CN110863067A - 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒 - Google Patents

检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110863067A
CN110863067A CN201911198738.2A CN201911198738A CN110863067A CN 110863067 A CN110863067 A CN 110863067A CN 201911198738 A CN201911198738 A CN 201911198738A CN 110863067 A CN110863067 A CN 110863067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
kit
eel
havsybr
primer pair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911198738.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郭书林
陈信忠
吴山楠
罗宝正
张体银
孔繁德
龚艳清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Customs Technical Center
Original Assignee
Xiamen Customs Technical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen Customs Technical Center filed Critical Xiamen Customs Technical Center
Priority to CN201911198738.2A priority Critical patent/CN110863067A/zh
Publication of CN110863067A publication Critical patent/CN110863067A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述引物对包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R；所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用SYBR Green qPCR方法，利用本发明所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测，无需电泳观察结果，也无需添加荧光探针，添加荧光染料即可；本发明所述试剂盒检测方法更快捷简便，成本更低。

Description

检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒。
背景技术
鳗鲡疱疹病毒(herpesvirus anguillae，HVA)是一个普遍存在，具有高度传染性和高致病性的病毒性病原，能够导致鳗鲡“脱粘败血病”。自20世纪80年代以来，野生鳗鲡数量的减少或与之有关。HVA给多国鳗鲡养殖业造成巨大经济损失，目前该病毒已经在全球多个国家发现。随着鳗苗等活鳗的引进，我国主要鳗鲡养殖区普遍发生鳗鲡疱疹病毒感染。以我国“鳗鲡之都”福州为例，主要养殖场发病率约80％，个别养殖场发病率达100％，死亡率约90％，给养殖生产造成严重的危害。
对于鳗鲡疱疹病毒的检测，国外已研究建立了分子杂交检测的方法。但是分子杂交检测方法灵敏度较低，检测程序复杂。无临床症状的鳗鲡依然会携带HVA，具有高灵敏度的检测方法才可以检测鳗鲡携带的HVA。分子杂交的方法不利于携带HVA的鳗鲡的检测，也不满足快速检测通关要求。Rijsewijk等(Rijsewijk,Frans1.Development of apolymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA ineels based on the herpesvirus DNA polymerase gene[J].Journal of VirologicalMethods,2005,1-2:87-94.)建立的PCR检测方法，以HVA的DNA聚合酶基因为序列，分别通过引物对HVApolF/HVApolR，和HVAF/HVAR扩增产生394bp及620bp的目的条带。上述方法存在下述问题：(1)由于不同的普通PCR检测方法因其引物的特性不同，以及反应条件等因素的影响，灵敏度和特异性具有较大差距，上述研究报道的两种PCR检测方法是否满足口岸检疫部门所采用的检测方法应具备的准确性、灵敏性等要求尚待国内权威机构及专家的验证；(2)普通PCR方法检测程序依然较复杂，易于交叉污染，检测通量较低，不利于高通量的检测。2016年，Beurden等报道了利用TaqMan探针检测HVA的的real-time PCR方法(Beurden,Voorbergen-Laarman,Roozenburg,Development and validation of a real-time PCRassay for the detection of anguillid herpesvirus 1[J].Journal of FishDiseases.2016,39,95-104.)，进一步简化了检测程序，避免了交叉污染，但是所述方法成本高，不利于规模化推广。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒；采用SYBR Green qPCR方法，利用所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测，比普通PCR方法更快捷简便，比荧光探针PCR成本更低。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对，包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R；所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包括所述的引物对。
优选的，所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立为0.3～0.5μmol/L。
优选的，所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度为0.4μmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括SYBR Premix Ex Taq II、阳性对照DNA和水。
优选的，所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA。
本发明的有益效果：本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒；采用SYBR Green qPCR方法，利用所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测，无需电泳观察结果，也无需添加荧光探针，添加荧光染料即可；本发明提供的引物对和试剂盒比普通PCR方法更快捷简便，比荧光探针PCR成本更低。
附图说明
图1为SYBR qPCR扩增动力曲线图。
具体实施方式
本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对，包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R；所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明中所述引物对根据GenBank中HAV的DNA聚合酶基因保守序列设计，具体的序列和特征如表1所示。
表1引物对的核苷酸序列和特征参数
Figure BDA0002295332590000031
本发明提供了一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包括上述述的引物对；在本发明中，所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立优选为0.3～0.5μmol/L更优选为0.4μmol/L。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括SYBR Premix Ex Taq II、阳性对照DNA和水。本发明对所述SYBR Premix Ex Taq II没有特殊限定，采用本领域市售产品即可。在本发明中，所述阳性对照DNA为包括鳗鲡疱疹病毒序列的DNA，优选为包括鳗鲡疱疹病毒DNA的重组质粒；所述水优选为PCR专用水。在本发明中，所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA；具体的为鳗鲡的脾脏、肾脏或肝脏等组织的细胞提取的DNA。在本发明中，所述试剂盒还包括阴性对照品；所述阴性对照品优选为水。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：
1)从待检测的鳗鲡材料中提取DNA；
2)将所述提取获得的DNA、SYBR Premix Ex Taq II和水混合进行荧光染料qPCR；根据所述荧光染料qPCR的检测结果确定所述鳗鲡材料中是否存在鳗鲡疱疹病毒。
在本发明中，从待检测的鳗鲡材料中提取DNA。本发明对所述提取DNA的方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒进行提取即可。
本发明将所述提取获得的DNA、SYBR Premix Ex Taq II和水混合进行荧光染料qPCR。在本发明中，所述荧光染料qPCR的扩增体系优选的如表2所示、
表2荧光染料qPCR扩增体系
Figure BDA0002295332590000041
在本发明中，所述荧光染料qPCR的扩增程序优选的如下：95℃预变性10min；95℃变性5s、60℃退火30s，40个扩增循环；在60℃时收集荧光信号。
在本发明中，优选的将所述样本DNA替换为阳性对照DNA；按照上述体系和程序进行扩增；结果作为阳性对照参考。
在本发明中，优选的将所述样本DNA替换为阴性对照品水；按照上述体系和程序进行扩增；结果作为阴性对照参考。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据GenBank中HAV的DNA聚合酶基因保守序列，采用Primer3 Plus软件，设计特异引物对，如下：
Figure BDA0002295332590000042
Figure BDA0002295332590000051
扩增程序：95℃预变性10min，40个扩增循环过程为95℃5s、60℃30s，在60℃时收集荧光信号。
扩增体系如下：
Figure BDA0002295332590000052
将纯化的插入有鳗鲡病毒基因序列的标准品重组质粒进行系列稀释，得到质粒浓度为1.28×107～1.28copies/μL的倍比稀释标准品。
以系列稀释的质粒DNA为模板进行SYBR Green qPCR的结果如图1所示，表明所述方法可以检测到12.8拷贝的质粒标准品模板；可以得到良好的扩增曲线和单一峰形的溶解曲线，并可以将样品检测到12.8copies。
样本检测
D7和D8 HAV阳性样本来源为确认感染有HVA的鳗鲡肝组织；D9阴性对照来源为确认未感染HVA的鳗鲡肝组织；D10空白对照为无菌水。
软件检测结果如表3所示。
表3 SYBR Green qPCR检测结果
Figure BDA0002295332590000053
Figure BDA0002295332590000061
注：D7～D8.HAV阳性样本检测平行，D9为阴性对照，D10为空白对照。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门海关技术中心
<120> 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtgaacaag gtggtgttgg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
catctgacag atgcgatccg a 21

Claims (6)

1.检测鳗鲡疱疹病毒的引物对，其特征在于，包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R；所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立为0.3～0.5μmol/L。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度为0.4μmol/L。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SYBR Premix Ex TaqII、阳性对照DNA和水。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA。
CN201911198738.2A 2019-11-29 2019-11-29 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒 Pending CN110863067A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911198738.2A CN110863067A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911198738.2A CN110863067A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110863067A true CN110863067A (zh) 2020-03-06

Family

ID=69657440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911198738.2A Pending CN110863067A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110863067A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996294A (zh) * 2020-09-30 2020-11-27 福建省农业科学院生物技术研究所 一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241818A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-02 Licentia Ltd. Method and microarray for detecting herpesviruses
CN107190103A (zh) * 2017-06-20 2017-09-22 福建省农业科学院生物技术研究所 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法
US20180195114A1 (en) * 2016-01-15 2018-07-12 National Institute Of Fisheries Science Genetic markers for discrimination and detection of viruses causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the viruses using the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241818A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-02 Licentia Ltd. Method and microarray for detecting herpesviruses
US20180195114A1 (en) * 2016-01-15 2018-07-12 National Institute Of Fisheries Science Genetic markers for discrimination and detection of viruses causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the viruses using the same
CN107190103A (zh) * 2017-06-20 2017-09-22 福建省农业科学院生物技术研究所 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S J VAN BEURDEN等: "Development and validation of a real-time PCRassay for the detection of anguillid herpesvirus 1", 《JOURNAL OF FISH DISEASES》, vol. 39, no. 1, 15 January 2015 (2015-01-15), pages 95 - 104 *
卓玉琛: "患"红肝病"鳗鲡疱疹病毒的分离和鉴定", 《福建农业学报》, vol. 30, no. 02, 15 February 2015 (2015-02-15) *
唐炳华著: "《分子生物学》", 31 July 2017, 中国中医药出版社, pages: 402 - 403 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996294A (zh) * 2020-09-30 2020-11-27 福建省农业科学院生物技术研究所 一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN114752711B (zh) 检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN107354239B (zh) 一种检测eb病毒的多重荧光定量pcr方法及试剂盒
CN113403430A (zh) 一种检测猪圆环病毒不同型别的三重荧光定量pcr引物组、试剂盒及应用
CN110408727B (zh) 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用
CN111471776A (zh) 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法
CN107190103B (zh) 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法
CN113897422A (zh) 一种用于检测致病毛霉菌的多重pcr引物探针组和试剂盒
CN110863067A (zh) 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒
CN116790823A (zh) 同步检测htlv-1和htlv-2的双重定量rt-pcr检测组合物、试剂盒和方法
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
CN113234866B (zh) 一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒及其检测方法
CN114196786A (zh) 禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法
CN107586889A (zh) 鸽新型腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物
CN114032336A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒
CN112553377A (zh) 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组
CN112266978A (zh) 引物探针组合、检测试剂盒及其应用
CN106755567B (zh) 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN114540538A (zh) 一种同时定量检测ehv-1和ehv-4的检测试剂盒及其应用
CN110894551A (zh) 草鱼出血病i型病毒（gcrv-i）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN117551799B (zh) 用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重pcr鉴定方法及应用
CN113293235B (zh) 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用
WO2023236037A1 (zh) 一种hpv核酸检测试剂盒及其制备方法与应用
CN115852006A (zh) 基于era技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合
CN115323076A (zh) 一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200306

RJ01 Rejection of invention patent application after publication