KR101782489B1

KR101782489B1 - 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 pna 프로브 및 그 용도

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Publication number: KR101782489B1
Application number: KR1020160042234A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 권세련; 박재신; 박희경; 정진욱
Original assignee: 주식회사 시선바이오머티리얼스; 대한민국(해양수산부 국립수산물품질관리원장); 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2017-09-28

Abstract

본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 검출용 PNA 프로브, 이를 이용한 VHSV의 검출 방법 및 이를 이용한 양성대조군의 오염에 따른 VHSV 위양성의 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 VHSV의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)으로 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 VHSV를 검출하거나 검체의 VHSV의 감염 또는 양성대조군에 의한 시료의 오염 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 수산생물전염병 원인바이러스를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별하고, 어류의 상기 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 검출용 PNA 프로브 및 그 용도{Development of real-time PCR using PNA probe for detection of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) and Uses Thereof}

본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 검출용 PNA 프로브, 이를 이용한 VHSV의 검출 방법 및 이를 이용한 양성대조군의 오염에 따른 VHSV 위양성의 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 VHSV의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)으로 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 VHSV를 검출하거나 검체의 VHSV의 감염 또는 양성대조군에 의한 시료의 오염 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS)의 원인이 되는 바이러스이다. VHSV의 감염은 어종, 어체 크기 및 수온 등의 요인과 관계가 있으며, 직접 다른 어류로 감염되는 수평감염과 어미의 알로부터 감염되는 수직감염의 특징을 가지고 있다.

연어과 어류에서 VHSV에 감염되어 질병이 발현되는 적수온은 8℃ 전후이며, 우리나라 넙치의 경우는 20℃ 이하에서 발병되며, 가을에서 다음 봄까지의 저수온 시기에 주로 발생하여 수산업에 큰 피해를 주고 있다.

국내의 경우 2001년, 겨울과 봄의 저수온기에 양식 넙치에서 VHSV에 의한 피해 사례가 학계에 보고되었으며, 2001년 이후 매년 비슷한 시기에 질병증상이 관찰됨에 따라서 일반적인 바이러스성 질병으로 분류되었다. 우리나라 넙치에 있어 바이러스성 질병으로는 VHS, 히라메 랍도바이러스(Hirame rhabdovirus, HIRRV), 아쿠아비르나바이러스(Aquabirnavirus) 등이 있으며, 이들 바이러스성 질병 중 VHS는 가장 많은 피해를 주고 있다.

현재 VHSV의 검사법은 OIE(World Organisation for Animal Health)의 질병 분석 가이드라인(Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals)으로 고시화되어 있으며, 실시간 유전자증폭장치(Real-time PCR)을 이용하여 검사하는 방법은 매우 보편화되어 있다. 상기 검사법은 상대적으로 항체반응법 등 다른 검사법에 비해 민감도가 좋고, 비용적 절감과 시간적 절약의 큰 특징과 장점을 가지고 있어 유용하게 사용되고 있으나, 검사과정에서 VHSV 감염 추정 시료가 양성대조군인 야생형 VHSV 유전자를 포함하는 서열단편(예컨대, VHSV N-유전자의 complementary DNA)에 의해 오염되면 시료의 위양성을 판별할 수 없다는 단점을 가지고 있다.

또한, 실시간유전자증폭장치에서 흔히 사용되고 있는 TaqMan 프로브는 구조적으로 hydrolysis Method 방법으로 형광 값을 띄는 구조적 특징을 가지고 있어, 프로브 내 유전자 염기서열의 염기 변이, 그리고 양성대조군의 혼합 시, 그 진위 여부를 판단할 수 없다는 단점을 가지고 있다. 따라서 검사의 신속성과 비용적 절감과 더불어 유전자 오염으로 인한 오진 가능성을 최소화시키는 등의 검사 정확성이 절실히 요구되는 실정이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 수산생물전염병의 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 유형(변이체)을 판별하고, VHSV에 감염된 개체(예컨대, 어류) 검출 시 양성대조군인 VHSV 유전자를 포함하는 서열단편(예컨대, VHSV N-유전자의 complementary DNA)의 오염에 따른 시료의 VHSV 위양성을 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, VHSV N-유전자에 특이적인 VHSV의 판별 또는 검출용 펩티드핵산 및 프라이머 쌍을 이용하여 VHSV를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 검출/판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 VHSV 검출용 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 프로브를 포함하는 VHSV의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 VHSV의 유전자에 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 Tm값을 분석하여 VHSV의 유형을 판별하거나 개체의 VHSV 감염 여부를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 VHSV의 유전자에 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 Tm값을 얻어 검체 시료의 VHSV 위양성을 판별하는 방법을 제공하는 데 있다

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열로 표시되고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 N-protein 서열과 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있는 VHSV의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브를 포함하는 VHSV의 판별 또는 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 핵산과 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화시킨 산물의 융해곡선을 분석하여, 융해온도로부터 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 판별하거나 어류의 상기 바이러스 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 시료에서 추출된 표적 핵산에 양성대조군 핵산을 혼합하는 단계; (b) 상기 표적 핵산 및 양성대조군 핵산에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편에 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화시킨 산물의 융해곡선을 분석하여, 융해온도로부터 시료의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 위양성 여부를 양성대조군과 비교하여 판별하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 위양성 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 수산생물전염병 원인바이러스를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별하고, 어류의 상기 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 VHSV의 검출 및 양성대조군과의 판별을 위한 VHSV N-유전자 내부의 위치도를 나타낸 것이다.
도 2는 TaqMan 프로브 및 PNA 프로브의 구조적 특징을 나타낸 것이다.
도 3은 VHSV의 검출 및 양성대조군과의 확인을 위한 예비실험의 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 VHSV의 검출 및 양성대조군과의 확인을 위한 예비실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 TaqMan 프로브 및 PNA 프로브를 이용한 증폭곡선 및 융해곡선의 실험조건을 나타낸 것이다.
도 6은 TaqMan 프로브 및 PNA 프로브를 이용한 증폭곡선 및 융해곡선의 분석결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 양태에서 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code) 기준에 따른 수산생물전염병의 원인바이러스인 VHSV의 N-유전자 염기서열단편에 대한 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭 여부를 시퀀싱 단계 없이 VHSV 유형을 판별하고, VHSV에 감염된 개체(예컨대, 어류) 검출 시 양성대조군인 VHSV 유전자를 포함하는 서열단편(예컨대, VHSV N-유전자의 complementary DNA)의 오염에 따른 시료의 VHSV 위양성을 판별하는 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, VHSV의 유전자에 특이적 염기서열을 가지는 VHSV의 판별 또는 검출용 프라이머 및 펩티드핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용하여 VHSV를 판별/검출할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 5의 염기서열로 표시되고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 N-protein 서열과 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있는 VHSV의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)일 수 있다.

펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.

펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다

또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 융해온도(Tm) 값이 10~15℃ 가량 차이 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이 또는 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.

본 발명에서와 같이, PNA 프로브가 14개의 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, PNA 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적 핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브를 포함하는 VHSV의 판별 또는 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 바이러스의 종 판별이 가능하다.

본 발명은 다른 양태에서, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 OIE 기준에 따른 검출용 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 PCR 증폭산물에 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 판별하고 검출할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 시료에서 핵산을 추출하는 단계;

(b) 상기 핵산과 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화시킨 산물의 융해곡선을 분석하여, 융해온도로부터 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 판별하거나 어류의 상기 바이러스 감염 여부를 검출하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계를 수행하기 이전에 핵산과 양성대조군 핵산을 혼합하고, 상기 혼합물에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합물에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편을 증폭하는 단계는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양성대조군 핵산은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 야생형 N-유전자 염기서열과 구별되는 적어도 하나 이상의 염기변이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 상기 염기변이는 염기(Nucleotide(N): A, T, C, G)의 결실, 치환 또는 삽입일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 양성대조군 핵산은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태에서, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 OIE 기준에 따른 검출용 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 증폭된 PCR 증폭산물에 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 양성대조군인 VHSV 유전자를 포함하는 서열단편(예컨대, VHSV N-유전자의 complementary DNA)의 오염에 따른 시료의 VHSV 위양성을 판별할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 시료에서 추출된 표적 핵산에 양성대조군 핵산을 혼합하는 단계; (b) 상기 표적 핵산 및 양성대조군 핵산에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편에 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; 및 (c) 상기 혼성화시킨 산물의 융해곡선을 분석하여, 융해온도로부터 시료의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 위양성 여부를 양성대조군과 비교하여 판별하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 위양성 판별 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, (b)단계를 수행하기 이전에 상기 혼합물에 포함된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 N-유전자 염기서열을 포함하는 서열단편을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.

본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.

PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe) 등이 있다.

PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5~1℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.

본 발명의 결과를 최적화하기 위한 기술적 방법으로는 Liquid type U-TOP 방법(시선바이오머티리얼스, 한국)으로 표적 핵산의 단일 염기서열의 치환 및 염기의 결실 또는 삽입을 효과적으로 검출할 수 있는 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하여 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 PNA 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법을 활용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: VHS 바이러스 진단용 프로브 및 양성대조군의 제조

국립수산물품질관리원에서 보관 중인 표준시료 VHSV를 이용하여 cDNA 주형으로 염기서열을 분석하여 OIE(국제무역사무국)의 가이드라인에 고시된 염기서열과의 일치여부를 확인하였다.

그 결과, 국립수산물품질관리원에서 보관 중인 시료는 OIE의 가이드라인에 고시된 염기서열과 100% 일치하는 것을 확인하였다.

염기서열 분석을 통하여 확인된 표준시료를 이용하여, OIE(국제무역사무국)에 고시된 가이드라인을 준수하여 VHSV에 대한 유전자 증폭용 프라이머, TaqMan 프로브, 및 PNA 프로브를 제작하였다. 또한, 오염에 따른 위양성 반응을 배제하기 위해, 양성대조군인 VHSV-PO를 제작하였다(표 1 참조).

표 1은 본 발명에서 이용되는 VHSV 검출용 프라이머, PNA 프로브 및 양성대조군의 염기서열을 나타낸 것이다.

본 발명에서 이용되는 프라이머, 프로브 및 양성대조군 서열정보

타겟 유전자	구분	이름	서열(5'->3')	서열번호
VHSV-N gene	프라이머	VHSV-2F	ATGAGGCAGGTGTCGGAGG	1
	프라이머	VHSV-2R	TGTAGTAGGACTCTCCCAGCATCC	2
	양성대조군	VHSV-PO	CTGAGCATTCATGAGGCAGGTGTCGGAGGCGCGGTCCATCCAAGAGCGATACGCCATCATGACGAGTCGGATGCTGGGAGAGTCCTACTACACTGAGCATTC	3
	TaqMan 프로브	VHSV-2MGB	(FAM)-TACGCCATCATGATGAGT-(MGBNFQ)	4
	PNA 프로브	VHSV-PNA	(Dabcyl)-TACGCCATCATGATG-(FAM)	5

먼저, PNA 프로브의 경우, TaqMan 프로브가 VHSV 타깃 유전자를 인식하는 염기서열의 범위내로 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 PNA 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다(표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 PNA 프로브의 불필요한 이차구조는 피함).

TaqMan 프로브의 경우, 네오프로브(Neoprobe, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, TaqMan 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 국제무역사무국 가이드라인에 기재된 내용과 동일하게 제작하였다.

양성대조군의 경우, 오염여부를 확인할 수 있도록 증폭할 수 있는 프라이머 지역을 포함하여, PNA 프로브 지역의 염기서열 하나를 인위적으로 교체하여 제작하였다. 염기의 변이부위는 보통 표적 핵산과 5℃이상 융해온도(Tm)차이가 나도록 PNA 프로브 결합 부위 가운데에 위치하도록 디자인하였다. 융해온도(Tm)가 10℃ 이상 차이가 발생할 경우 증폭과정에서 양성대조군의 증폭여부를 확인할 수 없으므로, 최대한 바깥쪽에 위치하여 염기서열을 교체하였다.

PNA 프로브의 경우 TaqMan 프로브의 염기서열보다 3mer 짧고 중첩되게 제작하였으며, 양성대조군의 경우 PNA 프로브를 기준으로 3'end의 염기서열의 63번째 위치의 T(thymine)를 C(cytosine)으로 교체하였다(도 1 참조).

실시예 2: VHSV의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 이용한 예비실험

TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)에 따른 검출방법은 유전자 증폭용 시약에 포함된 Taq polymerse의 5' exonuclease 활성에 의한 형광 시그널을 기반으로 하나, PNA 프로브를 이용할 경우 형광 시그널을 나타내는 원리와 다르므로 PNA 프로브와 TaqMan 프로브를 모두 사용할 수 있는 비대칭 중합효소연쇄반응(Asymmetric PCR)을 수행하였다.

즉, TaqMan 프로브를 이용하는 경우, TaqMan 프로브 염기서열과 상보적인 표적 핵산 염기서열에 결합한 다음, 증폭 과정에서 Taq polymerase의 5'exonuclease 활성에 의하여 TaqMan 프로브에 결합되어 있는 형광물질이 가수분해(hydrolysis)로 탈락되면서 형광신호를 방출한다.

PNA 프로브를 이용하는 경우, PNA 프로브 염기서열과 상보적인 표적 핵산 염기서열에 PNA 프로브가 결합하면서 동시에 PNA 프로브에 결합된 형광물질로부터 형광신호를 방출한다. 반면, PNA 프로브 및 표적 핵산간의 결합이 떨어지거나 결합되지 않으면 구조적 특징에 의하여 형광신호를 방출하지 않는다(도 2 참조).

VHSV 핵산이 포함된 시료는 실시예 1에서 제작된 양성대조군인 VHSV-PO 및 TaqMan 프로브인 VHSV-2MGB 또는 PNA 프로브인 VHSV-PNA를 이용하여 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)에서 증폭반응을 수행하였다. PCR용 반응물의 조성은 다음과 같다; 2X TaqMan qPCR 버퍼(2X qPCR Buffer, 엔지노믹스, 한국) 10㎕, VHSV-2F(forward primer) 및 VHSV-2R(reverse primer) 0.5㎕, 20X SYBR, VHSV cDNA(시료) 1㎕, VHSV-PO(양성대조군인 VHSV DNA) 1㎕ 및 증류수로 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다. 또한 상기 실험에 사용한 TaqMan 프로브의 경우 VHSV-2MGB 1㎕(10pmol), PNA 프로브 VHSV-PNA 0.5㎕(10pmol)을 사용하였다.

상기 PCR용 반응물을 이용하여 도 3의 PCR 조건(Real-time PCR method)에서 실시간 PCR을 수행하였다.

싸이버그린(SYBR)을 이용하여 프라이머의 비율을 대칭(Symmetric) 및 비대칭(Asymmetric)으로 구분하여 진행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 일반적인 대칭 조건보다 PNA 프로브를 이용하는 비대칭 조건에서 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 따라서, VHSV를 검출할 때 PNA 프로브 활용 시 5' exonuclease 활성이 없는 Taq polymerase를 사용하지 않아도 되며, 충분히 프라이머의 비대칭만으로도 VHSV의 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.

실시예 3: VHSV의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 이용한 증폭곡선 및 용해곡선의 분석

VHSV 핵산이 포함된 시료는 실시예 1에서 제작된 양성대조군인 VHSV-PO 및 TaqMan 프로브인 VHSV-2MGB 또는 PNA 프로브인 VHSV-PNA를 이용하여 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)에서 증폭반응 후, 융해곡선 분석을 수행하였다.

PCR용 반응물의 조성은 다음과 같다; 2X TaqMan qPCR 버퍼(2X qPCR Buffer, 엔지노믹스, 한국) 10㎕과 2X qPCR 프리믹스(2X qPCR PreMix, 시선바이오머티리얼스, 한국), VHSV-2F(forward primer) 및 VHSV-2R(reverse primer) 0.5㎕, TaqMan 프로브 1㎕, VHSV-PO(양성대조군인 VHSV DNA) 1㎕, VHSV-PNA 0.5㎕ (10pmol), 증류수 7㎕를 첨가하여 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다.

상기 PCR용 반응물을 이용하여 도 5의 PCR 조건(Real-time PCR method)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR 과정은 95℃에서 15분간 변성시킨 다음, 95℃에서 15초, 50℃에서 40초, 72℃에서 20초 동안 반응시켰으며, 이를 40 cycle 반복하였다. 또한, 동시에 PNA 프로브를 통한 융해곡선 분석을 위하여 30℃에서 80℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하였고, 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다.

증폭곡선 및 융해곡선 분석 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TaqMan 프로브의 경우 실제 VHSV 시료(target DNA) 및 양성대조군인 VHSV-PO(VHSV DNA, positive-2 control) 모두에서 증폭곡선을 확인할 수 있었으나, TaqMan 프로브의 구조적 특징으로 인하여 융해곡선 분석은 불가능하였다.

한편, TaqMan 프로브의 경우 유전자 증폭 후반에 NTC(Negative control, 증류수)에서 증폭곡선을 나타내었다. 이는 TaqMan 프로브의 안정성(stability) 및/또는 프로브의 짧은 염기서열에 의한 프로브 결합력(affinity)이 존재하여 발생된 결과일 수 있다. 따라서, TaqMan 프로브를 사용했을 때, 상기와 같은 결과가 나오면 실제 VHSV 시료(target DNA)의 농도가 반영된 양성(true positive)인지, TaqMan 프로브의 구조적 문제에 따른 위양성(false positive)인지를 판별할 수 없는 단점을 가지고 있다.

반면, PNA 프로브의 경우 증폭곡선에서 실제 VHSV 시료(target DNA)와 VHSV-PO(양성대조군인 VHSV DNA, positive-2 control)에서 모두 증폭곡선이 나타나는 것을 확인하였다.

특히, 융해곡선 분석을 통하여 실제 VHSV 시료(target DNA)와 VHSV-PO(양성대조군인 VHSV DNA, positive-2 control)의 융해온도가 달라 양성대조군의 오염 여부를 융해곡선 온도로 판별이 가능하였다. 아울러, PNA 프로브를 이용한 증폭곡선 분석 시 NTC(negative control)의 증폭곡선은 나타내지 않아, 융해곡선 분석에서 융해온도의 확인만으로도 VHSV 시료의 위양성 여부를 판별할 수 있었다.

실시예 4: VHSV의 검출 융해온도에 따른 VHSV 및 양성대조군의 판별

실시예 2 및 실시예 3의 결과를 토대로 실제 VHSV 시료와 양성대조군을 판별할 수 있는 PNA 프로브의 Melting peak 융해온도(Melting temperature, Tm) 범위를 지정하고, 판정표로 표 2에 나타내었다.

즉, 융해온도의 Tm값으로 실제 VHSV 시료와 양성대조군을 판별할 수 있으며, 만약 실제 VHSV 시료와 양성대조군이 서로 혼합되는 오염이 발생할 경우 표 2의 판정표를 근거로 그 진위 여부를 판가름할 수 있다.

표 2는 VHSV 검출 및 양성대조군 판별용 PNA 프로브의 융해온도 범위에 따른 VHSV 판정표를 나타낸 것이다.

시료	Tm (℃)
VHSV	60.5 ~ 63.5
양성대조군(VHSV-PO)	53.5 ~ 56.5

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SeasunBio Materials <120> Development of real-time PCR using PNA probe for detection of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) and Uses Thereof <130> P16-B030 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV-2F <400> 1 atgaggcagg tgtcggagg 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV-2R <400> 2 tgtagtagga ctctcccagc atcc 24 <210> 3 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV-2MGB <400> 3 ctgagcattc atgaggcagg tgtcggaggc gcggtccatc caagagcgat acgccatcat 60 gacgagtcgg atgctgggag agtcctacta cactgagcat tc 102 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV-2MGB <400> 4 tacgccatca tgatgagt 18 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV-PNA <400> 5 tacgccatca tgatg 15

Claims

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다음 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 위양성 판별 방법:
(a) 시료에서 추출된 표적 핵산에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 핵산을 혼합하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 증폭하는 단계
(b) 상기 증폭된 핵산과 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계; 및
(c) 상기 혼성화시킨 산물의 융해곡선을 분석하여, 융해온도가 53.5℃ 내지 56.5℃ 사이이면 양성대조군이 존재하고, 60.5℃ 내지 63.5℃ 이면 VHSV가 존재하는 것으로 판별 또는 검출하는 단계.
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