和SNP的影響，因此能夠以簡單方便的方式進行分析。
如本發明所述，當PNA探針包含17個核苷酸時，優選的是，PNA探針包含與序列中間的病毒的核苷酸變異或SNP位點相對應的一個或多個核苷酸。此外，PNA探針可以在核苷酸序列的中間部分具有包括與核苷酸變異或病毒的SNP位點相對應的序列的一結構修飾，從而進一步增加與其完全匹配的目標核酸的熔解溫度(Tm)的差異。
根據另一方面，本發明涉及一種用於檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的組合物和試劑盒，包括引子和PNA探針。
本發明的試劑盒可以任選地包括用來進行目標核酸擴增反應(例如PCR反應)所需的試劑，例如緩衝液、DNA聚合酶輔因子和脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸(deoxyribonucleotide-5-triphosphate)。或者，本發明的試劑盒也可以包括各種多核苷酸分子、逆轉錄酶(reverse transcriptase)、各種緩衝液和試劑，以及抑制DNA聚合酶活性的抗體。此外，在試劑盒中，本領域技術人員可以藉由獲得本文所述的揭露內容，容易地確定特定反應中使用的試劑的最佳量。通常，本 發明的試劑盒可以製成為包含上述成分的單獨的包裝或隔室。
當使用試劑盒時，可以通過使用PNA獲得的熔解曲線(melting curve)的分析來有效地檢測一單核苷酸突變和由一目標核酸中的核苷酸缺失或插入引起的突變，從而檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)。
發明人可以檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)，並根據檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的OIE標準，進行對應於PCR產物的基因鹼基序列的比較分析，確認病毒感染是否發生，並通過使用由序列識別號為2的鹼基序列表示的檢測引子和由序列識別號為3的鹼基序列表示的PNA探針，藉由人工雜合單鏈PCR擴增產物獲得的熔解曲線確認熔解溫度(Tm)。
因此，根據另一方面，本發明涉及一種檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的方法，包括以下步驟：(a)從一測試樣品中提取目標核酸；(b)使用由序列識別號為2的鹼基序列表示的一引子和以該目標核酸作為模板的黃頭病毒基因一型的基因序列生成單鏈遺傳標記序列片段(single strand genetic maker sequence fragement)；(c)將由序列識別號為3的鹼基序列表示的PNA探針與所生成的該單鏈遺傳標記序列片段雜合(hybridizing)；(d)在增加與步驟(c)的該PNA探針雜合的產物的溫度的同時，獲得取決於溫度的一熔解曲線(melting curve)；以及(e)通過分析步驟(d)所獲得的該熔解曲線確認一熔解溫度(melting temperature)來檢測黃頭病毒基因一型。
本發明的方法還可以包括在步驟(b)中添加一單鏈產生緩衝液(single strand generation buffer，SSG buffer)來產生該單鏈遺傳標記序列片段。
在本發明中，單鏈產生緩衝液可以包含DNA聚合酶、脫氧核苷 酸(deoxynucleotides，dNTPs)和穩定劑，其中DNA聚合酶可以是Taq聚合酶，但不限於此。
在本發明中，步驟(b)可以包括使用常規引子對來擴增具有遺傳標記的核苷酸序列，然後使用作為模板的擴增產物產生單鏈遺傳標記序列片段。可以添加TaqMan探針以獲得擴增曲線(amplification curve)。
在本發明中，擴增可以通過即時PCR(聚合酶連鎖反應)方法進行。
如本文所用，術語“樣品”意在包括各種樣品。優選地，使用本發明的方法分析生物樣品。更優選地，樣品可以是與本文所述的病毒物質混合的樣品或來自感染病毒的個體(例如蝦等)的樣品。可以分析源於植物。動物、人、真菌、細菌和病毒的生物樣本。當分析哺乳動物或人類起源的樣品時，其可以衍生自特定的組織或器官。組織的代表性實例包括結締組織、皮膚、肌肉或神經組織。器官的代表性例子包括眼睛、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰腺、腎、膽囊、胃、小腸、睾丸、卵巢、子宮、直腸、神經系統、腺體和內部血管。要分析的生物樣品包括衍生自生物來源的任何細胞、組織或液體、或通過本發明可以良好分析的任何其它培養基。生物樣品還包括從用於人和/或動物的食物製備的食物獲得的樣品。此外，待分析的生物樣本包括體液樣品，其包括但不限於血液、血清、血漿、淋巴、母乳、尿液、糞便、眼液、唾液、精液、腦提取物(例如研磨的腦)、脊髓液、來自闌尾、脾臟和扁桃體的提取物，但不限於此。
如本文所用，術語“目標核酸”、“合成DNA”或“人工合成寡核苷酸”指要檢測的一核酸序列(含有核苷酸變異或SNP)。目標核酸包含編碼具有生理和生化功能的蛋白質的一“標靶基因”的核酸序列的一特定區域，並且在退火、雜合、或擴增條件下，退火或雜合到引子或探針。
如本文所用，術語“雜合”是指互補單鏈核酸形成雙鏈核酸。當兩個核酸鏈之間的互補性是完美的(完全匹配)或當存在一些不匹配的殘基時，雜合 可以發生。雜合所需的互補程度可能因雜合條件而異，特別可能受溫度控制。
在本發明中，熔解曲線分析可以通過螢光熔解曲線分析(fluorescence melting curve analysis，FMCA)方法進行。
根據本發明之包括報導體和淬熄體的PNA探針，在與目標核酸後雜合產生螢光信號。隨著溫度的升高，PNA探針與目標核酸在適當的熔解溫度下迅速熔化，螢光信號被淬滅。通過根據溫度變化的螢光信號獲得的高解析度率熔解曲線的分析，可以檢測核苷酸修飾(包括核苷酸變異或SNP)的有無。如果PNA探針與目標核酸的核苷酸序列完全匹配，則顯示出預期的熔解溫度(Tm)值，但如果PNA探針與存在核苷酸突變的目標核酸錯配，則顯示出熔解溫度(Tm)值低於預期值。
如本文所用，術語“核苷酸變異”是指相對於參考序列，目標核酸的核苷酸序列的變化(例如，一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入以及單核苷酸多態性(SNP))。本發明的PNA探針可以通過熔解曲線分析，來分析目標核酸的核苷酸序列的變化，例如目標核酸的SNP或目標核酸的核苷酸的取代、缺失或插入。
根據本發明的PNA探針可以具有連接到兩端的報導體和螢光淬熄體。螢光淬熄體能夠使報導體的螢光猝滅。報導體可以選自6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein，FAM)、德克薩斯紅(Texas red)、2',4',5',7','-四氯-6-羧基-4,7-二氯螢光素(十六烷基)、JOE、Cy3和Cy5組成的群組中的一者或多者。淬熄體可以選自6-羧基四甲基-羅丹明(TAMRA)、BHQ1、BHQ2和Dabcyl組成的群組中的一者或多者，但不限於此，優選地，可以使用FAM標記的達克萊(Dabcyl)。
Tm值也根據PNA探針的核苷酸序列和與其互補的DNA的核苷酸序列之間的差異而變化，因此基於該變化的應用容易實現。使用與用於TaqMan探針的水解方法不同的雜合方法分析PNA探針，並且具有與PNA探針類似的功能的探針包括分子信標探針(molecular beacon probes)和蝎子探針(scorpion probes)。
使用用於PCR的正向/反向引子組(根據用於常規引子對的國際流行病學辦公室標準(OIE))和包含識別特定核苷酸序列的核苷酸的探針，以及使用由引子組作為模板來擴增遺傳標記的核苷酸序列產生一單鏈遺傳標記序列片段的引子，使用PNA探針的特異性核苷酸序列(例如核苷酸變異或SNP)分析可以充分實現。PCR可以使用常規方法進行，並且在PCR完成之後，需要熔融過程。當熔解溫度增加0.5℃時，測量螢光強度以獲得Tm值。特別地，一般即時PCR系統是廣為人知的，並且具有這樣的優點，即不需要購買如HRM(高解析度熔解曲線)程序或分鐘溫度變化的附加程序。
根據本發明的熔解曲線分析是分析由目標核酸DNA或RNA形成的雙鏈核酸和探針的方法。這種方法被稱為「熔解曲線分析」，因為它是通過例如Tm分析或雙鏈核酸的熔解曲線的分析來進行的。使用與要被檢測的目標的特定核苷酸序列(包括核苷酸變異或SNP)互補的探針，形成目標單鏈DNA和探針的雜合(雙鏈DNA)。隨後，加熱形成的雜合體，並且基於如吸光度的訊號的變化來檢測由溫度升高引起的雜合體的解離(dissociation)(熔解)。基於檢測的結果確定Tm值，從而可以確定特異性核苷酸序列的有無。Tm值隨著形成的雜合體的同源性增加而增加，Tm值隨同源性降低而降低。為此，要被檢測的目標特異性核苷酸序列形成的雜合體的Tm值和與其互補的探針的Tm值預先確定(評價用參考值)，並測量要被檢測的樣品的目標單鏈DNA形成的雜合體的Tm值和探針的Tm值(測量值)。如果測量值近似等於參考值，則可以確定探針匹配，即目標DNA中存在特定的核苷酸序列。如果測量值低於參考值，則探針不匹配，即目標DNA中不存在突變。
本發明的螢光熔解曲線分析是一種使用螢光材料分析熔解曲線的方法，更具體地，可以通過使用包含螢光材料的探針來分析熔解曲線。螢光材料可以是報導體或淬熄體，優選為嵌入式螢光材料(intercalating fluorescent material)。
在根據本發明的即時聚合酶連鎖反應(PCR)方法中，在PCR期間 將螢光物質插入雙鏈DNA雙鏈體中，並且隨著擴增而升高溫度以熔化雙鏈DNA，從而減少存在於DNA雙鏈之間的螢光物質的量。可以分析得到的熔解曲線圖案，特別是在DNA熔化(變性(denatured))的溫度(Tm)，藉此基於特定核苷酸序列(包括核苷酸變化或SNP)的有無來檢測和/或區分病毒的類型。
圖1是顯示了傳統熔解陣列法的每個步驟和根據本發明的熔解陣列的每個步驟的技術特徵的概念圖；以及圖2是表示本發明的熔解陣列法與傳統熔解陣列法比較的效果的示意圖。如圖所示，PNA探針可以與目標核酸雜合，然後產生螢光信號。隨著溫度的升高，PNA探針從目標核酸在合適的熔解溫度(Tm)迅速熔化，因此螢光信號被淬滅。根據本發明，通過從螢光信號獲得的高解析度螢光熔解曲線分析(FMCA)作為該溫度變化的結果，可以檢測目標核酸的有無以及核苷酸序列的差異。如果根據本發明的PNA探針與目標核酸的核苷酸序列完全匹配，則顯示預期的熔解溫度(Tm)值，但是如果PNA探針與目標核酸錯配，其中核苷酸呈現突變，其顯示出比預期值低的熔解溫度(Tm)值。如果沒有目標核酸，那麼PNA探針就顯示沒有熔解溫度(Tm)值。
下文將通過實例詳細介紹本發明。然而，這些實施例僅用於說明本發明，本領域技術人員將理解，這些實施例不應被解釋為限製本發明的範圍。
實施例1：用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記以及引子和針對病毒的PNA探針的製備
為了獲得黃頭病毒基因一型(YHV1)特異性的遺傳標記，分析了在國家生物技術中心(NCBI,U.S.)的核苷酸數據庫(DB)中記載如下表1所示的6種病毒鹼基序列，並嘗試基於分析結果來確定包含特定於黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記的共有序列(consensus sequence)。在這裡，共有序列中使用的IUB代碼名稱總結在下表2中。
[表1]
從黃頭病毒基因一型(YHV1)的共有序列的分析結果中選出了由5'-TCAGTGAGAGAACAGGA-3'(序列識別號為1)表示的鹼基序列作為檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的遺傳標記。
此外，製備由序列識別號為2的鹼基序列表示的引子作為產生遺傳標記的單鏈DNA的引子，並且製備由鹼基序列序列識別號為3表示的PNA探針作為用來雜合遺傳標記的探針。
圖3顯示了黃頭病毒基因一型(YHV1)的鹼基序列，包含遺傳標記、引子和衍生自遺傳標記的PNA探針。在圖3中，PNA探針雜合的遺傳標記區域用藍色表示。
使用上述表3所示的核苷酸序列、報導體和淬熄體構建PNA探針。使用Panagene(韓國)的HPLC純化方法合成PNA探針。通過質譜法分析合成探針的純度。探針避免了不必要的二級結構以有效結合到一目標核酸。
實施例2：優化用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的熔解陣列試劑盒。
使用實驗例1中製備的PNA探針和引子，從黃頭病毒基因一型(YHV1)的核酸樣品獲得擴增曲線和熔解曲線。分析獲得的曲線以驗證PCR產物，從而優化黃頭病毒基因一型(YHV1)的檢測。在這裡，根據國際流行病學辦公標準(Office of International Epizootics，OIE)標準的引子組(根據相關領域的引 子對，表4)來產生PCR產品。
使用CFX96即時系統(BIO-RAD,USA)進行熔解陣列反應。為了從PCR產物產生單鏈目標核酸，使用單鏈產生緩衝液(SSG buffer)和與探針的結合鏈互補的單引子。SSG緩衝液的組合物含有2X nTaq-HOT(0.2units/μl)，nTaq-HOT緩衝液(含4mM的MgCl2)，dNTP混合物(A、T、G和C；各為0.4mM)和一個穩定劑。
用於熔融陣列反應的反應物組合物如下表5所示。在熔融陣列試劑盒中進行主混合後，加入1至3μl的PCR產物進行分析。
表6顯示了反應物雜合反應的條件。具體地說，表6表示從PCR產物中產生單鏈DNA的步驟、一變性步驟(denaturation step)、一雜合PNA探針 的過程和提高雜合產物的溫度的步驟。
結果如圖5所示，通過分析熔解曲線，證實可以使用PNA探針在58℃至64℃的Tm值中檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)。
實施例3：用來檢測黃頭病毒基因一型(YHV1)的熔解陣列試劑盒的靈敏度確認
使用根據OIE標準的用於病毒檢測的引子組，獲得1μl、0.5μl、0.25μl和0.125μl的PCR產物，將其各加載到2%瓊脂膠體(agarose gel)上，並通過一熔解陣列試劑盒進行分析。
結果，如圖6所示，當將PCR產物加載到瓊脂膠體上時，使用PNA探針獲得的熔解曲線中出現高達0.25μl的清晰熔解峰，其中可以檢測到該條帶(band)，表明根據本發明的熔解陣列試劑盒非常敏感。此外，可以通過根據 本發明的熔解組列試劑盒檢測充分檢測在瓊脂膠體的條帶上的PCR產物濃度。
儘管本發明已經基於其具體特徵進行了詳細描述，但是對於本領域技術人員顯而易見的是，這些具體技術僅僅是優選實施例，因此本發明的範圍不限於這些實施例。因此，本發明的實質範圍由所附申請專利範圍及其均等物定義。
<110> 大韓民國國立水產科學院REPUBLIC OF KOREA(National Institute of Fisheries Science)
<120> 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
<130> PF-B1946
<140> TW 106134725
<141> 2017-10-11
<150> 10-2016-0132025
<151> 2016-10-12
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Genetic Marker for YHV1
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Primer
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PNA probe
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Conventional Primer(Forward)
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Conventional Primer(Reverse)
<400> 5

Claims (8)

  1. 一種檢測黃頭病毒基因一型(yellow head virus genotype 1，YHV1)的遺傳標記，由序列識別號為1的一鹼基序列(base sequence)表示。
  2. 一種用於檢測黃頭病毒基因一型的肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)探針，由序列識別號為3的一鹼基序列表示，其中該PNA探針互補結合請求項1所述之該遺傳標記。
  3. 如請求項2所述之該PNA探針，其中一報導體(reporter)或一淬熄體(quencher)附著於該PNA探針。
  4. 一種用於檢測黃頭病毒基因一型的組合物，包含由序列識別號為2的鹼基序列所表示的的一引子(primer)以及由序列識別號為3的鹼基序列所表示的一PNA探針，其中該PNA探針用以互補結合由序列識別號為1的鹼基序列所表示的一遺傳標記。
  5. 一種用於檢測黃頭病毒基因一型的試劑盒，包含由序列識別號為2的鹼基序列所表示的一引子以及由序列識別號為3的鹼基序列所表示的一PNA探針，其中該PNA探針用以互補結合由序列識別號為1的鹼基序列所表示的一遺傳標記。
  6. 一種檢測黃頭病毒基因一型的方法，包括以下步驟：(a)從一測試樣品中提取目標核酸；(b)擴增該目標核酸；(c)使用由序列識別號為2的一鹼基序列表示的一引子和以擴增的該目標核酸作為一模板的黃頭病毒基因一型的一基因序列，生成一單鏈遺傳標記序列片段(single strand genetic maker sequence fragement)，其中該單鏈遺傳標記序列片段包含由序列識別號為1的一鹼基序列表示的一遺傳標記；(d)將由序列識別號為3的一鹼基序列表示的一PNA探針與所生成的該單鏈遺傳標記序列片段雜合(hybridizing)；(e)在增加與步驟(d)的該PNA探針雜合的產物的溫度的同時，獲得取決於溫度的一熔解曲線(melting curve)；以及(f)通過分析步驟(e)所獲得的該熔解曲線確認一熔解溫度(melting temperature)來檢測黃頭病毒基因一型。
  7. 如請求項6所述的方法，其中透過在步驟(c)中添加一單鏈產生緩衝液(single strand generation buffer，SSG buffer)來產生該單鏈遺傳標記序列片段。
  8. 如請求項7所述的方法，其中該單鏈產生緩衝液包含DNA聚合酶、脫氧核苷酸(deoxynucleotide，dNTP)和穩定劑。
TW106134725A 2016-10-12 2017-10-11 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法 TWI659106B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160132025A KR101737318B1 (ko) 2016-10-12 2016-10-12 노랑머리병 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
??10-2016-0132025 2016-10-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201814053A TW201814053A (zh) 2018-04-16
TWI659106B true TWI659106B (zh) 2019-05-11

Family

ID=59049215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106134725A TWI659106B (zh) 2016-10-12 2017-10-11 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101737318B1 (zh)
TW (1) TWI659106B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778631B (zh) * 2024-02-22 2024-04-26 三亚中国检科院生物安全中心 可快速检测虾黄头病毒的rt-rpa引物探针组合及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101642784B1 (ko) * 2016-01-15 2016-07-27 대한민국 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101655071B1 (ko) 2016-04-29 2016-09-07 대한민국 참돔 이리도 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101642784B1 (ko) * 2016-01-15 2016-07-27 대한민국 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mohr PG et al., "New yellow head virus genotype (YHV7) in giant tiger shrimp Penaeus monodon indigenous to northern Australia", Dis Aquat Org., Vol.115:263-268, 2015/08/20 *
Wongteerasupaya C et al., "Detection of yellow-head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification", Dis Aquat Org., Vol.31:181-186, 1997/12/30 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201814053A (zh) 2018-04-16
KR101737318B1 (ko) 2017-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11041190B2 (en) Genetic markers for discrimination and detection of red sea bream iridovirus causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the virus using the same
US10745732B2 (en) Genetic marker for discriminating and detecting causative bacteria of fish Edwardsiellosis and Streptococcosis, and method for discriminating and detecting causative bacteria using same
US11634760B2 (en) Method for amplifying target nucleic acid and composition for amplifying target nucleic acid
KR101642783B1 (ko) 참돔 이리도바이러스병 원인바이러스의 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
KR102061896B1 (ko) 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법
KR20190105785A (ko) 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 검출용 PNA 프로브 및 그의 용도
TWI659106B (zh) 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
US20190177771A1 (en) Pna probe for discrimination of quinolone antibiotic resistant bacteria and method for discrimination of antibiotic resistant bacteria using the same
KR101655068B1 (ko) 잉어 허피스 바이러스 베르코이버 티케이 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
KR101655071B1 (ko) 참돔 이리도 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
KR101655069B1 (ko) 잉어 허피스 바이러스 그레이 에스피에이치 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법
KR101737314B1 (ko) 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
US20210164060A1 (en) Method for detecting mutation in viral hemorrhagic septicemia virus (vhsv) non-viron (nv) gene
KR102091284B1 (ko) 어류 비브리오병의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101855723B1 (ko) Pna 프로브를 이용하여 갑각류 전염병을 검출하는 방법
KR101677952B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 락토코카스 가비에의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101644776B1 (ko) 참돔 이리도바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
CN107937604B (zh) 检测传染性肌肉坏死病毒的遗传标志物及使用该遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法
KR102575618B1 (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물
KR102091283B1 (ko) 어류 비브리오병의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101677948B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 스트렙토코카스 이니애의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101677951B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 스트렙토코카스 파라우베리스의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101737316B1 (ko) 엑스트라 스몰 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법
KR101992390B1 (ko) 굴 허피스 바이러스 검출 및 유형 판별을 위한 유전자 마커, 및 이의 용도
KR20220081536A (ko) 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물