KR101642784B1 - 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 - Google Patents

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 바이러스 유형을 판별하거나 어류의 상기 바이러스 유형의 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법{Genetic Markers for Discrimination of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, and Method for Discrimination of Causative Virus Using the Same}
본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 특정 유전자를 코딩하는 DNA 염기서열을 선정하여 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 판별하거나 어류의 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.
최근 감염성 질병진단을 위한 방법 중 분자진단을 사용한 진단 방법 및 키트 등이 개발되어 있으며 일반적인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 수행한 다음, 상기 반응의 증폭산물을 전기영동법으로 확인하거나, 형광 프로브 또는 SYBR Green을 이용하여 Real-time PCR법 등으로 확인하는 방법이 주로 많이 사용되고 있다.
특히, 수산생물전염병 중에서 법정 전염병으로 지정되어 있는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV), 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus(RSIV)/Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus(ISKNV)) 또는 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)를 진단하기 위해서는 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE) 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 일반적인 종래 PCR(conventional PCR)법을 수행하여 PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 증폭산물을 클로닝하고 다시 정제된 플라스미드 DNA의 염기서열을 Sanger sequencing 등의 방법을 통하여 확인하는 작업을 거치고 있어, 절차가 복잡하고 질병진단을 위한 분석에 많은 시간이 소모되는 단점이 있다.
어류 바이러스인 VHSV 분자 진단의 경우, 단시간 안에 높은 정확도 및 민감도를 가진 RT-PCR 및 real-time RT-PCR 등 유전자 진단을 위한 다양한 기법이 개발되고 있다. VHSV 진단에는 OIE 기준에 따라 1단계 또는 2단계로 구성된 종래 RT-PCR(conventional RT-PCR)법이 사용되고 있다. 특히, 최근 북미, 아시아, 유럽과 대서양지역을 대상으로 상기 바이러스의 유전적 변이가 주기적으로 발견됨에 따라 원인바이러스의 역학적인 동태에 대한 연구 및 분자 진단 시 정확한 결과를 얻기 위하여 OIE 기준에 따른 PCR 수행 후 해당 증폭산물의 시퀀싱(염기서열분석, sequencing)을 통한 유전형 분석의 중요성이 높아지고 있다. 최근에 간편한 유전형 분석을 위한 LAMP(loop-mediated isothermal amplification) 등의 기법이 개발되었으나, 다양한 유전형의 바이러스 검출에는 한계가 있어 OIE에서 권장하지 않고 있다.
참돔 이리도바이러스병의 원인바이러스인 RSIV 또는 ISKNV의 진단에는 조직 smear 샘플을 이용한 염색법, MAb를 이용한 IFAT 등의 혈청학적 진단 방법이 사용되고 있으며, 분자 진단의 경우 OIE 기준에 따라 2종류의 프라이머를 사용한 종래(conventional) PCR법을 수행하여 진단한다. OIE에서 권고하는 상기 진단법은 이리도바이러스병(RSIVD)의 진단법으로 “OIE protocol 1 (OIE 1)” PCR법을 사용하여 RSIV/ISKNV 구분없이 진단이 가능하며, “OIE protocol 2 (OIE 4)” PCR법을 사용하는 경우 ISKNV는 증폭하지 않고 RSIV만을 특이적으로 증폭하여, 이리도바이러스병의 원인바이러스인 RSIV와 ISKNV를 구분할 수 있다. 따라서, 이리도바이러스병의 진단과 원인바이러스의 정확한 동정을 위해서는 OIE 기준에 따른 2번의 종래 PCR 단계를 걸쳐 수행하여야 하는 단점이 있다.
잉어 허피스바이러스(KHV)의 분자 진단의 경우, 개시된 다양한 PCR 방법 중에서 KHV 진단에 가장 민감한 것으로 확인된 2가지 종래 PCR법(OIE, 2014)을 통해 수행한다. 첫 번째는 Bercovier 등이 2005년에 개발한 “Bercovier TK primers”를 사용한 방법이고, 두 번째는 Yuasa 등에 의해 개발된 방법(Gray Sph primers/ Yuasa modification)이다. 기존의 PCR법에 비해 민감도가 높은 real-time PCR 등의 진단법을 많은 진단 실험실에서 선호하지만 샘플 준비 및 PCR 과정 동안의 오염 등을 피하기 위하여 상기 언급한 2종류의 PCR법이 가장 많이 수행된다. 현재, 상기 법정 전염병의 진단 및 동정을 위해 국가에서 제시한 표준진단법으로서 종래 PCR법이 사용되고 있다.
또한, OIE 기준에 따라서 PCR 증폭산물의 전기영동 확인 시 객관적인 분석이 불가능하거나(gray zone), 희미한 PCR 증폭산물을 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후 시쿼싱을 통하여 상기 증폭산물의 염기서열을 재확인하는 등의 검증 단계를 거친다. 이러한 검증 단계는 비특이적 산물(non-specific PCR band)의 서열을 확인하여 검증하는 방식으로 분석 절차가 많고 많은 시간을 소모하는 등의 문제점을 가지고 있다. 특히, 종래 PCR법에 의해 증폭산물이 양성으로 확인되면(시퀀싱 판정 이전), 수산생물전염병의 감염이 우려되는 경우에 해당되어 방역조치를 취하게 됨에 따라, 이후 시퀀싱에 따라 위양성으로 판정되는 경우 검사기관의 신뢰성 하락 및 어업인의 피해 발생 사례도 있으므로, 신속, 정확하게 법정 전염병을 진단하는 방법의 개선이 절실하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 수산생물전염병의 원인바이러스인 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 판별 또는 검출용 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭여부를 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 어류 질병 바이러스를 판별하고, 상기 원인바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류)를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 어류 질병 원인바이러스인 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 유형 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 바이러스 유형마다 서로 다른 형광의 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 어류 질병 원인바이러스를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수산생물전염병 원인바이러스인 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 판별 또는 검출용 유전자 마커, 프라이머 및 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 판별 또는 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시킨 다음, 생성된 유전자 마커 서열단편에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키고, 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 Tm값을 얻어 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 유형을 판별하거나 개체의 원인바이러스 감염 여부를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV) 또는 감염성 비장 및 신장 괴사바이러스(ISKNV)의 판별 또는 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV)의 판별 또는 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 수산생물전염병 원인바이러스의 유전자 마커 염기서열을 종래 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 상기 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
(d) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 수산생물전염병 원인바이러스의 바이러스 유형을 판별하거나 어류의 상기 바이러스 유형의 감염 여부를 검출하는 단계;
를 포함하는 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV), 참돔 이리도바이러스병의 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(RSIV)/감염성 비장 및 신장 괴사 바이러스(ISKNV), 또는 잉어허피스바이러스(KHV)의 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 선정하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 바이러스 유형마다 서로 다른 형광의 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 수산생물전염병 원인바이러스를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별하고, 어류의 상기 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 PCR 증폭산물 검증용 MeltingArray의 바이러스 유형의 판별 또는 개체의 바이러스 감염 검출용 증폭곡선을 얻는 단계의 기술적 특징을 나타내는 개념도이다.
도 2는 바이러스 유형의 판별 방법 및 개체의 바이러스 감염 검출 방법에 있어, 펩티드핵산의 혼성화에 따른 융해곡선을 얻는 단계를 나타내는 모식도이다.
도 3은 VHSV의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR법으로 도출된 증폭산물에서 프라이머 및 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기서열 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 4는 RSIV/ISKNV의 OIE 기준에 따른 검출용“PCR protocol 1(OIE 1)”법으로 도출된 증폭산물에서 프라이머 및 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기서열 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 5는 RSIV의 OIE 기준에 따른 검출용“PCR protocol 2(OIE 4)”법으로 도출된 증폭산물에서 프라이머 및 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기서열 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 6은 KHV의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR(Bercoiver TK) 방법으로 도출된 증폭산물에서 프라이머 및 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기서열 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 7은 KHV의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR(Gray SpH) 방법으로 도출된 증폭산물에서 프라이머 및 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기서열 부위를 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 8은 도 1~도 7에서 설명한 바이러스 유형별 프라이머 및 펩티드핵산을 이용한 바이러스 검출 방법에 따른 증폭곡선과 융해곡선 그래프를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 양태에서 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code) 기준에 따른 수산생물전염병의 원인바이러스인 VHSV, RSIV/ISKNV 또는 KHV의 특정 유전자 마커에 대한 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭여부를 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 원인바이러스를 판별하고, 상기 원인바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류)를 검출하는 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 바이러스 유형에 따른 특이적 염기서열을 가지는 마커 및 상기 마커에 대응되는 바이러스 유형 판별용 프라이머 및 펩티드핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용하여 수산생물전염병의 원인바이러스를 검출하고 각각의 원인바이러스의 유형을 판별/검출할 수 있었다.
더욱 상세하게 설명하면, 상기 원인바이러스를 유형별로 판별/검출할 수 있는,
(1) VHSV, RSIV/ISKNV, RSIV 또는 KHV에 각각 특이적인 검출용 PNA 프로브(서열번호 1~서열번호 5) 및 프라이머(서열번호 6~서열번호 10)를 포함하는 올리고머 혼합물(oligomer mixture); 및
(2) 상기 프라이머를 이용하여 생성된 PCR 증폭산물을 주형으로 단일가닥 DNA를 생성하고, 상기 단일가닥에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키기 위한 SSG 버퍼(single strand generation buffer);
를 포함하는 조성물 또는 키트(MeltingArray 포함)를 이용하여 수산생물전염병의 원인바이러스를 검출하고 각각의 원인바이러스의 유형을 판별할 수 있었다.
여기서, 상기 조성물 또는 키트(MeltingArray 포함)는 상기 원인바이러스를 유형별로 판별/검출할 수 있는,
(1) PNA 프로브(서열번호 1) 및 프라이머(서열번호 6)를 포함하는 VHSV의 PCR 산물 검출용 올리고머 혼합물(oligomer mixture);
(2) PNA 프로브(서열번호 2) 및 프라이머(서열번호 7)를 포함하는 RSIV/ISKNV의“PCR protocol 1(OIE 1)”동정법에 따른 산물 검출용 올리고머 혼합물;
(3) PNA 프로브(서열번호 3) 및 프라이머(서열번호 8)를 포함하는 RSIV의 "PCR protocol 2(OIE 4)" 동정법에 따른 산물 검출용 올리고머 혼합물;
(4) PNA 프로브(서열번호 4) 및 프라이머(서열번호 9)를 포함하는 KHV의 "PCR(Bercoiver TK)" 동정법에 따른 산물 검출용 올리고머 혼합물; 및
(5) PNA 프로브(서열번호 5) 및 프라이머(서열번호 10)를 포함하는 KHV의 "PCR(Gray Sph)" 동정법에 따른 산물 검출용 올리고머 혼합물;
을 포함한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV) 또는 감염성 비장 및 신장 괴사바이러스(ISKNV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV) 또는 감염성 비장 및 신장 괴사바이러스(ISKNV)의 판별 또는 검출용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV)의 판별 또는 검출용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV) 또는 감염성 비장 및 신장 괴사바이러스(ISKNV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 참돔 이리도바이러스(Red Sea Bream Iridovirus, RSIV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 수산생물전염병 원인바이러스인 잉어 허피스바이러스(Koi Herpesvirus, KHV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다.
펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로 인공적으로 합성하며, 기본 골격이 포리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이 또는 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
본 발명에서와 같이, PNA 프로브가 14개의 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, PNA 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적 핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머, 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 바이러스의 종 판별이 가능하다.
본 발명은 다른 양태에서, 수산생물전염병 원인바이러스인 어류 바이러스 4종에 대하여 OIE 기준에 따른 검출용 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 6~서열번호 10의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머를 이용하여 합성된 단일가닥의 PCR 증폭산물에 서열번호 1~서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 수산생물전염병의 원인바이러스를 판별하고 검출할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산에 포함된 수산생물전염병 원인바이러스의 유전자 마커 염기서열을 종래 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키는 단계;
(c) 상기 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 상기 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
(d) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 수산생물전염병 원인바이러스의 바이러스 유형을 판별하거나 어류의 상기 바이러스 유형의 감염 여부를 검출하는 단계;
를 포함하는 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 단일가닥의 유전자 마커 서열단편은 단일가닥 형성용 버퍼(single strand generation buffer, SSG buffer)를 추가로 첨가하여 생성시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일가닥 형성용 버퍼는 DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleotides) 및 안정제(Stabilizer)를 함유할 수 있고, 여기서, DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 종래 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 마커 염기서열을 증폭 시 TaqMan 프로브를 추가로 포함시켜 증폭곡선을 얻는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2 이상의 표적 핵산을 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 핵산별로 다르게 하여, 2 이상의 표적 핵산 검출을 통해 하나 이상의 수산생물전염병 원인바이러스의 바이러스 유형을 판별 또는 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 어류 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.
도 1 또는 도 2는 일 실시예에 따른 PCR 검증용 MeltingArray의 기술적 특징을 설명하기 위한 개념도이고, 여기에 나타난 바와 같이, PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호를 발생시킬 수 있으며, 온도가 높아짐에 따라 프로브의 적정 융해온도(Tm)에서 표적 핵산으로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 본 발명은 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여, 표적 핵산의 존재 유무 및 염기차이 유무를 검출할 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적 핵산이 존재하지 않을 경우 융해온도 (Tm) 값을 보이지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출용 유전자 마커 , 및 상기 바이러스에 특이적인 프라이머 및 PNA 프로브 제작
1-1: 수산생물전염병 원인바이러스 : VHSV
VHSV의 N-유전자(N-gene)를 표적으로 하는 "OIE 기준의 검출용 PCR" 방식으로 합성되는 유전자 단편의 서열을 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 비교 분석하여 바이러스 유형별 유전자의 염기서열을 확보하고자 하였다.
그 결과, 5'-GACATGGGCTTCA-3'(서열번호 11)로 표시되는 VHSV의 공통적인 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 VHSV의 판별 또는 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 1(primer 1) 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 1로 표시되는 PNA 1을 제작하였다.
도 3는 VHSV의 상기 유전자의 일부와 판별/검출용 염기서열 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이고, PNA 프로브 해당 염기서열은 파란색으로 표기하였다.
1-2: 수산생물전염병 원인바이러스 : RSIV / ISKNV
RSIV/ISKNV의 OIE 기준의 검출용 “PCR protocol 1(OIE 1)”법으로 합성되는 유전자 단편의 서열을 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 비교 분석하여 바이러스 유형별 유전자의 염기서열을 확보하고자 하였다.
그 결과, 5'-CCATGTACAACATGCTC-3'(서열번호 12)로 표시되는 RSIV/ISKNV의 공통적인 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 RSIV/ISKNV의 판별 또는 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 7로 표시되는 프라이머 2(primer 2) 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 2로 표시되는 PNA 2를 제작하였다.
도 4는 RSIV/ISKNV의 상기 유전자의 일부와 판별/검출용 염기서열 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이고, PNA 프로브 해당 염기서열은 파란색으로 표기하였다.
1-3: 수산생물전염병 원인바이러스 : RSIV
RSIV의 OIE 기준의 검출용 “PCR protocol 2(OIE 4)”법으로 합성되는 유전자 단편의 서열을 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 비교 분석하여 바이러스 유형별 유전자의 염기서열을 확보하고자 하였다.
그 결과, 5'-CCAAGTTCATCATC-3'(서열번호 13)로 표시되는 RSIV의 공통적인 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 RSIV의 판별 또는 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 8로 표시되는 프라이머 3(primer 3) 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 3으로 표시되는 PNA 3을 제작하였다.
도 5는 RSIV의 상기 유전자의 일부와 판별/검출용 염기서열 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이고, PNA 프로브 해당 염기서열은 파란색으로 표기하였다.
1-4: 수산생물전염병 원인바이러스 : KHV
KHV의 OIE 기준의 검출용 "Bercoiver TK PCR"법으로 합성되는 유전자 단편의 서열을 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 비교 분석하여 바이러스 유형별 유전자의 염기서열을 확보하고자 하였다.
그 결과, 5'-GTTCTTCCCCGAC-3'(서열번호 14)로 표시되는 RSIV의 공통적인 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 KHV의 판별 또는 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 9로 표시되는 프라이머 4(primer 4) 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 4로 표시되는 PNA 4를 제작하였다.
도 6은 KHV의 상기 유전자의 일부와 판별/검출용 염기서열 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이고, PNA 프로브 해당 염기서열은 파란색으로 표기하였다.
1-5: 수산생물전염병 원인바이러스 : KHV
KHV의 OIE 기준의 검출용 "Gray Sph PCR"법으로 합성되는 유전자 단편의 서열을 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 비교 분석하여 바이러스 유형별 유전자의 염기서열을 확보하고자 하였다.
그 결과, 5'-TCTCAGCAACACC-3'(서열번호 15)로 표시되는 RSIV의 공통적인 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 KHV의 판별 또는 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 5(primer 5) 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 5로 표시되는 PNA 5를 제작하였다.
도 7은 KHV의 상기 유전자의 일부와 판별/검출용 염기서열 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이고, PNA 프로브 해당 염기서열은 파란색으로 표기하였다.
이와 같이, 본 발명에 따른 바이러스 유전자 마커, PNA 프로브 및 프라이머 염기서열을 결정하였고, 표 1에 나타내었다.
구분 이름 서열번호 서열(5'->3') 변형 타깃
PNA
프로브		 PNA 1 서열번호1 TGAAGCCCATGTC TexasRed, Dabsyl VHSV
PNA 2 서열번호2 CCATGTACAACATGCTC RSIV, ISKNV
PNA 3 서열번호3 GATGATGAACTTGG RSIV
PNA 4 서열번호4 GTTCTTCCCCGAC KHV Bercoiver TK
PNA 5 서열번호5 TCTCAGCAACACC KHV Gray Sph
프라이머 primer 1 서열번호6 ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG - VHSV
primer 2 서열번호7 GCACCAACACATCTCCTATC - RSIV, ISKNV
primer 3 서열번호8 CGGGGGCAATGACGACTACA - RSIV
primer 4 서열번호9 CACCCAGTAGATTATGC - KHV Bercoiver TK
primer 5 서열번호10 GACACATGTTACAATGGTCGC - KHV Gray Sph
바이러스
마커		 VM 1 서열번호11 GACATGGGCTTCA - VHSV
VM 2 서열번호12 CCATGTACAACATGCTC - RSIV, ISKNV
VM 3 서열번호13 CCAAGTTCATCATC - RSIV
VM 4 서열번호14 GTTCTTCCCCGAC - KHV
VM 5 서열번호15 TCTCAGCAACACC - KHV
TaqMan 및 PNA 프로브 등은 같은 형광이 포함되지 않도록 각각 FAM, HEX, TexasRed, Cy5를 결합하여 제작하였다. 그런 다음, 표 1에 나타난 바와 같은 염기서열과 리포터 및 소광자로 PNA 프로브를 제작하였다. 본 발명에서 사용한 PNA 프로브는 PNA 프로브 디자이너(Applied biosystems, 미국)를 이용하여 설계하였고, PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다(표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다).
실시예 2: 수산생물전염병 원인바이러스의 판별 또는 검출용 MeltingArray 키트의 최적화
실시예 1에서 제작된 PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여, 4종의 수산생물전염병 원인바이러스의 DNA 샘플에 대하여 산물에 대하여 증폭곡선 및 용해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 PCR 산물의 검증을 수행함으로써 원인바이러스의 판별 또는 검출을 최적화하고자 하였다. 이때, OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따른 상기 원인바이러스의 판별 또는 검출용 TaqMan 프로브(및 이와 상응하는 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍))를 이용할 수 있다.
MeltingArray 반응은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, PCR 산물을 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 SSG 버퍼(single strand generation buffer) 및 프로브의 결합하는 가닥의 상보적인 방향인 단일 프라이머를 이용하였다. 상기 SSG 버퍼의 조성은 2X의 사용 농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/μl), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl2 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함한다.
MeltingArray 반응을 위한 반응물의 조성은 표 2에 나타내었다. MeltingArray 키트의 master mix을 만든 후 상기 PCR 산물을 1~3μL 첨가하여 분석을 수행하였다.
조성 용량
2X SSG 버퍼 10μL
Oligomer mix (PNA 프로브, 프라이머) 1.5μL
주형(Template, PCR 산물) 1~3μL
증류수 up to 20μL
표 3은 반응물의 혼성화 반응 조건을 나타낸 것으로, PCR 산물로부터 단일가닥 DNA을 형성하는 단계, 변성 단계, 및 PNA 프로브를 혼성화하고, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 나타낸 것이다.
단계 온도(℃) 반응시간 및 사이클
단일 가닥 형성
(Single Strand Generation)		 95 5-10 min
95 30 sec 15-20 cycle
56 30 sec
76 30 sec
변성(Denaturation) 95 1 min
프로브 결합
(Probe binding)		 75 30 sec
55 30 sec
융해(Melting) 45 to 80 Increment 1.0℃, 5 sec (TexasRed)
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 5종의 PNA 프로브를 이용하여 융해곡선 분석으로 수산생물전염병 원인바이러스를 판별 또는 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: PNA 프로브를 이용한 융해피크에 따른 바이러스의 판별 또는 검출 방법
본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 미지의 바이러스 유래 DNA 샘플에 대하여 바이러스 유형을 판별 또는 검출하고자 하는 경우, 표 4와 같은 융해온도별 스코어 표를 미리 만들어 놓고, 이를 활용하는 것이 가능하다.
실시예 2에서와 같이 융해곡선 분석을 수행한 다음, 도출한 형광 신호 및 Tm값을, 상보성이 완전한 때의(perfect match) 온도에 맞추어 디지털화하였다. 즉, perfect match 온도의 ±2℃ 범위를 만들고, 미지의 바이러스 DNA 샘플에 대한 Tm값이 상기 범위 안에 들면 바이러스 유형을 특정하여 판별할 수 있다.
PNA 프로브의 형광물질 Tm (℃) 검출 가능한 바이러스의 종류
TexasRed 65 VHSV
65 RSIV, ISKNV
66 RSIV
60 KHV
62 KHV
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (17)

  1. 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 유전자 마커.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 PNA 프로브.
  8. 제7항에 있어서, 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 조성물.
  12. 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출용 키트.
  13. 다음 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 판별 또는 검출방법:
    (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 유전자 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
    (c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)를 판별 또는 검출하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 단일가닥의 유전자 마커 서열단편은 단일가닥 형성용 버퍼(single strand generation buffer, SSG buffer)를 추가로 첨가하여 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단일가닥 형성용 버퍼는 DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleotides) 및 안정제(Stabilizer)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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