KR20220081536A

KR20220081536A - 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물

Info

Publication number: KR20220081536A
Application number: KR1020200171116A
Authority: KR
Inventors: 황지연; 황성돈; 권문경; 정지민
Original assignee: 대한민국(해양수산부 국립수산물품질관리원장)
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-06-16
Also published as: WO2022124823A1

Abstract

본 발명은 새우 급성간췌장괴사병 진단용 프라이머, 프로브 및 상기 프라이머 또는 프로브를 함유하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 종래 방법으로 2시간 이상이 소요되었던 새우 급성간췌장괴사병의 진단을 100 copy 유전자에 대해서 1 시간 ~ 30분 이내에 질병감염 유무를 확인할 수 있어, 새우 급성간췌장괴사병의 감염 및 확신을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.

Description

새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물{Composition for Diagnosting Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease}

본 발명은 새우 급성간췌장괴사병을 분자진단 할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 프라이머, 프로브 및 상기 프라이머 또는 프로브를 함유하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물에 관한 것이다.

새우의 조기폐사증후군(early mortality syndrome, EMS) 또는 급성간췌장괴사병(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)로 알려진 신종질병이 2009년 중국 남부 지방을 시작으로 베트남, 태국, 말레이시아 및 멕시코에서 발생하여 막대한 경제적 손실을 일으키고 있다(FAO, 2013).

어린 새우에 발생시 폐사율이 100%에 이르는 질병으로, EMS 또는 AHPND의 원인 병원체는 비브리오균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahemolyticus)로 알려져 있으며, 이 세균이 박테리오파지의 공격을 받아 독성을 분비할 때 새우에 치명적인 피해를 준다. 감염경로는 같은 사육지 내 새우 구강을 통해서 감염되며, 주요 양식피해 품종은 홍다리얼룩새우, 흰다리새우, 대하로 알려져 있다.

조기폐사증후군은 2013년 이후 지속적으로 발생하고 있으며 이에 대한 치료 및 해결 방안이 아직까지 없는 실정이다. 따라서, 조기폐사증후군의 빠른 진단을 통해서 질병의 확산 및 예방을 위한 기술이 필요하며, 질병 확산을 막기 위해서는 질병원인균을 높은 민감도로 검출하는 기술이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 새우 급성간췌장괴사병의 원인균으로 알려진 비브리오 파라헤모라이티쿠스 균주 감염을 신속하고, 정확하게 진단하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 PirA 유전자 및 PirB 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 함유하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 개발하고, 상기 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 사용하는 경우, 높은 민감도와 특이도로 새우 급성간췌장괴사병을 진단할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 새우 급성간췌장괴사병을 높은 민감도와 특이도로 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 새우 급성간췌장괴사병을 높은 민감도와 특이도로 진단할 수 있는 PNA 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 이용한 상기 새우 급성간췌장괴사병의 진단벙법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 프라이머 쌍을 제공한다:

(i) 서열번호 1 /2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 또는

(ii) 서열번호 7/8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍.

본 발명은 또한, 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 PNA 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 이용한 새우 급성간췌장괴사병 진단방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 종래 방법으로 2시간 이상이 소요되었던 새우 급성간췌장괴사병의 진단을 100 copy 유전자에 대해서 1 시간 ~ 30분 이내에 질병감염 유무를 확인할 수 있어, 새우 급성간췌장괴사병의 감염 및 확신을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 따른 프라이머 쌍을 이용한 비대칭 PCR 단계, PNA 프로브와의 혼성화 단계 및 혼성화 산물이 융해되는 단계를 나타내는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용한 새우 급성간췌장괴사병 조직 샘플을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 샘플에 대하여 fastPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 쌍과 PNA 프로브 후보를 이용하여 샘플에 대하여 fast PNA PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 PCR 주형(template)으로 사용되는 표적 유전자를 각각 10⁶ ~ 10² copy, 정량하여 fast PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 PCR 주형(template)으로 사용되는 표적 유전자를 각각 10⁶ ~ 10² copy, 정량하여 fast PNA PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 AHPND에 감염되지 않은 새우의 DNA에 대하여 본 발명의 프라이머 쌍 및 PNA 프로브를 이용하여 fast PCR과 fast PNA PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 새우 급성간췌장괴사병 원인균을 신속하게 검출하기 위하여, PCR법과 real-time PCR법을 개발하였으며, 본 발명에 따른 PCR법은 real-time PCR 기기가 없는 시설에서 새우 급성간췌장괴사병을 확인하는데 유용하며, 본 발명에 따른 real-time PCR법은 전기영동 과정에서 소요되는 시간을 절약하고 오염 및 시간 절약을 위하여 개발하였다.

본 발명에 따르면, 새우 급성간췌장괴사병의 원인인 Vibiro parahaemolyticus균의 PirA 또는 PirB를 검출하는 방법으로 PCR법으로 검출할 수 있으며, OIE가이드라인에 의한 nested PCR법은 검출과정이 두시간이 넘게 걸리고, 통상적인 PCR법 또한 한 시간 30분 이상이 걸리지만, 본 발명을 통해 개발된 PCR법은 한시간 이내에서 100 copy 유전자에 대해서 검출이 가능하며, real-time PCR법 또한 통산적으로 2시간에서 2시간 30분가량 걸리는 시간에서 한시간 30분이내에 질병감염 유무를 확인 할 수 있고 100 copy 유전자에 대해서 검출이 가능하여, 빠른 진단과 높은 민감도를 가진 본 검사법을 통해서 질병의 감염 및 확신을 조기에 차단 할 수 있는 효과가 있다.

PCR법은 종래 OIE 가이드라인에서 권고하는 2 step PCR에서 1 step PCR만으로 이와 동등한 결과를 나타내는 것을 확인 하였으며, real-time PCR법은 종래 유전자 마커에 따른 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭여부를 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 검출하기 위한 대안으로, 새로운 유전자 마커 및 이에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 프라이머 쌍에 관한 것이다:

(i) 서열번호 1 /2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 또는

(ii) 서열번호 7/8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍.

다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 PNA 프로브에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.

펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며, 자연계에서는 발견되지 않아 화학적인 방법으로 인공 합성될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 이용한 새우 급성간췌장괴사병 진단방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 진단방법은 PCR, fast PCR, Real-time PCR 및 fast PNA PCR에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "검체" 또는 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 세균 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 세균에 감염된 개체(예컨대, 잉어 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.

본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 세균 검출 및 변이 판별이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 새우급성간췌장괴사병 검출용 유전자 마커, 및 상기 세균에 특이적인 프라이머 및 PNA 프로브 제작

새우급성간췌장괴사병을 검출하기 위하여, 원인균인 Vibrio parahemolyticus의 특이적 유전자 마커를 도출하였다.

먼저, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 81개의 염기서열을 가지고 분석을 진행하였고, 공통서열(consensus)로 제작하여 유전자 분석을 진행하였다. 분석에 사용된 염기서열을 표 1에 표기하였다.

NCBI No.

CP034288.1, CP034571.1, CP034308.1, CP034304.1, CP046414.1, CP033146.1, CP020078.1, KY498540.1, KX268305.1, AB972427.1, KM067908.1, LC066533.1, KU145400.1, MH718270.1, KU556825.1, CP028145.1, MH152521.1, MH152522.1, MH152520.1, KU145397.1, MH410660.1, KU145399.1, KU145396.1, KM035408.1, MK368635.1, KX260108.1, KX260109.1, MH458302.1, MH423892.1, MH423893.1, MH423891.1, MH423890.1, MH423889.1, MH458303.1, MH423888.1, MH458306.1, MH458305.1, LC032040.1, MH410659.1, LC066534.1, MH388412.1, KU145397.1, MK368636.1, MH388414.1, MH388411.1, MH388409.1, MH388408.1, MH388416.1, MH388413.1, MH388418.1, MH388417.1, MH388415.1 KU145398.1, KU145395.1, MH388410.1, CP028145.1, MK368636.1, KU145396.1, CP045861.1, MH890610.1, CP033140.1, CP033136.1, CP020036.1, AP014860.1, KP324996.1, CP034297.1, CP043423.1, CP034293.1, CP022245.1, CP021148.1, CP028346.1, MH714301.1, MH714300.1, MH714299.1, MH714298.1, MH700243.1, MH685878.1, MH680583.1, MH685877.1, MH700244.1, KX260110.1

구분	서열번호	5' -> 3'(sequence)	비고
프라이머	서열번호1	GCTAAATCACATGTGGTACAA	Fast PCR용 Primer (213bp, set 1)
	서열번호2	ACTTTTACGAGCATTGTTAGGG	Fast PCR용 Primer (213bp, set 1)
	서열번호3	GGGTGCGCCATTTATGGCTG	Fast PCR용 Primer (266bp, set 2)
	서열번호4	CATAGTTATCAAATAAATAACTTTTAC	Fast PCR용 Primer (266bp, set 2)
	서열번호5	GACATTGAGAATACGGGACGTGG	Fast PCR용 Primer (397bp, set 3)
	서열번호6	CGTTGATAAAAAACCACCCGCG	Fast PCR용 Primer (397bp, set 3)
	서열번호7	GCTAAATCACATGTGGTACAA	PNA PCR용 primer
	서열번호8	GGTGCTCACATGACTAACGA	PNA PCR용 primer
PNA probe	서열번호9	GCTAGTCGTGGTTTCT	FAM, Dabcyl
	서열번호10	GTATTGTTGTAATTAAC	FAM, Dabcyl
	서열번호11	GAAACTTACCATTTACAAC	FAM, Dabcyl

상기 표 2에 나타난 바와 같이, PCR 효율을 고려하여, 4쌍의 프라이머를 디자인하였으며, 상기 프라이머에 의해 생성되는 PCR 산물과 결합할 수 있는 염기서열과 리포터 및 소광자로 구성된 PNA 프로브를 제작하였다. PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.

실시예 2: 새우급성간췌장괴사병(AHPND) 감염 샘플의 검증

새우급성간췌장괴사병 시험을 위한 샘플 새우 조직은 국립 수산과학원에서 확보하였다.

샘플의 검증은 공인된 시험법인 OIE(www.oie.int) 가이드라인에 따른 실험법을 진행하였으며, AP4법(first & second PCR법)으로 진행하였다(OIE-manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, chapter 2.2.1_2019) .

AP4법은 첫번째 PCR(first PCR)과 두번째 PCR(second PCR)을 통하여 결과를 확인한다.

실험에 사용한 AP4 프라이머는 하기와 같으며, 2번째 PCR을 통해 생성되는 PCR 산물 사이즈는 229bp이다.

AP4 F1: ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC (서열번호 12)

AP4-F2: ACGATTTCGACGTTCCCCAA(서열번호 13)

AP4-F2: TTGAGAATACGGGACGTGGG (서열번호 14)

AP4-R2: GTTAGTCATGTGAGCACCTTC(서열번호 15)

1번 샘플은 음성(Negative) 샘플이며, 2번~4번 샘플이 AHPND를 유발하는 세균을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.

번호	sample 출처	First PCR bp	Second PCR bp	검사결과
1	NTC	N/A	N/A	음성
2	국립수산과학원	1269	230	양성
3	국립수산과학원	1269	230	양성
4	국립수산과학원	1269	230	양성

실시예 3: fast PCR을 프라이머 선별

실시예 1에서 디자인된 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 2에서 검증된 AHPND 원인균 샘플에 대해서 검출 실험을 진행하여 최적 프라이머를 선별하였다.

PCR 반응은 CFX96™Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 1번 set로, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 2번 set로 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 3번 set로 하여 진행하였다. 각각의 프라이머는 10pmol 농도를 1㎕씩 사용하였다. 2X fast PCR buffer 버퍼의 조성은 2X의 사용농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/μl), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl₂ 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함하도록 하였다.

PCR 반응물의 조성은 표 4에 나타내었다. 키트의 마스터 믹스를 만든 후 DNA를 1μL 첨가하여 표 5의 조건으로 PCR을 진행하였으며, 총 3개의 샘플에 대해서 각각에 대해 진행하였다.

조성	용량
2X fast PCR buffer	10μL
프라이머	7μL
주형(Template, DNA)	1μL
증류수	up to 20μL

단계	온도(℃	반응시간 및 사이클
Predenaturation	95	10 min
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인	95	10 sec	45 cycle
	52	10 sec
	72	10 sec

1번 샘플은 음성 샘플이며, 2번~4번 샘플이 AHPND를 유발하는 세균 DNA이며, 각각의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, set1의 경우 213bp에서 Target size가 정상적으로 나오는 것을 확인할 수 있었으나, set2의 경우 2번과 3번 샘플에서 266bp가 아닌 다른 size에서 결과가 나오는 것을 확인할 수 있었으며, set3의 타겟 사이즈인 397 부근에서 산물이 나타나지만, 230bp에서도 증폭산물이 나타나는 2가지 크기의 결과물이 나오기에, 최종적으로 AHPND의 검출을 위한 프라이머 셋트로 셋트 1(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍)을 선별하였다.

실시예 4: fast PNA PCR을 위한 최적 PNA 프로브(probe) 선별

실시예 1에서 디자인된 PNA probe들을 이용하여 샘플에 대해서 실험을 진행하여 최적의 PNA probe를 선별하였다.

Real-time PCR 반응은 CFX96™Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 사용하여, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 PNA 프로브에 대한 성능을 각각 확인하였다. 비대칭 PCR을 위해 2pmol의 순방향 프라이머 1㎕, 20pmol의 역방향 프라이머 2㎕를 사용하고, 상기 프라이머와 PNA 프로브를 섞어 올리고머 믹스를 제조하였다.

fast PCR 버퍼의 조성은 2X의 사용농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/μl), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl₂ 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함하도록 하였다.

실시간(Real-time) PCR 반응물의 조성은 표 6에 나타내었다. 키트의 마스터 믹스을 만든 후 DNA를 1μL 첨가하여 표 7의 조건으로 분석을 수행하였으며, 그 ㄱ결과를 도 4에 나타내었다.

조성	용량
2X SSG 버퍼	10μL
올리고머 믹스 (PNA 프로브, 프라이머)	7μL
주형(Template, DNA)	1μL
증류수	up to 20μL

단계	온도(℃	반응시간 및 사이클
Predenaturation	95	10 min
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인	95	10 sec	45 cycle
	52	10 sec
	72	10 sec
변성(Denaturation)	95	30 sec
프로브 결합(Probe binding)	75	30 sec
	55	30 sec
융해(Melting)	45 to 85	Increment 1.0℃5 sec (FAM)

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 서열번호 9의 PNA 프로브를 사용한 경우, Ct값과 Melt curve에서 결과를 확인할 수 었지만, 서열번호 10의 PNA 프로브를 사용한 경우, 하나의 피크(peak)가 아닌 2개의 피크(peak)와 형광 증폭량이 낮은 결과를 확인할 수 있었으며, 서열번호 11의 PNA 프로브를 사용한 경우 1개 샘플에서만 증폭이 되는 것을 확인하였다. 따라서, 최종적으로 AHPND의 검출을 위한 PNA 프로브로 서열번호 9의 PNA 프로브를 선별하였다.

실시예 5: 본 발명에 따른 AHPND의 검출용 조성물의 민감도 확인

실시예 3과 실시예 4에서 확립된 조건을 이용하여 유전자 농도를 각각 변화시키며 본 발명의 민감도를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 시료에 포함된 PCR 주형(template)으로 사용되는 표적 유전자를 각각 10⁶ ~ 10² copy, 정량하여 fast PCR 및 fast PNA PCR 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 10₆ ~ 10₂ copy 모두에서 fast PCR법은 전기영동 상의 밴드(band)를 확인할 수 있었고, 도 6에 fast PNA PCR은 융해피크를 나타내어, 본 발명에 따른 AHPND의 검출용 조성물을 이용하면 매우 적은 양의 시료로부터도 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 6: 본 발명에 따른 AHPND의 검출용 조성물의 특이도 확인

숙주인 새우의 DNA에 의한 간섭 현상이 있는지 여부를 확인하기 위하여, AHPND에 감염되지 않은 새우의 DNA를 추출하여 실시예 3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 fast PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명으로부터 개발된 fast PCR 법 및 fast PNA PCR에서 gel-loading에 따른 전기영동 밴드 및 융해곡선이 전혀 확인되지 않았으며, 이로부터 본 발명에 따른 PNA 프로브는 숙주 DNA와의 간섭 없이 특이적으로 반응하는 것을 검증할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Institute of Fisheries Science <120> Composition for Diagnosting Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease <130> P20-B260 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctaaatcac atgtggtaca a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acttttacga gcattgttag gg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggtgcgcca tttatggctg 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 catagttatc aaataaataa cttttac 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gacattgaga atacgggacg tgg 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgttgataaa aaaccacccg cg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctaaatcac atgtggtaca a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtgctcaca tgactaacga 20 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 gctagtcgtg gtttct 16 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 10 gtattgttgt aattaac 17 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 11 gaaacttacc atttacaac 19 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP4 primer <400> 12 atgagtaaca atataaaaca tgaaac 26 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP4 primer <400> 13 acgatttcga cgttccccaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP4 primer <400> 14 ttgagaatac gggacgtggg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP4 primer <400> 15 gttagtcatg tgagcacctt c 21

Claims

다음을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 프라이머 쌍:
(i) 서열번호 1/2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 또는
(ii) 서열번호 7/8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍.
서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 원인균 검출을 위한 PNA 프로브.
제2항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터 및 소광자를 포함하는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
제3항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
제3항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 제2항의 PNA 프로브를 추가로 함유하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물.
제6항 또는 제7항의 새우 급성간췌장괴사병 진단용 조성물을 이용한 새우 급성간췌장괴사병 진단방법.
제8항에 있어서, PCR, fast PCR, Real-time PCR 및 fast PNA PCR에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 진단방법.
제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 키트.
제9항에 있어서, 제2항의 PNA 프로브를 추가로 함유하는 새우 급성간췌장괴사병 진단용 키트.