KR101911220B1 - 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법 - Google Patents

돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 감별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR(Non-coding region) 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 특이적으로 검출가능한 PNA 프로브와, 상기 프로브 및 융해곡선 분석을 이용하여 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지를 감별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한 감별방법을 이용하면, 돼지열병 바이러스 백신주 감염 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지를 신속하고 정확하게 감별할 수 있으며, 백신주와 야외주가 복합감염된 개체도 명확하게 구분할 수 있는 편리함과 효율성이 있다.

Description

돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 감별방법{PNA probe for Differentiating Recombinant CSFV Vaccinated Swine and Wild Type CSFV Infected Swine, and Differeanting Method Using Thereof}
본 발명은 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 감별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR(Non-coding region) 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 특이적으로 검출가능한 PNA 프로브와, 상기 프로브 및 융해곡선 분석을 이용하여 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지를 감별하는 방법에 관한 것이다.
돼지열병은 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)가 감염되어 고열, 식욕결핍, 설사, 변비, 피부청색증 및 후구마비 등 신경증상 등을 보이다 결국 폐사하는 바이러스성 전염병이다. 한번 발생하면 치료방법이 없고 감염된 돼지는 전부 죽게 되는 돼지의 질병으로서, 셰계동물보건기구(OIE)에서 축산물 국제교역상 중요하게 취급해야 하는 전염병으로 분류하고 있고, 국내에서도 가축전염병예방법에서도 제1종 가축전염병으로 취급하는 악성 전염병이다. 돼지열병 병원체는 플라비비리대과(Flaviviridae family)의 페스티바이러스속(Pestivirus genus)에 속하는 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)로서, 그 감염 경로는 주로 소화기와 호흡기이고, 침입한 바이러스는 편도, 림프절, 실질장기의 세포 등에서 증식하며 바이러스 혈증을 일으킨다. 임신돈에 감염될 경우 혈류를 통해 태반 감염이 일어난다. 임신시기에 따라 유산, 면역관용위축돈 등이 태어나 바이러스 전파원이 되기도 한다. 또한, 병든 돼지의 분변, 타액 등으로 많은 양의 바이러스가 배출된다. 돼지열병은 감염돼지의 이동, 차량, 축산도구, 사람(신발, 의복) 등 다양한 경로를 통하여 전파되는데, 이와 같은 돼지열병이 발생할 경우 양돈업의 생산성 저하 및 경제적 피해를 야기시킨다. 이러한 돼지열병 바이러스의 감염 예방을 위해 국내에서 사용되고 있는 돼지열병 바이러스 백신은 1976년부터 사용된 약독화 생백신인 LOM 균주로, 유일하게 국내제조업체에서 제조되어 전량 관납으로 전국적으로 사용되고 있다.
돼지열병 바이러스 감염을 확인하기 위한 방법으로, 현재는 주로 유전자증폭법(PCR) 후 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)를 사용하고 있다. RFLP의 경우 절단 효소의 활성 및 반응 시간에 따른 많은 변수가 작용하며, 최종 결과를 사람의 육안에 의존하기 때문에 결과를 분석하는데 있어서 오류가 발생할 수 있다. 따라서 백신주, 특히 LOM주와 야외주를 정확한 결과로 기계에서 판독할 수 있는 방법이 절실히 요구된다. 또한, 개체 특이적으로 백신주와 야외주가 동시에 감염되었을 경우 이를 확인하기 위하여 많은 비용과 시간이 소모된다는 단점이 있다.
PNA는 Peptide nucleic acids의 약자로, LNA(Locked nucleic acid), MNA (Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 폴리아마이드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 훨씬 우수하여 1개의 염기변이(nucleotide miss match)에도 융해온도(Tm)가 10~15℃가량 차이나게 된다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 단일염기서열변이(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 및 삽입/결실(Insertion/Deletion)에 의한 염기변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브의 염기서열과 이에 상보적으로 결합하는 DNA 염기서열의 차이에 따라서 Tm 값이 변화하기 때문에, 이를 이용한 어플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 택맨 프로브(TaqMan probe)의 가수분해 방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 비콘 프로브(molecular beacon probe), 또는 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
혼성화 방법의 분석 방법으로는 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용하며, FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 융해온도(Tm)로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9~15 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 Tm 값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm 값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브의 염기서열에 변화를 주어 Tm 값을 조절할 수 있다.
또한, PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm 값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하므로, 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다는 장점이 있다. 기존의 HRM(High resolution melting) 방법은 Tm 값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어, 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 염기서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 다수의 SNP 분석이 가능하다.
PNA 프로브를 이용한 SNP 분석을 위해서는 우선 SNP를 포함하는 부분의 염기를 이용한 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향 프라이머 세트이면 충분하다. PCR 조건은 기존의 사용하던 그대로 사용 가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 1℃ 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm 값을 얻는다. 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치를 통해 분석할 수 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
돼지열병 바이러스 백신주와 야외주를 구별할 수 있는 5'NCR 유전자 상의 특정 SNP를 검출하기 위한 최적화된 분석 방법은 액상형 MeltingArrayTM 방법으로, 표적핵산의 단일염기서열변이(SNP) 및 삽입 또는 결실에 의한 염기변화를 효과적으로 검출할 수 있으며, 리포터(repoter) 및 소광자(quencher)가 결합된 프로브를 이용함으로써 혼성화 과정 후 세척하는 과정과 프로브를 판형에 고정시킬 필요가 없는 액상형 어레이 방법이다.
이에, 본 발명자들은 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus)에 속하는 다양한 돼지열병 바이러스 균주(strain)들의 5'NCR 유전자 부위에 존재하는, 백신주와 야외주를 구분지을 수 있는 특정 SNP의 존재 유무에 따라 PNA 프로브가 표적 핵산과 완전 혼성화 또는 불완전 혼성화를 하도록 PNA 프로브를 설계하였다. 상기 PNA 프로브를 표적 핵산과 반응시킨 후, PNA 프로브가 표적 핵산과 완전 혼성화(perfact match)되었는지 또는 불완전 혼성화(mismatch)되었는지에 따라 융해 온도에 차이가 생김을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR(Non-coding region) 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 특이적으로 검출가능한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 PNA 프로브를 포함하는 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 PNA 프로브를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP를 특이적으로 검출가능한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브를 제공한다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는, 플라비비래대 페스티바이러스 5' NCR 유전자의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 PNA 프로브를 포함하는 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP를 특이적으로 검출가능한 PNA 프로브를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법을 제공한다.
본 발명에 따른 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한 감별방법을 이용하면, 돼지열병 바이러스 백신주 감염 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지를 신속하고 정확하게 감별할 수 있으며, 백신주와 야외주가 복합감염된 개체도 명확하게 구분할 수 있는 편리함과 효율성이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 PNA 프로브의 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR 유전자 내 결합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 돼지열병 바이러스 백신주 4가지(LOM, DS-S, N-S, K-S) 및 돼지열병 바이러스 야외주 4가지(ALD, CW, KPM, NS)의 유전자 증폭 조건을 나타낸 그래프이다.
도 3은 돼지열병 바이러스 백신주 4가지(LOM, DS-S, N-S, K-S) 및 돼지열병 바이러스 야외주 4가지(ALD, CW, KPM, NS)의 유전자 증폭 결과를 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도 4는 돼지열병 바이러스 전체 33개 시료(백신주 12가지, 야외주 19가지, BVDV44-1, 및 BVDV723)의 융해곡선 분석 조건을 나타낸 그래프이다.
도 5는 돼지열병 바이러스 전체 33개 시료(백신주 12가지, 야외주 19가지, BVDV44-1, 및 BVDV723)의 융해곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 돼지열병 바이러스 복합감염주(LOM주+ALD주, LOM주+HMS주, LOM주+NS주)의 융해곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우 일어나거나(완전 혼성화, perfect match) 또는 일부 부정합 염기가 존재하여도 일어날 수 있다(불완전 혼성화, mismatch). 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus)의 5'NCR 유전자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트와, 플라비비리대 페스티바이러스에 속하는 돼지열병 바이러스(CSFV)의 백신주와 야외주를 구분짓게 하는 5'NCR 유전자 상의 126번째 염기, 133번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 PNA 프로브를 제작하여 PCR을 수행한 결과, PNA 프로브와 표적 핵산 간의 융해온도가 백신주 또는 야외주 여부에 따라 다르게 나타나 둘 간의 구분이 가능한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus) 5'NCR(Non-coding region) 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 특이적으로 검출가능한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브에 관한 것이다. 상기 돼지열병 바이러스 백신주는 바람직하게는 국내백신주인 LOM주(NCBI No. EU789580.1) 이다. 상기 PNA 프로브는 상기 5'NCR 유전자의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는, 서열번호 3의 염기서열을 갖는다. 상기 PNA 프로브의 크기는 8~20 mer 정도가 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 비용 등을 고려하여 적절한 범위 내에서 조절할 수 있다.
돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)의 여러 균주(strain)들은 모두 플라비비리대과 페스티바이러스속에 속하여 염기 서열이 서로 상당 부분 동일하나, 돼지열병 바이러스 백신주와 돼지열병 바이러스 야외주 간에는 5'NCR 부위에 속하는 일부 염기 서열에 차이가 있다. 특히 돼지열병 바이러스 야외주의 경우 126번째 염기가 T에서 G로, 133번째 염기가 T에서 C로 치환된 SNP가 존재하는데, 돼지열병 바이러스 백신주(LOM주)의 5'NCR의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열에 완전 혼성화(perfect match)되도록 설계된 본 발명에 따른 PNA 프로브는 돼지열병 바이러스 야외주의 126번째 염기와 133번째 염기에서는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어, 상기 PNA 프로브와 표적핵산(상기 야외주 또는 백신주의 5'NCR 부위)이 융해될 때의 융해온도(Tm)에 차이가 발생하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 PNA 프로브를 이용한 형광융해곡선 분석을 위해 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자의 형광 물질을 결합하였다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 또는 CY5일 수 있으며, 바람직하게는 HEX를 사용할 수 있다. 또한, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(Black Hole Quencher®-1), BHQ2(Black Hole Quencher®-2), 또는 Dabcyl일 수 있으며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 리포터 및 소광자가 결합된 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브는, 플라비비리대 페스티바이러스에 속하는 돼지열병 바이러스의 5'NCR 유전자와 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 상기 5'NCR 유전자와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광된다. 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주 여부를 판별할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 PNA 프로브를 포함하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머 세트를 더 포함하여, 표적 핵산인 돼지열병 바이러스 5'NCR 유전자를 증폭시키거나 본 발명에 따른 PNA가 결합된 표적 핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 키트는 전술한 융해곡선 분석을 통해 돼지열병 바이러스 백신주 접종 여부, 야외주 감염 여부, 또는 상기 백신주 및 야외주의 복합감염 여부를 판별하는 데 사용된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자의 126번째 염기위치 및 133번째 염기위치의 SNP를 특이적으로 검출가능한 PNA 프로브를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 야외주 감염 돼지의 감별방법은, (a) 검체 시료에 포함된 표적 핵산인 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자를 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 유전자를 상기 PNA 프로브와 혼합하여, PNA 프로브와 플라비비리대 페스티바이러스 유전자를 혼성화시키는 단계; (c) 온도를 변화시키면서 상기 (b) 단계에서 혼성화시킨 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 돼지열병 바이러스 백신주 접종 여부, 야외주 감염 여부, 또는 상기 백신주 및 야외주의 복합감염 여부를 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (a) 단계의 표적 핵산인 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자는 바람직하게는 돼지열병 바이러스 5'NCR 유전자이고, 상기 돼지열병 바이러스는 백신주이거나 야외주일 수 있다. 상기 돼지열병 바이러스를 포함하는 검체 시료는 돼지의 혈액뿐만 아니라 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계의 표적 핵산인 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자는 PCR 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킴으로써 준비될 수 있고, 상기 증폭에 사용되는 PCR 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계의 PNA 프로브는 전술한 바와 같이 상기 유전자의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는, 서열번호 3의 염기서열을 가진다. 상기 PNA 프로브는 전술한 바와 같이, 리포터 및 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 (d) 단계의 융해곡선 분석에 따른 판별은, 상기 얻어지는 융해곡선의 융해피크가 61.5~65.5℃에 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주가 존재하는 것으로 판정하고, 융해피크가 50.5~54.5℃에 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 야외주가 존재하는 것으로 판정하며, 융해피크가 61.5~65.5℃ 및 50.5~54.5℃에 모두 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주가 모두 존재하는 것으로 판정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 PNA 프로브가 돼지열병 바이러스 백신주의 5'NCR 부위의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열과 완전 혼성화하게 되면 PNA-DNA 간의 강한 결합력으로 인해 융해 온도가 60~70℃정도로 높게 나타나고, 돼지열병 바이러스 야외주의 5'NCR 부위의 126번째 염기 및 133번째 염기를 포함하는 염기서열과 불완전 혼성화하게 되면 완전 혼성화된 경우보다 낮은 50~60℃의 온도에서도 쉽게 융해되어, 이러한 융해온도 차이를 분석하여 돼지열병 바이러스 백신주 감염 개체인지 또는 야외주 감염 개체인지를 감별할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[ 실시예 1] 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주 판별용 PNA 프로브의 제조
농림축산검역본부에 보관중인 돼지열병 바이러스 표준균주 31개(하기 표 2 참조)의 유전자 증폭을 진행하기 위해, 페스티바이러스(pestivirus) cDNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하기 위한 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus)의 5'NCR 유전자 프라이머 세트로, 특히 돼지열병 바이러스의 5'NCR 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 1세트를 제작하였다(표 1, 서열번호 1 및 2). 또한, 돼지열병 바이러스 백신주와 야외주의 구별이 가능한 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자 부위의 염기서열을 분석하고, 분석된 염기서열의 비교를 통해 유의성을 보이는 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 찾은 다음, 해당위치에 혼성화하는 프로브를 제작하였다(표 1, 서열번호 3).
유전자 타입 명명 서열
5'NCR SNP 5NCR-F 5'-TAGCCATGCCCGCAGTAGG-3' (서열번호 1)
5NCR-R 5'-TAGCTTCAGTGTTGATTGT-3' (서열번호 2)
CSFV5-1 Dabcyl-CCT CGA TAT GCT ATG TG-O-K (HEX) (서열번호 3)
* O: 링커, K: 라이신(lysine)
먼저, 본 발명의 PNA 프로브는 돼지열병 바이러스 백신주(LOM주) 및 야외주의 감별을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 또한, 표적핵산과의 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
돼지열병 바이러스 야외주의 경우 단일염기변이로 인한 불완전한 혼성화가 이루어지기 때문에 융해온도 차이가 발생하게 되며, 염기의 변이 부분은 보통 표적핵산과 5℃ 이상 융해온도(Tm) 차이가 나도록 PNA 프로브 결합 부위 가운데에 위치하도록 설계하지만, 융해온도의 최적화를 위해 표적핵산과 PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 중앙 부분에 5'NCR 유전자 염기서열과 본 발명의 PNA 프로브의 상보적 결합이 일어날 수 있도록 제작하였다.
도 1에는 돼지열병 바이러스 백신주와 야외주를 구분짓게 하는 플라비비리대 페스티바이러스 5'NCR 유전자 부위 내 특이 SNP의 위치(126번째 염기, 133번째 염기) 및 PNA 프로브가 혼성화하는 위치를 나타내었으며, 각 염기 번호는 상기 5'NCR 유전자의 PCR 산물 크기(size)를 기준으로 작성하였다. 마지막으로 PNA 프로브가 백신주인 LOM주의 5'NCR과 완전한 혼성화(Perfect match)를 이루도록 유도하여 제작하였다.
[ 실시예 2] 돼지열병 바이러스 유전자 염기변이에 따른 융해곡선 분석
표적 핵산을 증폭시키기 위한 증폭 조건을 설정하기 위해, cDNA 형태로 돼지열병 바이러스 백신주 4가지(LOM(서열번호 4), DS-S, N-S, K-S), 돼지열병 바이러스 야외주 4가지(ALD(서열번호 5), CW(서열번호 6), KPM(서열번호 7), NS(서열번호 8))를 이용하여 하기와 같이 유전자 증폭 조건을 확립하였다.
상기 4가지의 돼지열병 바이러스 백신주 및 4가지의 돼지열병 바이러스 야외주의 이중가닥 DNA(표적핵산)와, 실시예 1에서 합성한 프라이머 및 PNA 프로브를 혼합한 다음, CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 PCR 증폭 및 MeltingArrayTM 방법을 이용한 융해곡선 분석을 수행하였다. PCR의 조건은 다음과 같다; 2X 시선바이오 리얼타임 FMCA 버퍼(SSB FMCAqPCR™ buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 10㎕, 실시예 1에서 제작된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 0.5㎕, 합성된 표적 핵산 DNA 1㎕, 증류수 7㎕를 첨가하여 총 볼륨이 20㎕가 되도록 한 다음 실시간 PCR(real-time PCR)을 실시하였다. 실시간 PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 30초 동안 반응시켰으며, 이를 30 싸이클 반복하였다(도 2). 상기와 같은 방법으로 수행한 PCR 증폭 산물을 전기영동을 통해 확인한 결과, 420bp의 산물을 얻을 수 있었다(도 3).
상기 결과를 토대로 전체 33개의 시료(돼지열병 백신주 12개, 돼지열병 야외주 19개, BVDV44-1, BVDV723)를 사용하여, 상기와 같은 방법으로 PCR을 통한 유전자 증폭을 수행하였다(도 2). BVDV44-1 균주와 BVDV723 균주의 경우 특이도(specificity) 검증을 위하여 실험에 사용하였다.
표적 핵산의 단일가닥화, PNA 프로브와의 혼성화 및 융해곡선 분석을 위하여, 상기 증폭된 산물 5㎕, 시선바이오 2X MeltingArray Buffer (2X MeltingArray Buffer, 시선바이오머티리얼스, 한국) 11㎕, 실시예 1에서 제작된 PNA 프로브 각 2종 0.5㎕, 증류수 3.5㎕를 혼합하여 구획화된 어레이(well plate)에 분주한 후 실시간 중합효소 연쇄반응기 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD 사, 미국)에서 37℃에서 30분 동안 단일가닥 반응을 진행한 후 PNA 프로브의 혼성화 반응을 통하여 연속적으로 융해곡선을 분석하였다. 융해곡선 분석은 20℃에서 85℃까지 1.0℃씩 상승시키며 형광을 측정함으로써 수행되었다. 각 단계 사이마다 0.5초간 정지 상태를 유지하였고(도 4), 결과 분석시 하나의 튜브에서 실험하여 분석을 진행하였다(도 5).
샘플 번호가 부여된 33개의 시료에 대한 융해곡선을 분석할 때, 융해곡선의 피크(융해피크)에 해당하는 온도를 융해온도(Melting Temperature, Tm)로 하였고, 각각의 시료에 대한 융해온도(Tm)를 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 각각의 검체 시료가 돼지열병 바이러스 백신주인지 또는 야외주인지 여부와, 그 서브타입(subtype)을 함께 표기하였다. 표 2의 백신주 중 LOM(서열번호 4)은 국내용 돼지열병 바이러스 백신주로서 농림축산검역본부에서 최초 개발한 LOM주이고 , 백신주 중 DS -S, N-S, K-S는 백신 제조업체에서 상기 농림축산검역본부에서 개발한 LOM주 를 이용하여 제조한 후 상품화하여 판매하고 있는 백신주이다.
N 균주(strain) 바이러스 유형 융해온도(℃)
1 LOM 백신주 64
2 ALD 야외주 53
3 DS-S 백신주 64
4 CJA 야외주 64
5 DS-C 백신주 64
6 K-S 백신주 64
7 K-C 백신주 64
8 C-S 백신주 63
9 C-C 백신주 64
10 N-S 백신주 64
11 N-C 백신주 64
12 K-S 백신주 64
13 K-C 백신주 64
14 GPE- 야외주 52
15 CW 야외주 52
16 HMS 야외주 52
17 YC 야외주 53
18 NGW 야외주 53
19 KJH 야외주 52
20 KPM 야외주 52
21 CSS 야외주 52
22 KSB 야외주 52
23 MBG 야외주 52
24 YJB 야외주 52
25 YCW 야외주 53
26 NS 야외주 52
27 JJ 야외주 52
28 97009 야외주 51
29 98614 야외주 52
30 9908 YI 야외주 51
31 9903 YI 야외주 51
32 BVDV 44-1 - non detection
33 BVDV 723 - 42
각 검체 시료의 융해온도를 확인한 결과, 돼지열병 바이러스 백신주는 융해온도의 범위가 63~64℃에 모두 포함되었으며, 돼지열병 바이러스 야외주의 경우 백신주 보다 낮은 51~53℃ 범위의 융해온도를 나타내었다.
[ 실시예 3] PNA 프로브를 이용한 돼지열병 바이러스 백신주와 야외주의 복합 감염 여부 확인
실시예 1에서 제적한 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주 판별용 PNA 프로브를 이용하여, 개체 특이적으로 발생되는 복합감염(백신주+야외주) 개체의 감별이 가능한지 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
돼지열병 바이러스 백신주와 야외주의 복합감염 확인을 위하여, 33개의 시료 중 백신주인 LOM 균주를 기준으로 야외주 ALD, HMS, NS를 각기 1ng/㎕씩 혼합한 후, 실시예 2와 동일한 유전자 증폭 방법과 증폭 조건, 동일한 프라이머 및 PNA 프로브를 이용하는 PCR을 통해, 각각에 대한 융해곡선 분석을 진행하였다(도 6).
LOM주+ALD주, LOM주+HMS주, LOM주+NS주에 대한 융해곡선 분석 결과, 각각의 융해곡선에 대하여 2개의 융해피크, 즉 2개의 융해온도가 나타났으며, 백신주(LOM주)의 경우 63~64℃ 범위 내에서, 야외주(ALD, HMS, 또는 NS주)의 경우 52~53℃의 범위 내에서 융해피크가 형성됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석을 통해 돼지열병 바이러스 백신주와 야외주의 복합감염 여부를 신속하고 효율적으로 판별할 수 있다.
[ 실시예 4] 염기변이와 융해온도에 따른 돼지열병 바이러스 구분
실시예 2 및 3에서 PNA 프로브를 이용하여 수행된 융해곡선 분석 결과로 얻어진 융해온도(Tm) 값을 바탕으로, 돼지열병 바이러스 백신주 감염 개체, 야외주 감염 개체, 또는 복합감염 개체의 구분이 가능한 판정표를 하기 표 3과 같이 작성하였다. 융해온도의 범위는 실시예 2 및 3의 실험 결과로 얻어진 백신주와 야외주 융해온도의 ±2℃로 계산하여 정하였다.
판정 융해온도(℃)
백신주 61.5~65.5
야외주 50.5~54.5
복합감염주(백신주+야외주) 61.5~65.5
50.5~54.5
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> PNA probe for Differentiating Recombinant CSFV Vaccinated Swine and Wild Type CSFV Infected Swine, and Differeanting Method Using Thereof <130> YPD201512-0020 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5NCR-F <400> 1 tagccatgcc cgcagtagg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5NCR-R <400> 2 tagcttcagt gttgattgt 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSFV5-1 <400> 3 cctcgatatg ctatgtg 17 <210> 4 <211> 421 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOM 5'NCR <400> 4 ctagccatgc ccgcagtagg actagcaaac ggagggacta gccgtagtgg cgagctccct 60 gggtggtcta agtcctgagt acaggacagt cgtcagtagt tcgacgtgag cagaagccca 120 cctcgatatg ctatgtggac gagggcatgc ccaagacaca ccttaaccct agcgggggtc 180 gctagggtga aatcacacca cgtgatggga gtacgacctg atagggtgct gcagaggccc 240 actattaggc tagtataaaa atctctgctg tacatggcac atggagttga atcattttga 300 acttttatac ggaacaaaca aacaaaaacc aaagggagtg gaggaaccgg tatacgatgc 360 cacggggaaa ccattgtttg gagacccgag tgaggtacac ccacaatcaa cactgaagct 420 a 421 <210> 5 <211> 421 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALD 5'NCR <400> 5 ctagccatgc ccacagtagg actagcaaac ggagggacta gccgtagtgg cgagctccct 60 gggtggtcta agtcctgagt acaggacagt cgtcagtagt tcgacgtgag cagaagccca 120 cctcgatatg ctatgtggac gagggcatgc ccaagacaca ccttaaccct agcgggggtc 180 gctagggtga aatcacacca cgtgatggga gtacgacctg atagggtgct gcagaggccc 240 actattaggc tagtataaaa atctctgctg tacatggcac atggagttga atcattttga 300 acttttatac aaaacaaaca aacaaaaacc aatgggagtg gaggaaccgg tatacgatgc 360 cacggggaga ccattgtttg gagacccgag tgaggtacac ccacaatcaa cactgaagct 420 a 421 <210> 6 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CW 5'NCR <400> 6 gcgcggtata cgaggttagc tcgtcctcgt gtacaatatt ggacaaacca aaattccgat 60 ttggcctagg gcacccctcc agcgacggcc gaactgggct agccatgccc acagtaggac 120 tagcagacgg agggactagc cgtagtggcg agctccctgg gtggtctaag tcctgagtac 180 aggacagtcg tcaatagttc gacgtgagca ggagcccacc tcgagatgct atgtggacga 240 gggcatgccc aagacacacc ttaaccctgg caggggtcgc cagggtgaaa tcacaccatg 300 tgatgggagt acgacctgat agggtgctgc agaggcccac taacaggcta gtataaaaat 360 ctctgctgta catggcacat ggagttgaat cattttgaac tattatacaa aacaaacaaa 420 caaaaaccga tgggagtgga ggaaccggtg tacgacatcg cagggagacc attatttggg 480 gacccaagtg aggtacaccc acaatcaaca ctgaagcta 519 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPM 5'NCR <400> 7 cggagggact agccgtagtg gcgagctccc tgggtggtct aagtcctgag tacaggacag 60 tcgtcaatag ttcgacgtga gcaggagccc acctcgagat gctatgtgga cgagggcatg 120 cccaagacac accttatccc tggcgggggt cgccagggtg aaatcacacc atgtgatggg 180 ggtacgacct gatagggtgc tgcagaggcc cactaacagg ctagtataaa aatctctgct 240 gtacatggca catggagttg aatcattttg aactattata caaaacaaac aaacaaaaac 300 cgatgggagt ggaggaaccg gtgtatgaca tcgcagggaa accattattt ggggaccc 358

Claims (19)

  1. 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus)에 속하는 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)의 5' NCR(Non-coding region)에 상보적으로 결합하는 서열번호 3으로 표기되는 PNA 프로브(Peptide Nucleic Acid Probe)를 포함하는 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트로서,
    상기 키트는 돼지열병 바이러스의 표적 핵산을 핵산의 증폭반응으로 증폭시킨 표적 핵산의 산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시킨 후, 온도를 변화시키면서 상기 혼성화시킨 산물을 융해시켜 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 돼지열병 바이러스 백신주 접종 여부, 야외주 감염 여부, 또는 상기 백신주 및 야외주의 복합감염 여부를 판별하고,
    상기 판별은, 상기 얻어지는 융해곡선의 융해피크가 61.5~65.5℃에서 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주가 존재하는 것으로 판정하고, 융해피크가 50.5~54.5℃에서 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 야외주가 존재하는 것으로 판정하며, 융해피크가 61.5~65.5℃ 및 50.5~54.5℃에서 모두 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주가 모두 존재하는 것으로 판정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 및 CY5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, 및 Dabcyl로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산의 증폭반응은 PCR(polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1로 표기되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표기되는 역방향 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 동시 판별용 키트.
  9. 삭제
  10. 플라비비리대 페스티바이러스(Flaviviridae pestivirus)에 속하는 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)의 5' NCR(Non-coding region)에 상보적으로 결합하는 서열번호 3으로 표기되는 PNA 프로브(Peptide Nucleic Acid Probe)를 이용하여 얻어지는 융해곡선 분석을 통한, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법으로서,
    (a) 검체 시료에 포함된 것으로 추정되는 돼지열병 바이러스의 표적 핵산을 핵산 증폭반응으로 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 증폭시킨 표적 핵산의 산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계;
    (c) 온도를 변화시키면서 상기 (b) 단계에서 혼성화시킨 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻어지는 융해곡선 분석을 통해 돼지열병 바이러스 백신주 접종 여부, 야외주 감염 여부, 또는 상기 백신주 및 야외주의 복합감염 여부를 판별하는 단계를 포함하고,
    상기 판별은, 상기 얻어지는 융해곡선의 융해피크가 61.5~65.5℃에서 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주가 존재하는 것으로 판정하고, 융해피크가 50.5~54.5℃에서 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 야외주가 존재하는 것으로 판정하며, 융해피크가 61.5~65.5℃ 및 50.5~54.5℃에서 모두 나타나면 검체 시료 내에 돼지열병 바이러스 백신주 및 야외주가 모두 존재하는 것으로 판정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산 증폭반응은 PCR(polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산 증폭반응은 PCR 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1로 표기되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표기되는 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  14. 삭제
  15. 제11항에 있어서, 상기 PCR은 95℃에서 10분간 가열하는 단계, 및 30사이클로 95℃에서 30초간 가열하고 55℃에서 40초간 가열하며 72℃에서 30초간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계의 PNA 프로브는 리포터 및 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 및 CY5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, 및 Dabcyl로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
  19. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 혼성화시키는 단계는 상기 증폭시킨 표적 핵산의 산물을 37℃에서 30분간 단일가닥 반응을 진행한 후 상기 PNA 프로브와 순차적으로 95℃에서 10분간 가열하고, 65℃에서 60초간 가열한 후, 55℃에서 60초간 가열하고, 45℃에서 60초간 가열한 다음, 20℃로 냉각한 후 5초간 유지하여 상기 표적 핵산의 산물과 상기 PNA 프로브가 혼성화된 산물을 얻는 것이고,
    상기 (c) 단계의 융해곡선을 얻는 단계는 상기 혼성화된 산물을 20℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시켜 융해시키되, 1℃씩 상승시키는 각 단계마다 0.5초간 유지하여 융해곡선을 얻는 것임을 특징으로 하는, 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별방법.
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