KR102532166B1 - 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102532166B1 KR102532166B1 KR1020220040883A KR20220040883A KR102532166B1 KR 102532166 B1 KR102532166 B1 KR 102532166B1 KR 1020220040883 A KR1020220040883 A KR 1020220040883A KR 20220040883 A KR20220040883 A KR 20220040883A KR 102532166 B1 KR102532166 B1 KR 102532166B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- swine fever
- fever virus
- nucleotide sequence
- seq
- virus
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 131
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 title abstract description 79
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 title abstract description 57
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 claims abstract description 312
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 248
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 claims abstract description 155
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 86
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 58
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 252
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 252
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 84
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 79
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 79
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 75
- 241000702665 Porcine rotavirus Species 0.000 claims description 32
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 30
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 20
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims description 16
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 claims description 16
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 claims description 16
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 claims description 16
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 11
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 11
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims description 4
- 241001333903 Sapelovirus A Species 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 130
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 34
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 31
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 31
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 26
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 24
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 23
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 22
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 16
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 5
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical group C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 241000212749 Zesius chrysomallus Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000211 Abortions and stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 241000977261 Asfarviridae Species 0.000 description 1
- 241001533466 Asfivirus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N N-(1-naphthyl)ethylenediamine Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1 NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 208000021090 palsy Diseases 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 구체적으로 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 마커 유전자들을 동시에 특이적으로 증폭시켜 증폭산물을 생성하는 프라이머 세트와 상기 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 올리고머 프로브 세트, 이를 함유하는 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용하여 돼지열병을 유발하는 바이러스를 검출 또는 판별하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 구체적으로 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 마커 유전자들을 동시에 특이적으로 증폭시켜 증폭산물을 생성하는 프라이머 세트와 상기 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 올리고머 프로브 세트, 이를 함유하는 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용하여 돼지열병을 유발하는 바이러스를 검출 또는 판별하는 방법에 관한 것이다.
돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)는 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health: OIE)에서 근절해야 할 주요 질병 원인바이러스로 취급되고 있으며, 대한민국에서는 가축전염병 1종으로 분류되는 관리대상질병의 원인체이다. 돼지열병바이러스는 모든 연령의 멧돼지과 동물을 감염시킬 수 있으며, 감염 시 40℃ 이상의 고열, 후구마비, 귀 및 체내 붉은반점, 설사/변비, 호흡기 질환 등의 임상증상과, 돼지들의 군집 현상을 야기하며, 돼지열병바이러스에 감염된 임신모돈은 유·사산을 유발하고 감염된 자돈 및 모돈의 치사율이 거의 100%에 이른다.
1976년부터 대한민국에서 사용된 항-돼지열병바이러스 백신(돼지열병 백신)으로는 LOM 백신주를 적용한 백신이 주를 이루며, 이보다 백신 효능이 향상된 본 연구자들이 개발한 돼지열병바이러스 생마커 백신주(CSFV Flc-LOM-BErns)이 양돈 농장에 보급되어 현재 사용되고 있다(Choe et al., Vaccines(Basel), 9(4):381, 2021).
돼지열병바이러스는 플라비비리대과(Family: Flaviviridae)의 페스티바이러스속(Genus: Pestivirus)에 속하는 단일가닥 RNA 바이러스(single- stranded RNA virus)이며, 현재 보편적으로 가축방역기관들에서 사용하는 돼지의 돼지열병바이러스 검사법(검출법)은 핵산 기반 분석법 및 단백질 기반 분석법이 있다.
핵산 기반 분석법의 경우 돼지열병바이러스의 유전자를 증폭시키는 PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소연쇄반응) 기법이 있으며, 이는 돼지열병바이러스에 감염된 것으로 추정되는 돼지의 검체의 핵산을 추출하여 돼지열병바이러스의 UTR(Untranslated region) 유전자 표적부위를 PCR로 증폭하여 PCR 산물이 생성되는 경우 돼지열병바이러스에 감염된 돼지임을 확인할 수 있다. 또한, 상기 PCR 산물을 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법, 즉 특정 유형의 제한효소(예컨대, XhoI)로 처리 시 PCR 산물의 절편 형성 여부에 따라 돼지열병바이러스의 유형(야외주, 백신주 등)을 판별할 수 있다. 다만, RFLP 분석법은 PCR 수행 후 제한효소의 처리 및 겔 상 전기영동(electrophoresis)을 하고, 촬영장치 등을 이용한 분석작업을 해야 하는 수고(시간, 비용 등)로 인해 가축방역기관들에서 기피하는 단점을 가진다.
단백질 기반 분석법의 경우 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 기법이 있으며, 이는 돼지열병바이러스의 항원을 표적으로 하여 돼지의 돼지열병바이러스 감염 여부를 확인할 수 있다. 다만, ELISA는 검체 항원/항체 등의 시료 확보에 소요되는 시간이 길고, PCR 기법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮은 기술에 해당하며, 바이러스 검출감도가 낮아 미량의 돼지열병바이러스를 검출(검출가능한 바이러스 함량: 105.0TCID50/ml 이상)하기는 어려워 위음성 등의 많은 문제점이 지적되고 있다.
아프리카돼지열병바이러스(African Swine Fever Virus: ASFV)는 대한민국에서 가축전염병 1종으로 분류되는 관리대상질병의 원인체이며, 세계동물보건기구에서도 가장 근절해야 할 중요한 바이러스 중 하나로 여기고 있다.
아프리카돼지열병바이러스는 돼지 간 접촉 또는 아프리카돼지열병바이러스를 가진 물렁진드기의 흡혈에 의해 모든 연령의 돼지, 야생멧돼지 등을 감염시켜 돼지열병 등의 임상증상을 나타낸다. 돼지는 아프리카돼지열병바이러스에 감염 시 40℃ 이상의 고열을 주요 증상으로 나타내고, 식욕 결핍과 피부 충혈 증상을 나타내며, 치사율이 매우 높은 것이 주요 특징이다. 돼지에서 아프리카돼지열병바이러스의 잠복기는 약 4~19일로 급성감염일 경우 100% 치사율을 보인다.
아프리카돼지열병바이러스는 아스파바이러스과(Family: Asfarviridae)의 아스파바이러스속(Genus: Asfivirus)에 속하는 170~193kbp의 이중가닥 DNA 바이러스(Double-stranded DNA virus)를 게놈(Genome)으로 가지며, 상기 게놈은 150~167개 ORF(Open reading frame)를 함유하고 있다.
아프리카돼지열병바이러스는 켑시드 단백질(Capsid protein) p72를 엔코딩(Encoding; 암호화)하는 B646L 구조 단백질 유전자의 C-말단 부위(C-terminal region)의 염기서열 변이에 기초하여 24종의 유전자형(Genotype)으로 분류한다. 상기 24종의 유전자형은 모두 사람에게는 감염되지 않으나, 돼지를 감염시키는 현재 전세계적으로 확산 추세의 아프리카돼지열병바이러스 타입은 유전형 II로 고병원성 바이러스에 속한다.
돼지의 아프리카돼지열병바이러스의 검사법(검출법)은 핵산 기반 분석법으로 세계동물보건기구에서 권장하는 바이러스 유전자를 증폭시키는 프라이머 쌍을 사용하고 있고, 이와는 별개로 진단용 시약 제조사마다 바이러스 특이적 프라이머 쌍과 이에 적합한 프로브를 제작하여 실시간 PCR(Real-Time PCR) 기법을 적용하여 방역진단용으로 사용하고 있다.
한편, 종래기술에서는 돼지열병을 유발하는 바이러스를 유형별로 검출/판별하거나, 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 각각 또는 동시에 선별적으로 검출/판별할 수 있는 방법은 개시된 바 없다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 돼지열병을 유발하는 바이러스를 검출 및 판별하기 위해, 돼지열병을 유발하는 바이러스 군에 속하는 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 각각 또는 동시에 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 돼지열병을 유발하는 바이러스 종인 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 LOM 백신주, 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 구분하는 각 바이러스 특유의 유전자 마커에 특이적인 프라이머 세트와, 리포터 및 소광자가 표지된 올리고머 프로브(Oligomer probe) 세트를 실시간 PCR 시 이용하여 바이러스 유형마다 이종(異種) 바이러스와의 교차반응 없이 서로 다른 형광의 증폭곡선을 나타내게 함으로써 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 유형을 각각 또는 동시에 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 선별적으로 검출/판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고머 프로브 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및/또는 아프리카돼지열병바이러스의 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스 각각의 유전자 마커 염기서열에 대한 특이적 유전자 마커 서열단편의 상기 올리고머 프로브 세트의 혼성화(교잡반응, Hybridization) 여부에 따른 바이러스 유형별 증폭곡선(예컨대, 형광의 증폭곡선)에 기초하여 상기 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 검출/판별하거나 돼지의 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 돼지열병을 유발하는 바이러스를 검출 또는 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은,
서열번호 8의 염기서열(5'UTR의 대립인자 G 염기서열, 5'UTR ALLELE G sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 9의 염기서열(5'UTR의 대립인자 T 염기서열, 5'UTR ALLELE T sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 10의 염기서열(BVDV Erns 및 CSFV E1의 부분 염기서열인 BErns-E1 염기서열, BErns-E1 sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열(즉, P72 염기서열의 부분서열인 P72-1 sequence, P72-2 sequence 및 P72-3 sequence 중 하나 이상)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브,
상기 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및
상기 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 5의 염기서열(LOMBERN-P 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 올리고머 프로브로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 1의 염기서열(CSFV-F4 염기서열) 및 서열번호 2의 염기서열(CSFV-R3 염기서열)로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 6의 염기서열(LOMBERN-F1 염기서열) 및 서열번호 7의 염기서열(LOMBERN-R2 염기서열)로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는,
서열번호 20의 염기서열(ASF-P4 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브,
서열번호 21의 염기서열(ASF-P7 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및
서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 올리고머 프로브로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 11의 염기서열(ASF-F4-1 염기서열), 서열번호 12의 염기서열(ASF-F4-2 염기서열), 서열번호 13의 염기서열(ASF-F4-3 염기서열), 서열번호 14의 염기서열(ASF-F4-4 염기서열) 및 서열번호 15의 염기서열(ASF-F4-5 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열), 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열), 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열) 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 유전자 마커 서열단편을 생성시키고, 상기 유전자 마커 서열단편에 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 돼지열병바이러스 유형을 야외주 또는 백신주로 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 아프리카돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 유전자 마커 서열단편을 생성시키고, 상기 유전자 마커 서열단편에 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트와 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키고 아프리카돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편 및 아프리카돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편을 생성시킨 다음,
상기 돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편에 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부와 상기 아프리카돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편에 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출 또는 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스LOM 백신주, 돼지열병바이러스Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주 각각의 특정 유전자 마커 염기서열에 특이적인 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 실시간 PCR 시 이용하여 바이러스 유형마다 이종 바이러스와의 교차반응 없이 서로 다른 형광의 증폭곡선을 나타내게 함으로써 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 검출/판별하고, 돼지의 돼지열병바이러스 및/또는 아프리카돼지열병바이러스의 감염 여부를 선별적으로 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용한 돼지열병바이러스인 CSFV WT(유전자 마커: 5' UTR ALLELE G), CSFV LOM(유전자 마커: 5' UTR ALLELE T) 및 CSFV Flc-LOM-BErns(유전자 마커: BErns-E1)의 검출/판별 방법에 따른 증폭곡선 그래프를 나타낸 것이다(RFU(Relative fluorescence units): 증폭도 및 검출 감도).
도 2는 실시예 1에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용하는 돼지열병바이러스의 검출/판별 방법으로, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용한 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별 방법에 따른 증폭곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용하는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별 방법으로, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용한 돼지열병바이러스의 야외주 및 LOM 백신주와, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 동시 검출/판별 방법에 따른 증폭곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용하는 돼지열병바이러스의 검출/판별 방법으로, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용한 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별 방법에 따른 증폭곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용하는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별 방법으로, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 사용한 돼지열병바이러스의 야외주 및 LOM 백신주와, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 동시 검출/판별 방법에 따른 증폭곡선 그래프를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서, "돼지열병바이러스 야외주(CSFV WT)"는 특별한 언급이 없으면, 야외로부터 감염된 돼지의 돼지열병바이러스주, 바람직하게는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 GenBank에 보관/기록된 GenBank NC_002657.1, GenBank U45477.1 및 GenBank KY290453.1 중 하나 이상의 염기서열을 갖는 돼지열병바이러스 야외주를 지칭할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 백신 기능을 갖는 돼지열병바이러스 백신주인 "돼지열병바이러스 LOM 백신주", "돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주" 등과 구별되는 개념이다.
본 명세서에서, "돼지열병바이러스 LOM 백신주(Classical swine fever virus strain LOM[CSFV LOM]; GenBank EU789580.1)"는 백신 원료인 돼지열병바이러스의 약독화된 바이러스주로 돼지열병바이러스의 Erns 부위를 가진다.
본 명세서에서, "돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주(Genetic recombinant classical swine fever vaccine Flc-LOM-BErns virus[CSFV Flc-LOM-BErns]; GenBank DI183602; 한국미생물보전센터(Korean Culture Center of Microorganisms: KCCM) 수탁번호 KFCC11442P)"는 돼지열병바이러스의 Erns 부위가 소바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus: BVDV)의 Erns로 치환된 유전자 재조합 백신주(NCBI GenBank DI183602)를 의미한다.
본 명세서에서, "아프리카돼지열병바이러스 야외주(ASFV WT)"는 특별한 언급이 없으면, 야외로부터 감염된 돼지의 아프리카돼지열병바이러스주, 바람직하게는 NCBI의 GenBank에 보관/기록된 GenBank NC_001659.2, GenBank MW049116.1, GenBank KC835274.2, GenBank MN537825.1, GenBank MN318203.3 및 GenBank MN537827.1 중 하나 이상의 염기서열을 갖는 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 지칭할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "돼지열병"이란 돼지열병을 유발하는 바이러스에 감염된 돼지의 대표적인 임상증상인 40℃ 이상의 고열증을 의미하는 것으로, 그외, 후구마비, 귀 및 체내 붉은반점, 설사/변비, 호흡기 질환 등의 임상증상이 동반될 수 있다. 돼지열병바이러스 야외주 및/또는 아프리카돼지열병바이러스 야외주에 감염된 돼지는 이와 같은 임상증상을 지속적으로 나타내어 치사율이 매우 높은 반면, 돼지열병바이러스 LOM 백신주 또는 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주를 접종한 돼지는 이와 같은 임상증상을 짧은 기간에만 나타내며 치사율이 매우 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서, "돼지"란 용어는 숫돼지, 암돼지, 수자돈, 암자돈, 임신돼지, 수유 중인 돼지, 임신돼지의 태아 등 모두를 포함하며, 상기 자돈은 3일령 내지 11주령, 바람직하게는 3일령 내지 10일령의 돼지인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “유전자 마커(유전자 표지자, Genetic marker)”란 바이러스 또는 생명체(돼지 등)의 DNA(Deoxyribonucleic acid), RNA(Ribonucleic acid) 등의 핵산으로 이루어진 특정 염기서열을 갖는 유전자 조절 부위(Gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(Gene coding sequence)를 의미하는 것으로, 상기 유전자 부위는 단백질을 엔코딩하는 염기서열, 또는 이와 인접한 염기서열일 수 있다.
본 명세서에서, “올리고머 프로브”는 상기 유전자 마커의 유전자 조절 부위 또는 유전자 부위와 선택적으로 결합하는 상보적 결합 부위 및 염기인식 부위를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역(5'UTR; 5'Untranslated region), 3' 비번역 영역(3'UTR; 3' Untranslated region), 바이러스 팩키징 서열 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 일 양태에서 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 동시에 검출/판별하는 방법을 개발하고자, 바이러스 유형에 따른 특이적 염기서열을 가지는 유전자 마커 및 상기 유전자 마커에 대응되는 바이러스 유형 검출/판별용 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 이용하여 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 및 각 바이러스의 유형(야외주, 백신주 등)을 판별할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
서열번호 8의 염기서열(5'UTR의 대립인자 G 염기서열, 5'UTR ALLELE G sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서,
서열번호 9의 염기서열(5'UTR의 대립인자 T 염기서열, 5'UTR ALLELE T sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
서열번호 10의 염기서열(BVDV Erns 및 CSFV E1의 부분 염기서열인 BErns-E1 염기서열, BErns-E1 sequence)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 검출 또는 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열(즉, P72 염기서열의 부분서열인 P72-1 sequence, P72-2 sequence 및 P72-3 sequence 중 하나 이상)로 표시되는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브,
상기 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및
상기 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 5의 염기서열(LOMBERN-P 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 올리고머 프로브로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트에 관한 것이다.
상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프로브 세트는,
서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 및 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 5의 염기서열(LOMBERN-P 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 올리고머 프로브로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
서열번호 1의 염기서열(CSFV-F4 염기서열) 및 서열번호 2의 염기서열(CSFV-R3 염기서열)로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 6의 염기서열(LOMBERN-F1 염기서열) 및 서열번호 7의 염기서열(LOMBERN-R2 염기서열)로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는, 서열번호 20의 염기서열(ASF-P4 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브, 서열번호 21의 염기서열(ASF-P7 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 올리고머 프로브로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트에 관한 것이다.
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 20의 염기서열(ASF-P4 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합, 또는
서열번호 21의 염기서열(ASF-P7 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
서열번호 11의 염기서열(ASF-F4-1 염기서열), 서열번호 12의 염기서열(ASF-F4-2 염기서열), 서열번호 13의 염기서열(ASF-F4-3 염기서열), 서열번호 14의 염기서열(ASF-F4-4 염기서열) 및 서열번호 15의 염기서열(ASF-F4-5 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열), 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열), 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열) 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트는,
서열번호 11의 염기서열(ASF-F4-1 염기서열)로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열) 및 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
서열번호 11의 염기서열(ASF-F4-1 염기서열)로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열) 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
서열번호 12의 염기서열(ASF-F4-2 염기서열) 또는 서열번호 13의 염기서열(ASF-F4-3 염기서열)로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열), 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열), 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열) 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍,
서열번호 14의 염기서열(ASF-F4-4 염기서열)로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열), 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열), 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열) 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 및
서열번호 15(ASF-F4-5)의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16(ASF-R4-1), 서열번호 17(ASF-R4-2), 서열번호 18(ASF-R4-3) 및 서열번호 19(ASF-R4-4)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트는, 바람직하게는,
서열번호 11의 염기서열(ASF-F4-1 염기서열)로 표시되는 프라이머, 서열번호 12의 염기서열(ASF-F4-2 염기서열)로 표시되는 프라이머, 서열번호 13의 염기서열(ASF-F4-3 염기서열)로 표시되는 프라이머, 서열번호 14의 염기서열(ASF-F4-4 염기서열)로 표시되는 프라이머 및 서열번호 15의 염기서열(ASF-F4-5 염기서열)로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열(ASF-R4-1 염기서열)로 표시되는 프라이머, 서열번호 17의 염기서열(ASF-R4-2 염기서열)로 표시되는 프라이머, 서열번호 18의 염기서열(ASF-R4-3 염기서열)로 표시되는 프라이머 및 서열번호 19의 염기서열(ASF-R4-4 염기서열)로 표시되는 프라이머로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 올리고머 프로브는 양 말단에 형광을 갖는 리포터(Reporter)', 및 상기 리포터의 형광을 소광(Quenching)할 수 있는 '소광자(Quencher)가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 리포터는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-Carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소광자는 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-Carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), 이클립스(Eclipse), DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 올리고머 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 올리고머 프로브는 LNA(Locked nucleic acid)로 인공적으로 합성하며, DNA/RNA 구조내의 2’탄소원자 위의 산소 원자와 4’탄소 원자를 고정시킨 RNA 유사체(RNA analogs)이다. LNA를 포함한 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)는 DNA나 RNA의 짧은 염기서열에도 높은 결합력과 특이성을 나타낸다.
상기 올리고머 프로브는 상보적인 염기서열을 갖는 표적 핵산과 혼성화로 이중가닥을 형성하는 데 단일염기 부정합(Single base mismatch) 시 이중가닥이 불안정해지는 정도가 커지기 때문에 단일염기 다형성(SNP: Single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산으로 이루어진 올리고머 프로브보다 더 뛰어나다.
상기 올리고머 프로브는 DNA 및 DNA의 결합력보다 올리고머 프로브 및 DNA의 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 부정합(Nucleotide mismatch)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 뉴클레오티드의 변화를 검출할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 올리고머 프로브의 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP)이 포함되도록 14~17mer, 바람직하게는 15~16mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, 올리고머 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 올리고머 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 올리고머 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 올리고머 프로브는 DNA로 이루어진 올리고머 프로브보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA로 이루어진 올리고머 프로브보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다.
본 발명에서와 같이, 올리고머 프로브가 15개의 뉴클레오티드로 이루어진 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 올리고머 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 혼성화 정도를 조절할 수 있다.
상기 올리고머 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 올리고머 프로브와 PCR을 위한 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머로 이루어진(Reverse primer) 프라이머 세트만 있으면 충분하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기 조성물 및 키트에 사용되는 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 및 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기 조성물 및 키트에 사용되는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 20의 염기서열(ASF-P4 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합, 또는
서열번호 21의 염기서열(ASF-P7 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트와 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출 또는 판별용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기 조성물 및 키트에 사용되는 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소, 조인자, dNTPs(Deoxynucleotides) 등의 구성성분으로 이루어진 증폭반응(예컨대, PCR 반응)용 시약과, 선택적으로 다양한 폴리뉴클레오티드 분자, 역전사효소, DNA 중합효소 활성 억제용 항체 등의 기타성분을 더 포함할 수 있다. 상기 각 성분의 최적량은 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 키트는, 돼지열병바이러스 및/또는 아프리카돼지열병바이러스의 구별용 유전자 염기서열을 검출 및/또는 판별할 수 있는, 올리고머 프로브 기반의 다중 분석 키트로 구성될 수 있으며, 1개의 2x qPCR 프리믹스 튜브(2x qPCR premix tube) 및 1개의 올리고머 프로브 혼합물 튜브(Oligomer mix tube)를 포함하며, 상기 올리고머 프로브 혼합물은 상기 올리고머 프로브 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다(표 1, 표 9, 표 13 및 표 16 참조).
상기 키트를 이용하면, 실시간 PCR 등에서 올리고머 프로브에 의한 증폭곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 바이러스 유형의 판별이 가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 유전자 마커 서열단편을 생성시키고, 상기 유전자 마커 서열단편에 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 돼지열병바이러스 유형을 야외주 또는 백신주로 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 사용되는 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 및 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 아프리카돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 유전자 마커 서열단편을 생성시키고, 상기 유전자 마커 서열단편에 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 사용되는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 20의 염기서열(ASF-P4 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합, 또는
서열번호 21의 염기서열(ASF-P7 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키고 아프리카돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편 및 아프리카돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편을 생성시킨 다음,
상기 돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편에 상기 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 백신주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부와 상기 아프리카돼지열병바이러스의 유전자 마커 서열단편에 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스를 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출 또는 판별 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 사용되는 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 또는 판별용 올리고머 프로브 세트는,
서열번호 3의 염기서열(CSFV-P[G] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 서열번호 4의 염기서열(CSFV-P[T] 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브; 및 서열번호 22의 염기서열(ASF-P3 염기서열)로 표시되는 올리고머 프로브의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 돼지열병바이러스 야외주는 GenBank NC_002657.1로 표시되는 유전체 염기서열에 포함되는 유전자 마커 염기서열인 서열번호 8로 표시되는 5'UTR의 대립인자 G 염기서열(5'UTR ALLELE G sequence)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 돼지열병바이러스 LOM 백신주는 GenBank EU789580.1로 표시되는 유전체 염기서열에 포함되는 유전자 마커 염기서열인 서열번호 9로 표시되는 5'UTR의 대립인자 T 염기서열(5'UTR ALLELE T sequence)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주는 GenBank DI183602로 표시되는 유전체 염기서열에 포함되는 유전자 마커 염기서열로 BVDV Erns 및 CSFV E1의 부분 염기서열인 서열번호 10으로 표시되는 Berns-E1 염기서열(BErns-E1 sequence)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주는 GenBank NC_001659.2, GenBank MW049116.1, GenBank KC835274.2, GenBank MN537825.1, GenBank MN318203.3 및 GenBank MN537827.1로 표시되는 유전체 염기서열에 포함되는 유전자 마커 염기서열인 P72 염기서열, 바람직하게는 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25 각각의 염기서열(P72-1 sequence, P72-2 sequence 및 P72-3 sequence)로 표시되는 P72 염기서열의 표적 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2 이상의 표적 핵산을 사용하고, 상기 올리고머 프로브에 표지되는 상기 리포터를 표적 핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적 핵산 검출을 통해 하나 이상의 돼지열병바이러스/아프리카돼지열병바이러스 유형을 검출 또는 판별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 일반 PCR(Conventional PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR) 및 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 중 하나 이상, 바람직하게는 실시간 PCR, 더 바람직하게는 멀티플렉스 PCR 조건 하에서 복수의 유전자 마커에 대한 실시간 PCR로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검체 시료의 표적 핵산이 DNA인 경우, 상기 증폭은 92~98℃, 바람직하게는 94~96℃의 온도에서 18~22초, 바람직하게는 19~21초 동안 상기 표적 핵산을 변성(Denaturation)시킨 후, 55~60℃, 바람직하게는 57~59℃의 온도에서 26~34초, 바람직하게는 29~31초 동안 어닐링(Annealing) 및 연장(Extension)하는 단계를 37~43회(Cycles), 바람직하게는 39~41회 반복하는 PCR 조건을 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검체 시료의 표적 핵산이 RNA인 경우, 상기 RNA를 42~58℃, 바람직하게는 49~51℃의 온도에서, 26~34분, 바람직하게는 29~31분 동안 역전사효소(Reverse transcriptase)로 역전사(Reverse transcription)하여 DNA로 전환한 후 상술한 PCR 조건으로 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(Biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(Species)과 혼합된 시료이거나 상기 돼지열병바이러스 및/또는 아프리카돼지열병바이러스에 감염된 개체(예컨대, 돼지 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다.
기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(Fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(Medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산'은 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 엔코딩하는 '표적 유전자' 또는 "유전자 마커"의 핵산 서열의 특정 부위를 포함할 수 있고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 올리고머 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
상기 검체 시료에 포함되는 것으로 추정되는 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 LOM 배신주 및 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 각각의 게놈은 RNA로 이루어져 있으므로, 상술한 역전사를 통해 DNA로 전환한 후 상술한 PCR 조건으로 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검체 시료에 포함되는 것으로 추정되는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 게놈은 DNA로 이루어져 있으므로, 역전사 없이 상술한 PCR 조건으로 증폭될 수 있으나, 돼지열병바이러스와의 동시 검출/판별 시에는 검체 시료로부터 추출한 RNA를 역전사한 후 상술한 PCR 조건으로 증폭시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(Perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(Mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[실시예 1]: 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스의 검출 및 판별
[1-1]: 돼지열병바이러스의 야외주 및 백신주 검출/판별을 위한 프라이머 및 올리고머 프로브 제작
돼지열병바이러스는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 GenBank에 보관/기록된 레프런스 바이러스(Reference virus)인 돼지열병바이러스 야외주(WT: Highly virulent strain)의 유전체 염기서열(GenBank NC_002657.1)과, 돼지열병바이러스 LOM 백신주(Avirulent strain)의 유전체 염기서열(GenBank EU789580.1) 및 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 유전체 염기서열(GenBank DI183602)에 기초하여, 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 아래 표 1과 같이 제작하였다(제조사: Bioneer사).
표 1을 참조하면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커인 5'UTR의 선별된 대립인자 G 염기서열(5'UTR ALLELE G; 서열번호 8) 및 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 유전자 마커인 5'UTR의 선별된 대립인자 T 염기서열(5'UTR ALLELE T; 서열번호 9)을 증폭시키는 용도로 사용하였으며,
상기 유전자 마커 5'UTR ALLELE G의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: JOE(Xanthene fluorophore) 표지; 3'말단: SFCQ1 표지)는 야외주 검출 시 사용하였고,
상기 유전자 마커 5'UTR ALLELE T의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: FAM(6-carboxyfluorescein) 표지; 3'말단: SFCQ1 표지)는 LOM 백신주 검출 시 사용하여 돼지열병바이러스의 유형(야외주/백신주)을 판별하였다.
여기서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 각각의 올리고머 프로브는 돼지열병바이러스 유전체의 5'UTR에 포함되는 대립인자(Allele) 염기서열 중 야외주 특이적 G(Guanine) 또는 LOM 백신주 특이적 T(Thymine)의 포함 유무를 감별하여 돼지열병바이러스 야외주 및 돼지열병바이러스 LOM 백신주를 판별하도록 제작한 것이다.
서열번호 6의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주(한국공개특허 제2010-0121288호 참조)의 BVDV Erns[BErns] 및 CSFV E1을 엔코딩하는 염기서열(GenBank DI183602.1 참조) 중 특정 염기서열을 갖는 유전자 마커인 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 BErns-E1을 증폭시키는 용도로 사용하였으며, 상기 유전자 마커 BErns-E1의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: Texas Red 표지; 3'말단: BHQ2 표지)로 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주를 검출하여 돼지열병바이러스 백신주의 유형을 판별하였다.
한편, 돼지의 염색체에 존재하는 ACTB(GenBank NC_010445.4 참조) 염기서열[돼지 마커]을 IPC(Internal positive control)로 사용하여 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 증폭시킨 후, 상기 ACTB 염기서열의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: Cy5 표지; 3'말단: BHQ2 표지)의 혼성화 정도를 형광 데이터로 실시간 확인하여 상기 돼지열병바이러스 유전자 마커의 상대적 증폭/검출 정도를 검증/보정하였다(QC: Quality control).
| 프라이머 및 프로브 명칭 | 염기서열(5'→3') | 리포터/소광자 | 표적 |
| CSFV-F4 | CGAGCTCCCTGGGTGGTCTA [서열번호 1] |
- | CSFV WT CSFV LOM |
| CSFV-R3 | TATCAGGTYGTACYCCCATCAC [서열번호 2] |
- | |
| CSFV-P[G] | CTCGAGATGCTATGT [서열번호 3] |
JOE/SFCQ1 | CSFV WT |
| CSFV-P[T] | CTCGATATGCTATGTG [서열번호 4] |
FAM/SFCQ1 | CSFV LOM |
| LOMBERN-P | TGGTTTGGAGCATATGCCCTATCAC [서열번호 5] |
Texas Red/BHQ2 | CSFV Flc-LOM-BErns |
| LOMBERN-F1 | GCAAGCAGCTCGGGATACTAG [서열번호 6] |
- | CSFV Flc-LOM-BErns |
| LOMBERN-R2 | TCCGTCCTCCGCATTAGTGTCA [서열번호 7] |
- | |
| PIG-ACTB-F | CTCCATCATGAAGTGCGACGT [서열번호 26] |
- | 돼지 |
| PIG-ACTB-R1 | CGCCAGGGCCGTGATCTCC [서열번호 27] |
- | |
| PIG-ACTB-P | ATCCGCAAGGACCTCTACGCCAACA [서열번호 28] |
Cy5/BHQ2 |
[1-2]: 돼지열병바이러스의 야외주 및 백신주 검출/판별 방법
시료를 2~5μL의 함량으로 DNA 중합효소 및 역전사효소가 담긴 역전사 반응액(조성: Hot-start Taq polymerase, Reverse transcriptase, RNase inhibitor, UDG(Uracil DNA glycosylase))에 첨가 후, 50℃에서 30분간 cDNA 합성 반응을 시킨 다음 cDNA 반응생성물을 수득하였다. 상기 cDNA 반응생성물을 95℃에서 5분간 처리하여 역전사효소 불활화로 역전사 반응을 종료시킨 후, 상기 [1-1]의 프라이머 쌍(6.0μM CSFV-F4 및 6.0μM CSFV-R3의 프라이머 쌍; 5.0μM LOMBERNS-F1 및 5.0μM LOMBERNS-R2의 프라이머 쌍; 및 2.5μM PIG-ACTB-F 및 2.5μM PIG-ACTB-R1의 프라이머 쌍 사용) 및 올리고머 프로브(1.0μM CSFV-P[T], 5.0μM CSFV-P[G], 1.0μM LOMBERNS-P 및 1.0μM PIG-ACTB-P 사용)를 DNA 중합효소 및 dNTP가 담긴 PCR 반응액(조성: 125mM Tris-HCl(pH8.4), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.2mM dNTP)에 첨가하고 PCR 장비(제조사: Bio-Rad, CFX96)에서 실시간 PCR 증폭반응을 40사이클로 각 사이클당 95℃에서 20초 및 58℃에서 30초씩 수행하여 증폭산물에 대한 올리고머 프로브의 혼성화에 따른 형광 데이터를 실시간으로 수집하였다(표 2 참조).
상기 시료는 통상적으로 사용하는 RNA 분리법을 사용하여 돼지열병바이러스에 감염된 것으로 추정되는 돼지의 검체로부터 분리한 RNA 시료, 돼지열병바이러스에 감염된 돼지의 검체로부터 분리한 RNA 시료(양성대조군) 또는 RNA를 함유하지 않는 시료(음성대조군)를 사용하였다.
상기 형광 데이터의 수집 시 올리고머 프로브에 표지된 FAM, JOE 및 Texas Red의 각 형광 역치(Threshold)값은 200으로 하고, Cy5의 형광 역치값은 100으로 하여 돼지열병바이러스의 야외주/백신주를 검출/판별하였다.
| 반응 단계 | 반응 조건 | 사이클 |
| cDNA 합성 | 50℃, 30분 | 1 |
| 역전사효소 불활화 | 95℃, 5분 | 1 |
| PCR 증폭 | 95℃, 20초 | 40 |
| 58℃, 30초 (형광 데이터 수집) |
상기 검출/판별 방법에서 PCR 증폭산물과 혼성화되는 올리고머 프로브의 혼성화 정도를 형광 데이터로 확인하여 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주를 검출/판별하였다.
[1-3]: 돼지열병바이러스에 대한 검출/판별의 특이성 확인
상기 [1-2]의 검출/판별 방법으로 상기 [1-1]에서 제작한 프라이머 및 올리고머 프로브의 돼지열병바이러스에 대한 특이성 여부를 확인하기 위해, 실시간 PCR 기법으로, 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주에 대한 특이성 반응과, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인하였다.
상기 이종 바이러스 중에서 RNA 바이러스인 돼지유행성설사바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus: PEDV), 돼지로타바이러스(Porcine rotavirus: PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive respiratory syndrome virus: PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입, 돼지인플루엔자바이러스(Swine influenza virus: SIV), 돼지전염성위장염바이러스(Transmissible gastroenteritis virus: TGEV) 및 돼지사펠로바이러스(Porcine sapelovirus: PSV)는 상기 [1-2]와 같이 통상적으로 사용하는 RNA 분리법 및 역전사 반응을 통해 DNA 시료를 준비한 다음, 실시간 PCR을 수행하였고,
상기 이종 바이러스 중에서 DNA 바이러스인 돼지써코바이러스(Porcine circovirus: PCV2) 및 돼지파보바이러스(Porcine parvovirus: PPV)는 통상적으로 사용하는 DNA 분리법을 통해 DNA 시료를 준비한 다음, 상기 [1-2]와 같이 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 [1-1]에서 제작한 프라이머 쌍 및 올리고머 프로브는 돼지열병바이러스에 대한 특이성을 나타내었다. 도 1에서 각 바이러스 유형별로 그래프에 나타낸 복수 선은 반복시험의 결과로, 각 바이러스 시료의 핵산 농도를 1.6x104~1.6x10 copies(copy number, 카피수) 범위로 10배씩 연속희석(10-fold serial dilutions)한 1.6x104, 1.6x103, 1.6x102 및 1.6x10 copies의 각 농도별 핵산 시료를 PCR로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다(ACTB 그래프에 따른 복수선은 상기 바이러스 핵산의 농도 1.6x104~1.6x10 copies에 대응되는 핵산 농도로 돼지 유래 핵산을 PCR 증폭시킨 결과를 나타낸 것임).
반면, 도 2에 나타낸 바와 같이, 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지로타바이러스(PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입, 돼지인플루엔자바이러스(SIV), 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지써코바이러스(PCV2), 돼지파보바이러스(PPV) 및 돼지사펠로바이러스(PSV) 각각의 바이러스 핵산을 함유하는 시료는 상기 [1-1]의 프라이머 쌍 및 올리고머 프로브에 의해 PCR 증폭반응 및 혼성화 반응을 나타내지 못하였다.
한편, 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지로타바이러스(PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입 및 돼지인플루엔자바이러스(SIV)의 핵산 시료들은 돼지의 핵산을 함유하지 않은 정제물이므로 돼지의 IPC에 대해 증폭산물을 형성하지 못해 음성반응을 나타내었다.
이와 달리, 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지써코바이러스(PCV2), 돼지파보바이러스(PPV) 및 돼지사펠로바이러스(PSV)의 핵산 시료들은 돼지의 가검물(분변)로부터 추출한 것으로 돼지의 핵산을 다소 포함하여 돼지의 IPC에 대해 양성반응을 나타내었다.
도 2에서 각 바이러스 유형별로 그래프에 나타낸 복수 선은 반복시험의 결과로, 각 바이러스 시료의 핵산 농도를 1.6x104~1.6x10 copies 범위로 10배씩 연속희석한 1.6x104, 1.6x103, 1.6x102 및 1.6x10 copies의 각 농도별 핵산 시료를 PCR로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다(IPC 그래프에 따른 복수선은 상기 바이러스 핵산의 농도 1.6x104~1.6x10 copies에 대응되는 핵산 농도로 돼지 유래 핵산을 PCR 증폭시킨 결과를 나타낸 것임).
도 2의 NC(Negative control)는 바이러스의 핵산을 포함하지 않는 시료를 프라이머(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 7), 올리고머 프로브(서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5), 중합효소, 반응용액 등을 포함하는 PCR 반응액에 첨가하여 PCR 반응 수행 후 얻은 음성반응의 결과를 나타낸 것이다.
결국, 상기 [1-2]의 검출/판별 방법을 통해 확인한 결과, 상기 [1-1]의 돼지열병바이러스 특이적 프라이머 쌍 및 올리고머 프로브는 돼지열병바이러스 검출/판별에 특화되어 있음을 확인하였다.
[1-4]: 돼지열병바이러스에 대한 검출 감도 확인
상기 [1-2]의 검출/판별 방법으로 상기 [1-1]에서 제작한 프라이머 쌍 및 올리고머 프로브의 돼지열병바이러스, 즉 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주에 대한 검출 감도를 실시간 PCR 기법으로 확인하였다.
먼저, 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 각각의 검출 감도를 확인하기 위해 4가지 조합으로 프라이머 쌍 및 올리고머 프로브를 준비하였다.
제1조합은 돼지열병바이러스 야외주의 유전자 마커인 5'UTR ALLELE G(서열번호 8)를 포함하는 유전체 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍(CSFV-F4 및 CSFV-R3)과 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(CSFV-P[G])를 사용하여 상기 [1-2]의 검출/판별 방법으로 검출/판별하기 위한 조합이었고,
제2조합은 돼지열병바이러스 LOM 백신주의 유전자 마커인 5'UTR ALLELE T(서열번호 9)를 포함하는 유전체 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍(CSFV-F4 및 CSFV-R3)과 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(CSFV-P[T])를 사용하여 상기 [1-2]의 검출/판별 방법으로 검출/판별하기 위한 조합이었으며,
제3조합은 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 유전자 마커인 BErns-E1(서열번호 10)를 포함하는 유전체 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍(LOMBERN-F1 및 LOMBERN-R2) 및 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(LOMBERN-P)를 사용하여 상기 [1-2]의 검출/판별 방법으로 검출/판별하기 위한 조합이었다.
한편, 제4조합은 돼지의 마커, 즉 돼지 염색체의 염기서열[돼지 마커]을 포함하는 유전체 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍(PIG-ACTB-F 및 PIG-ACTB-R1) 및 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(PIG-ACTB-P)를 사용하여 상기 [1-2]의 검출/판별 시 상기 돼지열병바이러스의 표적 염기서열들의 증폭/검출이 정상적으로 이루어졌는지 검증하고(정상인 경우 양성(+)으로 표기함), 그 정도를 보정하기 위해 사용한 것이다(QC: Quality control).
아울러, 상기 4가지 조합의 사용 시 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주의 검출 민감도를 확인하기 위해 바이러스 유전체의 검출에 필요한 최소 함량을 카피수(copy number) 기준으로 평가하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 각각의 바이러스주의 카피수 기준을 102 이상으로 한 경우 검출/판별의 민감도가 100%로 나타났다.
이와 달리, 표 4에 나타낸 바와 같이, 돼지열병바이러스 야외주는 101 카피수에서 24개의 시료 중 17개가 양성(민감도 71%)으로 나타났고, 돼지열병바이러스 LOM 백신주는 101 카피수에서 24개의 시료 중 17개가 양성(민감도 71%)으로 나타났으며, 돼지열병바이러스 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주는 101 카피수에서 24개의 시료 중 23개가 양성(민감도 96%)으로 나타나, 101 카피수에서의 검출/판별의 민감도는 낮은 것으로 확인되었다.
즉, 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주 각각을 검출/판별하기 위한 바이러스 유전체의 최소 함량은 카피수 기준으로 102 카피수인 것을 확인하였다.
표 3 및 표 4에서, 검출 감도는 양성인 경우'+' 개수로 표기하였고, 음성인 경우 '-'로 표기하였으며, 표 5에서 NTC(Negative control)는 바이러스의 표적 염기서열을 포함하지 않은 시료를 나타낸 것이다.
| 시료 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| 반복회수 | 카피수 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| 1 | 105 | + | + | + | + |
| 2 | + | + | + | + | |
| 3 | + | + | + | + | |
| 4 | + | + | + | + | |
| 1 | 104 | + | + | + | + |
| 2 | + | + | + | + | |
| 3 | + | + | + | + | |
| 4 | + | + | + | + | |
| 1 | 103 | + | + | + | + |
| 2 | + | + | + | + | |
| 3 | + | + | + | + | |
| 4 | + | + | + | + | |
| 1 | 102 | + | + | + | + |
| 2 | + | + | + | + | |
| 3 | + | + | + | + | |
| 4 | + | + | + | + | |
| 시료 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| 반복회수 | 카피수 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| 1 | 10 | + | + | - | + |
| 2 | + | - | + | + | |
| 3 | - | - | + | + | |
| 4 | + | + | + | + | |
| 5 | + | + | + | + | |
| 6 | - | + | + | + | |
| 7 | - | + | + | + | |
| 8 | + | + | + | + | |
| 9 | + | + | + | + | |
| 10 | - | + | + | + | |
| 11 | + | + | + | + | |
| 12 | + | - | + | + | |
| 13 | + | + | + | + | |
| 14 | + | + | + | + | |
| 15 | - | + | + | + | |
| 16 | + | + | + | + | |
| 17 | + | - | + | + | |
| 18 | + | - | + | + | |
| 19 | + | - | + | + | |
| 20 | - | + | + | + | |
| 21 | + | - | + | + | |
| 22 | - | + | + | + | |
| 23 | + | + | + | + | |
| 24 | + | + | + | + | |
| 시료 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| 반복회수 | 카피수 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| 1 | NTC | - | - | - | + |
| 2 | - | - | - | + | |
| 3 | - | - | - | + | |
[1-5]: 돼지열병바이러스에 대한 검출/판별 방법의 적용 용도 확인
상기 [1-1]에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 이용하는 상기 [1-2]의 검출/판별 방법이 다양한 가검물 시료에 적용가능한지 확인하였다.
구체적으로, 돼지열병바이러스 Ag ELISA, PCR 및 시퀀싱의 기존 검증 방법을 통해 돼지열병바이러스의 야외주, LOM 백신주 및 Flc-LOM-BErns 생마커 백신주에 대한 양성 또는 음성 여부를 확인한 가검물, BVDV(Bovine viral diarrhea virus) 및 BDV(Border disease virus) 각각에 대해 양성반응을 나타낸 가검물 등의 시료를 대상으로 상기 [1-2] 검출/판별 방법의 적용 시 돼지열병바이러스의 검출/판별이 가능한지 확인하였다.
상기 BVDV 및 BDV는 소 유래 바이러스이기는 하나, 돼지열병바이러스와 같은 페스티바이러스 속(Pestivirus genus)에 속하고 가축 농장에서도 빈번하게 발생하는 설사병을 유발하는 바이러스 종이므로 돼지열병바이러스와의 감별이 가능하지 확인하기 위해 시료로 사용하였다.
그 결과, 표 6 내지 표 8에 나타낸 바와 같이, 다양한 가검물 시료에 대해 돼지열병바이러스의 야외주 및 백신주 검출/판별이 가능한 것을 확인하였다(+: 양성반응; -: 음성반응).
| 시료 | 기존 검증 방법 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| CSF 종류 | 상태 | 바이러스 종류 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| LOM-1 | 배양물 | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| ALD | 배양물 | CSFV 야외주 1형 | + | - | - | + |
| 대O-단미 | 배양물 | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| 코OO-단미 | 배양물 | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| 녹OO-혼합 | 배양물 | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| LOM-2 | 배양물 | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| CSF 야외-1 | 배양물 | CSFV 야외주 1형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-2 | 배양물 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-3 | 배양물 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-4 | 배양물 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-5 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-6 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-7 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-8 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-9 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-10 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-11 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| CSF 야외-12 | 배양물 | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | + |
| 시료 | 기존 검증 방법 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| CSF 종류 | 상태 | 바이러스 종류 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| BVDV 1a | 배양물 | BVDV 1a | - | - | - | + |
| BVDV 1b | 배양물 | BVDV 1b | - | - | - | + |
| BVDV 2a | 배양물 | BVDV 2a | - | - | - | + |
| BDV | 배양물 | BDV | - | - | - | + |
| 생마커 백신주 | 배양물 | CSFV 생마커 백신주 1형 | - | + | + | + |
| 야외-멧-1 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-2 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-3 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-4 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-5 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-6 | 혈액 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-7 | 조직 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-8 | 조직 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-9 | 조직 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-10 | 조직 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 야외-멧-11 | 조직 | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| 시료 | 기존 검증 방법 | 본원 [1-2]의 CSFV 검출/판별 방법 | QC | |||
| CSF 종류 | 상태 | 바이러스 종류 | 제1조합(CSFV WT) | 제2조합(CSFV LOM) | 제3조합(CSFV Flc-LOM-Berns) | 제4조합(돼지 유전자 마커) |
| CSFV T1 STD | 농축물(5 x106TCID50/ml) | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| CSFV T2 STD | 농축물(5x106TCID50/ml) | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | + |
| CSFV생마커STD | 농축물(1.6x106 TCID50/ml) | CSFV 생마커 백신주 1형 | - | + | + | + |
| 혈액-사육-1 | 혈액 | 비-돼지열병바이러스 | - | - | - | + |
| 혈액-사육-2 | 혈액 | 비-돼지열병바이러스 | - | - | - | + |
| 혈액-사육-3 | 혈액 | 비-돼지열병바이러스 | - | - | - | + |
| 혈액-사육-4 | 혈액 | 비-돼지열병바이러스 | - | - | - | + |
| pCSFV-T1 | 농축물(1x104 TCID50/ml) | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | - |
| pCSFV-T2 | 농축물(1x104 TCID50/ml) | CSFV 야외주 2형 | + | - | - | - |
| pCSFV-T3 | 농축물(1x104 TCID50/ml) | CSFV 야외주 3형 | + | - | - | - |
| CSFV RNA | 농축물(양성대조군) | CSFV 백신주 1형 | - | + | - | + |
| 생마커 RNA | 농축물(양성대조군) | CSFV 생마커 백신주 1형 | - | + | + | + |
| NTC | 농축물(음성대조군) | - | - | - | - | - |
[실시예 2]: 돼지열병을 유발하는 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스의 검출 및 판별
[2-1]: 아프리카돼지열병바이러스의 검출/판별을 위한 프라이머 세트 및 프로브 제작
아프리카돼지열병바이러스는 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 GenBank에 보관/기록된 레프런스 바이러스인 아프리카돼지열병바이러스 야외주(WT)의 유전체 염기서열(GenBank NC_001659.2, GenBank MW049116.1, GenBank KC835274.2, GenBank MN537825.1, GenBank MN318203.3 및 GenBank MN537827.1 참조)에 기초하여, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 아래 표 9와 같이 제작하였다(제조사: Bioneer사).
표 9를 참조하면, 서열번호 11 내지 서열번호 15로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16 내지 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트의 조합은 상기 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 유전체 염기서열 중 P72 염기서열의 특정 염기서열인 마커 유전자의 염기서열인 P72-1 염기서열(서열번호 23), P72-2 염기서열(서열번호 24) 및 P72-3 염기서열(서열번호 25)을 포함하는 염기서열을 증폭시키는 용도로 사용하였으며, 상기 유전자 마커의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 올리고머 프로브로 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: JOE 표지; 3'말단: BHQ1 표지), 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: JOE 표지; 3'말단: BHQ1 표지) 및/또는 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: Texas Red 표지; 3'말단: BHQ2 표지)를 사용하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출/판별하였다.
한편, 돼지의 염색체에 존재하는 ACTB(GenBank NC_010445.4) 염기서열[돼지 마커]을 IPC(Internal positive control)로 사용하여 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 증폭시킨 후, 상기 ACTB 염기서열의 증폭산물과 특이적으로 혼성화하는 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(5'말단: Cy5 표지; 3'말단: BHQ2 표지)의 혼성화 정도를 형광 데이터로 실시간 확인하여 상기 아프리카돼지열병바이러스 유전자 마커의 상대적 증폭/검출 정도를 검증/보정하였다(QC: Quality control)(상기 표 1 참조).
| 프라이머 및 프로브 명칭 | 염기서열(5'→3') | 리포터/소광자 | 표적 | ||
| ASF-F4-1 | CKTATCCGATCACATTACCT [서열번호 11] |
- | ASFV WT | ||
| ASF-F4-2 | CKTATCCGATCACGTTACCT [서열번호 12] |
- | |||
| ASF-F4-3 | CKTATCCGATTACATTACCT [서열번호 13] |
- | |||
| ASF-F4-4 | CGTATCCGAACACAATACGT [서열번호 14] |
- | |||
| ASF-F4-5 | CGTATCCAATCACATTACCT [서열번호 15] |
- | |||
| ASF-R4-1 | TCTCTTGCTCTGGATACGTT [서열번호 16] |
- | |||
| ASF-R4-2 | TCTCTTGCTCTGGATACATT [서열번호 17] |
- | |||
| ASF-R4-3 | TCTCTTGCTCTAGATACATT [서열번호 18] |
- | |||
| ASF-R4-4 | TCTCTTGCTCTGCATACGTT [서열번호 19] |
- | |||
| ASF-P4 | TGACCACTRGGTTGRTATTCCTCCCGT [서열번호 20] |
JOE/BHQ1 | |||
| ASF-P7 | TGKCCACTGGGTTGGTATTCCTCCCG [서열번호 21] |
JOE/BHQ1 | |||
| ASF-P3 | CGTMACTGCTCAYGGTATCAATCTTATC [서열번호 22] |
Texas Red/BHQ2 | |||
[2-2]: 아프리카돼지열병바이러스의 야외주 검출/판별 방법
시료를 2~5μL의 함량으로 DNA 중합효소 및 dNTP가 담긴 PCR 반응액(조성: Hot-start Taq polymerase, 125mM Tris-HCl(pH8.4), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.2mM dNTP)에 첨가한 후, 상기 [2-1]의 프라이머 쌍(2.0μM ASF-F4-1, 2.0μM ASF-F4-2, 2.0μM ASF-F4-3, 2.0μM ASF-F4-4 및 2.0μM ASF-F4-5의 정방향 프라이머; 2.0μM ASF-R4-1, 2.0μM ASF-R4-2, 2.0μM ASF-R4-3 및 2.0μM ASF-R4-4의 역방향 프라이머; 및 2.5μM PIG-ACTB-F 및 2.5μM PIG-ACTB-R1의 프라이머 쌍 사용) 및 올리고머 프로브(1.0μM ASF-P4, 1.0μM ASF-P7, 2.0μM ASF-P3 및 1.0μM PIG-ACTB-P 사용)를 첨가하고 PCR 장비(제조사: Bio-Rad, CFX96)에서 실시간 PCR 증폭반응을 40사이클로 각 사이클당 95℃에서 20초 및 58℃에서 30초씩 수행하여 증폭산물에 대한 올리고머 프로브의 혼성화에 따른 형광 데이터를 실시간으로 수집하였다(표 10 참조).
상기 시료는 통상적으로 사용하는 DNA 분리법을 사용하여 아프리카돼지열병바이러스에 감염된 것으로 추정되는 돼지의 검체로부터 분리한 DNA 시료, 아프리카돼지열병바이러스에 감염된 돼지의 검체로부터 분리한 DNA 시료(양성대조군) 또는 DNA를 함유하지 않는 시료(음성대조군)를 사용하였다.
상기 형광 데이터의 수집 시 올리고머 프로브에 표지된 JOE 및 Texas Red의 각 형광 역치(Threshold)값은 200으로 하고, Cy5의 형광 역치값은 100으로 하여 아프리카돼지열병바이러스의 야외주/백신주를 검출/판별하였다.
| 반응 단계 | 반응 조건 | 사이클 |
| PCR 증폭 | 95℃, 20초 | 40 |
| 58℃, 30초 (형광 데이터 수집) |
상기 검출/판별 방법에서 PCR 증폭산물과 혼성화되는 올리고머 프로브의 혼성 정도를 형광 데이터로 확인하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출/판별하였다.
[2-3]: 아프리카돼지열병바이러스에 대한 검출/판별의 특이성 확인
상기 [2-2]의 검출/판별 방법으로 상기 [2-1]에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트의 아프리카돼지열병바이러스에 대한 특이성 여부를 확인하기 위해, 실시간 PCR 기법으로, 아프리카돼지열병바이러스 야외주에 대한 특이성 반응과, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스에 대한 비특이성 반응을 확인하였다.
상기 이종 바이러스 중에서 DNA 바이러스인 돼지써코바이러스(PCV2) 및 돼지파보바이러스(PPV)는 상기 [2-2]와 같이 DNA 시료를 준비한 다음, 실시간 PCR을 수행하였고,
상기 이종 바이러스 중에서 RNA 바이러스인 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지로타바이러스(PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입, 돼지인플루엔자바이러스(SIV), 돼지전염성위장염바이러스(TGEV) 및 돼지사펠로바이러스(PSV)는 실시예 1의 [1-2]와 같은 통상적으로 사용하는 RNA 분리법 및 역전사 반응을 통해 DNA 시료를 준비한 다음, 상기 [2-2]와 같이 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 [2-1]에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트는 아프리카돼지열병바이러스에 대해 다양한 시료 농도에서 특이성 반응을 나타내었다. 구체적으로, 아프리카돼지열병바이러스의 검출 민감도를 확인하기 위해 바이러스 유전체의 검출에 필요한 최소 함량을 카피수(Copy number, copies) 기준으로, 1, 1 x 101, 2 x 101, 2 x 102, 2 x 103 및 2 x 104의 카피수로 평가한 결과, 아프리카돼지열병바이러스 야외주는 카피수 기준을 10 이상으로 한 경우 다양한 시료 농도에서 특이성 반응을 나타냈으며, 올리고머 프로브 세트인 ASF-P3 및 ASF-P7을 복합사용하면 ASF-P3을 단독사용하였을 때 보다 특이성 반응을 높게 나타내는 것을 확인하였다(Merge: 각 바이러스 시료의 유전체 농도별 반복시험 결과를 한 그래프에 합한 것임).
도 3에서 각 그래프에 나타낸 복수 선은 반복시험의 결과로, 아프리카돼지열병바이러스 야외주 시료의 핵산 농도를 1.6x104~1.6x10 copies 범위로 10배씩 연속희석한 1.6x104, 1.6x103, 1.6x102 및 1.6x10 copies의 각 농도별 핵산 시료를 PCR로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다.
반면, 도 4에 나타낸 바와 같이, 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지로타바이러스(PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입, 돼지인플루엔자바이러스(SIV), 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지써코바이러스(PCV2), 돼지파보바이러스(PPV) 및 돼지사펠로바이러스(PSV) 각각의 바이러스 핵산을 함유하는 시료는 상기 [2-1]의 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트에 의해 PCR 증폭반응 및 혼성화 반응을 나타내지 못하였다.
한편, 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지로타바이러스(PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입 및 돼지인플루엔자바이러스(SIV)의 핵산 시료들은 돼지의 핵산을 함유하지 않은 정제물이므로 돼지의 IPC에 대해 증폭산물을 형성하지 못해 음성반응을 나타내었다. 이와 달리, 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지써코바이러스(PCV2), 돼지파보바이러스(PPV) 및 돼지사펠로바이러스(PSV)의 핵산 시료들은 돼지의 가검물(분변)로부터 추출한 것으로 돼지의 핵산을 다소 포함하여 돼지의 IPC에 대해 양성반응을 나타내었다.
도 4에서 각 바이러스 유형별로 그래프에 나타낸 복수 선은 반복시험의 결과로, 각 바이러스 시료의 핵산 농도를 1.6x104~1.6x10 copies 범위로 10배씩 연속희석한 1.6x104, 1.6x103, 1.6x102 및 1.6x10 copies의 각 농도별 핵산 시료를 PCR로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다(IPC 그래프에 따른 복수선은 상기 바이러스 핵산의 농도 1.6x104~1.6x10 copies에 대응되는 핵산 농도로 돼지 유래 핵산을 PCR 증폭시킨 결과를 나타낸 것임).
도 4의 NC(Negative control)는 바이러스의 핵산을 포함하지 않는 시료를 프라이머 세트(서열번호 11 내지 서열번호 19), 올리고머 프로브 세트(서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22), 중합효소, 반응용액 등을 포함하는 PCR 반응액에 첨가하여 PCR 반응 수행 후 얻은 음성반응의 결과를 나타낸 것이다.
결국, 상기 [2-2]의 검출/판별 방법을 통해 확인한 결과, 상기 [2-1]의 아프리카돼지열병바이러스 특이적 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트는 아프리카돼지열병바이러스 검출/판별에 특화되어 있음을 확인하였다.
[2-4]: 아프리카돼지열병바이러스에 대한 검출 감도 확인
상기 [2-2]의 검출/판별 방법으로 상기 [2-1]에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트의 아프리카돼지열병바이러스, 즉 아프리카돼지열병바이러스 야외주에 대한 검출 감도를 아프리카돼지열병바이러스 P72 유전자의 염기서열(서열번호 19)(Xiong et al., Virus Res., 297:198357, 2021)을 갖는 플라스미드를 연속희석한 시료를 사용하여 실시간 PCR 기법으로 확인하였다.
먼저, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 감도를 확인하기 위해 3가지 조합으로 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 준비하였다.
제1조합은 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 표적 염기서열인 P72 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 11 ~ 서열번호 15와 서열번호 16 ~ 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍(ASF-F4-1, ASF-F4-2, ASF-F4-3, ASF-F4-4 및 ASF-F4-5와, ASF-R4-1, ASF-R4-2, ASF-R4-3 및 ASF-R4-4의 프라이머 쌍)과 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(ASF-P3)를 단독사용하여 상기 [2-2]의 검출/판별 방법으로 검출/판별하기 위한 조합이었고,
제2조합은 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 표적 염기서열인 P72 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 11 ~ 서열번호 15와 서열번호 16 ~ 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍(ASF-F4-1, ASF-F4-2, ASF-F4-3, ASF-F4-4 및 ASF-F4-5과, ASF-R4-1, ASF-R4-2, ASF-R4-3 및 ASF-R4-4의 프라이머 쌍)과 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 22 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브(ASF-P3 및 ASF-P7)를 복합사용하여 상기 [2-2]의 검출/판별 방법으로 검출/판별하기 위한 조합이었다.
한편, 제3조합은 돼지의 마커, 즉 돼지 염색체의 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭산물을 형성시키는 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 쌍(PIG-ACTB-F 및 PIG-ACTB-R1) 및 상기 증폭산물과 혼성화하는 서열번호 28의 올리고머 프로브(PIG-ACTB-P)를 사용하여 상기 [2-2]의 검출/판별 시 상기 아프리카돼지열병바이러스의 표적 염기서열들의 증폭/검출이 정상적으로 이루어졌는지 검증하고(정상인 경우 양성(+)으로 표기함), 그 정도를 보정하기 위해 사용한 것이다(QC: Quality control).
아울러, 상기 3가지 조합의 사용 시 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 민감도를 확인하기 위해 바이러스 유전체의 검출에 필요한 최소 함량을 카피수(copy number) 기준으로 평가하였다.
그 결과, 표 11에 나타낸 바와 같이, 아프리카돼지열병바이러스 야외주는 카피수 기준을 10 이상으로 한 경우 검출/판별의 민감도가 100%로 나타났다. 즉, 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출/판별하기 위한 바이러스 유전체의 최소 함량은 카피수 기준으로 10 카피수인 것을 확인하였다.
표 11에서 검출 감도는 양성인 경우'+' 개수로 표기하였고, 음성인 경우 '-'로 표기하였으며, NTC(Negative control)는 바이러스의 표적 염기서열을 포함하지 않은 시료를 나타낸 것이다.
| 시료 농도 | 본원 [2-2]의 ASFV 검출/판별 방법 | QC | |
| 제1조합 | 제2조합 | 제3조합 | |
| 2 x 104 | +++ | +++ | + |
| 2 x 103 | ++ | +++ | + |
| 2 x 102 | ++ | ++ | + |
| 2 x 101 | + | + | + |
| 1 x 101 | + | + | + |
| 1 | - | - | + |
| NTC | - | - | + |
[2-5]: 아프리카돼지열병바이러스에 대한 검출/판별 방법의 적용 용도 확인
상기 [2-1]에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 이용하는 상기 [2-2]의 검출/판별 방법이 다양한 가검물 시료에 적용가능한지 확인하였다.
구체적으로, 국립야생동물질병관리원으로부터 입수한 멧돼지 가검물 시료(2021년도 수집한 시료: 기존 검증 방법으로 8개의 시료는 아프리카돼지열병바이러스에 대해 양성반응을 나타내었고, 12개의 시료는 아프리카돼지열병바이러스에 대해 음성반응을 나타냄)를 대상으로 상기 [2-2] 검출/판별 방법의 적용 시 아프리카돼지열병바이러스의 검출/판별이 가능한지 확인하였다.
그 결과, 표 12에 나타낸 바와 같이, 다양한 가검물 시료에 대해 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별이 가능한 것을 확인하였다(+: 양성반응; -: 음성반응).
| 시료 | 기존 검증 방법 | 본원 [2-2]의 ASFV 검출/판별 방법 | QC | |
| 제1조합 | 제2조합 | 제3조합 | ||
| 조직 | + | + | + | + |
| 조직 | + | + | + | + |
| 조직 | + | + | + | + |
| 조직 | + | + | + | + |
| 조직 | + | + | + | + |
| 혈액 | + | + | + | + |
| 혈액 | + | + | + | + |
| 혈액 | + | + | + | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| 혈액 | - | - | - | + |
| NTC | - | - | - | - |
[실시예 3]: 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출 및 판별
[3-1]: 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 동시 검출/판별 방법
실시예 1 및 실시예 2에 따른 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트(표 1 및 표 9 참조)를 아래 표 13에 기재한 바와 같이 한 조합물로 준비하여, 실시예 2에 따른 [2-2]의 역전사 및 증폭 조건으로 시료 유래 핵산의 PCR 증폭산물과 혼성화되는 올리고머 프로브의 혼성화 정도를 형광 데이터로 실시간 확인하여 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출/판별하였다.
상기 시료는 통상적으로 사용하는 핵산(DNA/RNA) 분리법을 사용하여 돼지열병바이러스/아프리카돼지열병바이러스에 감염된 것으로 추정되는 돼지의 검체로부터 분리한 핵산 시료, 돼지열병바이러스/아프리카돼지열병바이러스에 감염된 돼지의 검체로부터 분리한 핵산 시료(양성대조군) 또는 핵산을 함유하지 않는 시료(음성대조군)를 사용하였다.
표 13에서, 올리고머 프로브는 5'말단에 형광 리포터가 표지되는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 CSFV-P[T]는 FAM을 표지하여 사용하였고, CSFV-P[G]는 JOE을 표지하여 사용하였으며, ASF-P3는 Texas Red를 표지하여 사용하였고, PIG-ACTB-P는 Cy5를 표지하여 사용하였다(표 1 및 표 9 참조).
| 구성 | CSFV WT 검출 | CSFV LOM 검출 | ASFV WT 검출 | 돼지 유전자 마커 검출 |
| 프라이머 | CSFV-F4 CSFV-R3 |
ASF-F4-1 ASF-F4-2 ASF-F4-3 ASF-F4-4 ASF-F4-5 ASF-R4-1 ASF-R4-2 ASF-R4-3 ASF-R4-4 |
PIG-ACTB-F PIG-ACTB-R1 |
|
| 올리고머 프로브 | CSFV-P[G] | CSFV-P[T] | ASF-P3 | PIG-ACTB-P |
[3-2]: 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대한 검출/판별의 특이성 확인
상기 [3-1]의 검출/판별 방법으로 상기 표 13의 조합으로 이루어진 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트의 사용을 통해 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대한 동시 검출/판별 여부를 확인하기 위해, 실시간 PCR 기법으로, 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 LOM 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주에 대한 특이성 반응과, 양돈 농장에서 돼지의 감염 증상을 유발하는 10종의 이종 바이러스(PEDV, PRoV G4 타입, PRoV G9 타입, PRRSV NA 타입, PRRSV EU 타입, SIV, TGEV, PCV2, PPV 및 PSV)에 대한 비특이성 반응을 확인하였다.
상기 10종의 이종 바이러스 중 RNA 바이러스는 실시예 1의 [1-2]와 같이 DNA 시료를 준비하고, DNA 바이러스는 실시예 2의 [2-2]와 같이 DNA 시료를 준비하여, 각 DNA 시료에 대한 실시간 PCR을 수행하여 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대한 특이성 반응 및 비특이성 반응을 확인하였다.
그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 상기 표 13의 조합으로 이루어진 프라이머 세트 및 올리고머 프로브는 상기 10종의 이종 바이러스에 대해 비특이성 반응을 나타내었다.
| 바이러스 종류 | CSFV WT 및 CSFV LOM 검출/판별 | CSFV LOM-BErns 검출/판별 | ASFV WT 검출/판별 | 돼지 유전자 마커 검출 |
| PEDV | _ | _ | _ | + |
| PRoV G4 | _ | _ | _ | + |
| PRoV G9 | _ | _ | _ | + |
| PRRSV NA | _ | _ | _ | + |
| PRRSV EU | _ | _ | _ | + |
| SIV | _ | _ | _ | + |
| TGEV | _ | _ | _ | + |
| PCV2 | _ | _ | _ | + |
| PPV | _ | _ | _ | + |
| PSV | _ | _ | _ | + |
반면, 상기 표 13의 조합으로 이루어진 프라이머 세트 및 올리고머 프로브는, 도 5에 나타낸 바와 같이, 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대해 다양한 시료 농도에서 특이성 반응을 나타내었다. 구체적으로, 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 검출 민감도를 확인하기 위해 바이러스 유전체의 검출에 필요한 최소 함량을 카피수 기준으로 평가한 결과, 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 LOM 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주는 카피수 기준을 10 이상으로 한 경우 다양한 시료 농도에서 검출/판별의 민감도가 100%로 나타났다. 즉, 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 LOM 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출/판별하기 위한 바이러스 유전체의 최소 함량은 카피수 기준으로 10 카피수인 것을 확인하였다(NTC(Negative control): 바이러스의 표적 염기서열을 포함하지 않은 시료; Merge: 각 바이러스 시료의 유전체 농도별 반복시험 결과를 한 그래프에 합한 것임).
도 5에서 각 바이러스 유형별로 그래프에 나타낸 복수 선은 반복시험의 결과로, 돼지열병바이러스의 야외주 및 LOM 백신주와 아프리카돼지열병바이러스 야외주 각각의 시료의 핵산 농도를 1x105 ~ 1x10 copies 범위로 연속희석한 1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 50 copies 및 10 copies의 각 농도별 핵산 시료를 PCR로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다.
[3-3]: 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대한 동시 검출/판별 방법의 적용 용도 확인
상기 표 13의 조합으로 프라이머 세트 및 올리고머 프로브를 이용하는 상기 [3-2]의 검출/판별 방법이 다양한 가검물 시료에 적용가능한지 확인하였다.
구체적으로, 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스에 대한 양성/음성 여부를 기존 검증 방법으로 확인한 가감물 등의 시료를 상기 [3-1] 검출/판별 방법으로 돼지열병바이러스 및 아프리카돼지열병바이러스의 동시 검출/판별이 가능한지 확인하였다.
그 결과, 표 15에 나타낸 바와 같이, 다양한 가검물 시료에 대해 돼지열병바이러스 야외주, 돼지열병바이러스 백신주 및 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출/판별이 동시에 가능한 것을 확인하였다(+: 양성반응; -: 음성반응).
| 시료 | 기존 검증 방법 | 본원 [3-1]의 CSFV/ASFV 검출/판별 방법 | QC | ||||
| CSFV WT | CSFV LOM | ASFV WT | CSFV WT | CSFV LOM | ASFV WT | 돼지 유전자 마커 | |
| 조직 | + | - | - | + | - | - | + |
| 조직 | + | - | - | + | - | - | + |
| 조직 | + | - | - | + | - | - | + |
| 조직 | - | + | - | - | + | - | + |
| 조직 | - | + | - | - | + | - | + |
| 조직 | - | - | + | - | - | + | + |
| 조직 | - | - | + | - | - | + | + |
| 조직 | - | + | - | + | + | ||
| 조직 | - | - | + | - | - | + | + |
| 조직 | - | - | - | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | - | - | - | + |
| 조직 | - | - | - | - | - | - | + |
| 혈액 | + | - | - | + | - | - | + |
| 혈액 | - | + | - | - | + | - | + |
| 혈액 | - | - | - | - | - | - | + |
| 혈액 | + | - | - | + | - | - | + |
| 혈액 | + | - | - | + | - | - | + |
| 조직 | - | - | + | - | - | + | + |
| 혈액 | - | - | + | - | - | + | + |
| 혈액 | - | - | + | - | - | + | + |
| 혈액 | - | - | + | - | - | + | + |
| 혈액 | + | - | - | + | - | - | + |
| NTC | - | - | - | - | - | - | - |
종합하면, 하기 표 16에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트의 조합 시 돼지열병을 유발하는 바이러스인 돼지열병바이러스의 백신주 및 야외주와, 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 선택적으로 검출/판별하거나 동시에 검출/판별할 수 있음을 확인하였다.
표 16에서, 올리고머 프로브는 5'말단에 형광 리포터가 표지되는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 CSFV-P[T]는 FAM을 표지하여 사용하였고, CSFV-P[G]는 JOE을 표지하여 사용하였으며, LOMBERN-P는 Texas Red를 표지하여 사용하였고, ASF-P3는 Texas Red를 표지하여 사용하였으며, ASF-P4는 JOE를 표지하여 사용하였고, ASF-P7은 JOE를 표지하여 사용하였으며, PIG-ACTB-P는 Cy5를 표지하여 사용하였다(표 1 및 표 9 참조).
| CSFV WT 및 CSFV LOM 검출/판별 | CSFV LOM-BErns 검출/판별 | ASFV WT 검출/판별 | 돼지 유전자 마커 검출 | |
|
실시예 1
(HelixDtec? CSFV Detection & Typing Assay) |
CSFV-F4 CSFV-R3 CSFV-P[T] CSFV-P[G] |
LOMBERN-F1 LOMBERN-R2 LOMBERN-P |
- | PIG-ACTB-F PIG-ACTB-R1 PIG-ACTB-P |
|
실시예 2
(HelixDtec? ASFV Real-Time PCR Assay) |
- | - | ASF-F4-1~5 ASF-R4-1~4 ASF-P3 ASF-P4 ASF-P7 |
PIG-ACTB-F PIG-ACTB-R1 PIG-ACTB-P |
|
실시예 3
(HelixDtec? CSFV & ASFV Assay) |
CSFV-F4 CSFV-R3 CSFV-P[T] CSFV-P[G] |
- | ASF-F4-1~5 ASF-R4-1~4 ASF-P3 |
PIG-ACTB-F PIG-ACTB-R1 PIG-ACTB-P |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
National Institute of Wildlife Disease Control and Prevention(NIWDC)
NANOHELIX Co.,Ltd
<120> COMPOSITION AND METHOD FOR DETECTING OR DISCRIMINATING SWINE
FEVER CAUSING VIRUSES
<130> YPD202109-0045
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-F4
<400> 1
cgagctccct gggtggtcta 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-R3
<400> 2
tatcaggtyg tacycccatc ac 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-P[G]
<400> 3
ctcgagatgc tatgt 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSFV-P[T]
<400> 4
ctcgatatgc tatgtg 16
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOMBERN-P
<400> 5
tggtttggag catatgccct atcac 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOMBERN-F1
<400> 6
gcaagcagct cgggatacta g 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOMBERN-R2
<400> 7
tccgtcctcc gcattagtgt ca 22
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'UTR ALLELE G
<400> 8
ctcgagatgc tatgt 15
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'UTR ALLELE T
<400> 9
ctcgatatgc tatgtg 16
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BErns-E1
<400> 10
tggtttggag catatgccct atcac 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-F4-1
<400> 11
cktatccgat cacattacct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-F4-2
<400> 12
cktatccgat cacgttacct 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-F4-3
<400> 13
cktatccgat tacattacct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-F4-4
<400> 14
cgtatccgaa cacaatacgt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-F4-5
<400> 15
cgtatccaat cacattacct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-R4-1
<400> 16
tctcttgctc tggatacgtt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-R4-2
<400> 17
tctcttgctc tggatacatt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-R4-3
<400> 18
tctcttgctc tagatacatt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-R4-4
<400> 19
tctcttgctc tgcatacgtt 20
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-P4
<400> 20
tgaccactrg gttgrtattc ctcccgt 27
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-P7
<400> 21
tgkccactgg gttggtattc ctcccg 26
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASF-P3
<400> 22
cgtmactgct cayggtatca atcttatc 28
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P72-1
<400> 23
tgaccactrg gttgrtattc ctcccgt 27
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P72-2
<400> 24
tgkccactgg gttggtattc ctcccg 26
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P72-3
<400> 25
cgtmactgct cayggtatca atcttatc 28
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIG-ACTB-F
<400> 26
ctccatcatg aagtgcgacg t 21
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIG-ACTB-R1
<400> 27
cgccagggcc gtgatctcc 19
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIG-ACTB-P
<400> 28
atccgcaagg acctctacgc caaca 25
Claims (23)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 프라이머 세트 및 올리고머 프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머, 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머, 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지고,
상기 올리고머 프로브 세트는 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브, 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브로 이루어지며,
상기 프라이머 세트는 이종(異種) 바이러스의 핵산과 교차 반응 없이 아프리카돼지열병바이러스의 핵산을 특이적으로 증폭시키고, 상기 올리고머 프로브 세트는 이종 바이러스의 핵산과 교차 반응 없이 상기 증폭한 핵산과 특이적으로 혼성화하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 검출 또는 판별하되,
상기 이종 바이러스는 돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV), 돼지유행성설사바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus: PEDV), 돼지로타바이러스(Porcine rotavirus: PRoV) G4 타입, 돼지로타바이러스(PRoV) G9 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive respiratory syndrome virus: PRRSV) NA 타입, 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV) EU 타입, 돼지인플루엔자바이러스(Swine influenza virus: SIV), 돼지전염성위장염바이러스(Transmissible gastroenteritis virus: TGEV), 돼지써코바이러스(Porcine circovirus: PCV2), 돼지파보바이러스(Porcine parvovirus: PPV) 및 돼지사펠로바이러스(Porcine sapelovirus: PSV)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 조성물. - 제6항의 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별용 키트.
- (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계; 및
(b) 상기 표적 핵산에 포함되는 것으로 추정되는 아프리카돼지열병바이러스 핵산의 유전자 마커 염기서열을 제6항의 조성물에 포함되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시켜 유전자 마커 서열단편을 생성시키고, 상기 유전자 마커 서열단편에 제6항의 조성물에 포함되는 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선을 확인하여 아프리카돼지열병바이러스 야외주를 판별 또는 검출하는 단계;를 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법. - 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 표적 핵산에 돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV) 핵산의 포함 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 표적 핵산에 돼지열병바이러스 핵산의 포함 여부의 확인은,
서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 6의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 돼지열병바이러스 핵산을 증폭시켜 증폭산물을 생성시키고,
상기 증폭산물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고머 프로브로 이루어진 올리고머 프로브 세트의 혼성화 여부에 따른 증폭곡선의 확인을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법. - 삭제
- 제8항 또는 제10항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 올리고머 프로브는 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 아프리카돼지열병바이러스 야외주의 검출 또는 판별 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220040883A KR102532166B1 (ko) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
| KR1020230059844A KR20230142378A (ko) | 2022-04-01 | 2023-05-09 | 돼지열병바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220040883A KR102532166B1 (ko) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230059844A Division KR20230142378A (ko) | 2022-04-01 | 2023-05-09 | 돼지열병바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102532166B1 true KR102532166B1 (ko) | 2023-05-16 |
Family
ID=86545840
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220040883A KR102532166B1 (ko) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
| KR1020230059844A KR20230142378A (ko) | 2022-04-01 | 2023-05-09 | 돼지열병바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230059844A KR20230142378A (ko) | 2022-04-01 | 2023-05-09 | 돼지열병바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (2) | KR102532166B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170135410A (ko) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법 |
-
2022
- 2022-04-01 KR KR1020220040883A patent/KR102532166B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-05-09 KR KR1020230059844A patent/KR20230142378A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170135410A (ko) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 김현주 등, 농림축산검역본부 연차실적보고서, ‘아프리카돼지열병 동시진단법 확립 및 유입대비 국내 예찰’ (2019.12.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230142378A (ko) | 2023-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Decaro et al. | Recombinant canine coronaviruses in dogs, Europe | |
| KR101642784B1 (ko) | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 | |
| CA2597383C (en) | Method of detection of classical swine fever | |
| KR102338861B1 (ko) | RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법 | |
| KR102044683B1 (ko) | 콕시엘라 버네티 검출용 pna 프로브 및 이를 이용한 콕시엘라 버네티 검출방법 | |
| KR101642783B1 (ko) | 참돔 이리도바이러스병 원인바이러스의 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법 | |
| US10745732B2 (en) | Genetic marker for discriminating and detecting causative bacteria of fish Edwardsiellosis and Streptococcosis, and method for discriminating and detecting causative bacteria using same | |
| KR102061896B1 (ko) | 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 | |
| CN114790490A (zh) | 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法 | |
| US7553957B2 (en) | Methods and kits for detecting classical swine fever virus | |
| KR20190105785A (ko) | 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 검출용 PNA 프로브 및 그의 용도 | |
| KR102532166B1 (ko) | 돼지열병을 유발하는 바이러스의 검출 또는 판별을 위한 조성물 및 방법 | |
| KR101737314B1 (ko) | 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 | |
| KR101655069B1 (ko) | 잉어 허피스 바이러스 그레이 에스피에이치 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법 | |
| KR101655068B1 (ko) | 잉어 허피스 바이러스 베르코이버 티케이 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법 | |
| KR101655071B1 (ko) | 참돔 이리도 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법 | |
| TWI659106B (zh) | 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法 | |
| KR101644776B1 (ko) | 참돔 이리도바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법 | |
| KR101395938B1 (ko) | 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법 | |
| KR101911220B1 (ko) | 돼지열병 바이러스 백신주 접종 돼지 및 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 감별용 pna 프로브 및 이를 이용한 감별방법 | |
| CN111500774A (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
| KR101677952B1 (ko) | 연쇄구균 감염증 원인세균인 락토코카스 가비에의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법 | |
| KR102405994B1 (ko) | 마이코플라스마 갈리셉티쿰의 야외주와 백신주를 동시에 구별하여 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출방법 | |
| JPWO2006009260A1 (ja) | Ｅ型肝炎ウイルスの検出方法 | |
| KR101992390B1 (ko) | 굴 허피스 바이러스 검출 및 유형 판별을 위한 유전자 마커, 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| GRNT | Written decision to grant |