CN114032336A - 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒 - Google Patents

一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒 Download PDF

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CN114032336A CN202111510960.9A CN202111510960A CN114032336A CN 114032336 A CN114032336 A CN 114032336A CN 202111510960 A CN202111510960 A CN 202111510960A CN 114032336 A CN114032336 A CN 114032336A
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陈仕丽
陈彦
杜见南
黄晓彦
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Abstract

本发明公开了一组基于可视化一步法反转录环介导等温扩增技术检测黄瓜花叶病毒的引物组，所述引物组中正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。基于上述引物组构建的黄瓜花叶病毒检测方法及其试剂盒特异性好，灵敏度高，进行过程不需要变温。

Description

一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒。
背景技术
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)属于黄瓜花叶病毒属(Cucunovirus)，为单链RNA病毒，可通过60多种蚜虫传播、还可经种子或汁液接触传播，寄主范围非常广泛，能侵染1000多种单、双子叶植物，已发现受其危害的植物种类达85科365个属775种植物，是目前已知植物寄主最多、分布最广、经济危害性最高的植物病毒之一。
CMV病毒感染兰花后可迅速扩散，且无有效防治药剂，因此，建立针对病毒的高效监测、检测方法，尽早检出感病植株并实施销毁，对控制感染具有至关重要的意义。
目前已有的研究中，针对兰花病毒检测方法的研究主要包括生物学、电镜观察、血清学和分子生物学四类。生物学检测法是诊断兰花病毒的一种传统方法，将病毒接种于敏感植物，观察发病症状，但病毒病症状多样，操作环境严格，固有周期长，目前大多作为辅助手段；电镜检测取样简单，所需时间短，但对操作人员要求高，所用仪器昂贵；血清学检测法利用病毒蛋白与特异性抗体结合的原理对病毒进行检测，是目前兰花病毒检测的常规手段，该法有具有灵敏性较高、特异性强、需时短的优点，但也容易出现假阳性；分子生物学检测法通过检测病毒核酸验证病毒是否存在。分子生物学方法的灵敏度和特异性比其他方法更高,操作简便，适应性强，有可能成为新的常规检测手段。现有技术中的检测方法，操作繁琐，需要仪器辅助判读结果，不能肉眼直接观察，不适用于在田间或基层地方使用。
发明内容
本发明的目的是为了克服兰花中黄瓜花叶病毒现有检测技术的不足，提供利用一步法可视化反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP-HNB)检测该病毒的方法。该方法不仅能够有效检测出黄瓜花叶病毒，还能够将检测时间控制在2小时内，达到快速、灵敏、准确和简便的效果，可应用于黄瓜花叶病毒的检测中，适用于在田间或基层地方使用。
本发明的第一个目的是提供一组基于可视化一步法反转录环介导等温扩增技术检测黄瓜花叶病毒的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种检测黄瓜花叶病毒的方法。
本发明的第三个目的是提供所述引物组在制备检测黄瓜花叶病毒或制备检测黄瓜花叶病毒试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测黄瓜花叶病毒的试剂盒
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一组基于可视化一步法反转录环介导等温扩增技术检测黄瓜花叶病毒的引物组，所述引物组中正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，所述黄瓜花叶病毒为兰花中的黄瓜花叶病毒。
一种检测黄瓜花叶病毒的方法，采用正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的引物组进行检测。
优选地，所述黄瓜花叶病毒为兰花中的黄瓜花叶病毒。
优选地，所述方法利用正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的引物组进行一步法反转录环介导等温扩增，根据扩增体系颜色变化判断待测样品中是否含有黄瓜花叶病毒；如果反应体系呈蓝色，则说明样本含有黄瓜花叶病毒；反应体系呈紫红色，则说明样本并不含有黄瓜花叶病毒。
优选地，所述一步法反转录环介导等温扩增使用ddH2O作为阴性模板，反应体系的终浓度为：Bst DNA聚合酶5～15U、逆转录酶5～10U、缓冲液1×、dNTPs1～2mM each、MgSO44～10mM、F3和B3引物各1条，每条0.1～0.3μM、FIP和BIP引物各1条，每条0.8～2.4μM、模板RNA1～2μL，补充ddH2O至25μL。
更优选地，所述反应体系的终浓度为：Bst DNA聚合酶8U、逆转录酶7.5U、缓冲液1×、dNTPs1.4mM each、MgSO4 8mM、F3和B3引物各1条，每条0.2μM、FIP和BIP引物各1条，每条1.6μM、模板RNA1μL，补充ddH2O至25μL。
优选地，所述环介导等温扩增的反应温度为58～62℃。
更优选地，所述环介导等温扩增的反应温度为61℃。
优选地，所述环介导等温扩增的反应时间为40～90min。
更优选地，所述环介导等温扩增的反应时间为60min。
所述引物组在检测黄瓜花叶病毒或制备检测黄瓜花叶病毒试剂盒中的应用。
优选地，所述黄瓜花叶病毒为兰花中的黄瓜花叶病毒。
一种检测黄瓜花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的引物组。
优选地，所述黄瓜花叶病毒为兰花中的黄瓜花叶病毒。
优选地，所述试剂盒还含有反应体系的终浓度为：Bst DNA聚合酶5～15U、逆转录酶5～10U、缓冲液1×、dNTPs1～2mM each、MgSO44～10mM、F3和B3引物各1条，每条0.1～0.3μM、FIP和BIP引物各1条，每条0.8～2.4μM、模板RNA1～2μL，补充ddH2O至25μL。
更优选地，所述反应体系的终浓度为：Bst DNA聚合酶8U、逆转录酶7.5U、缓冲液1×、dNTPs1.4mM each、MgSO48mM、F3和B3引物各1条，每条0.2μL、FIP和BIP引物各1条，每条1.6μL、模板RNA1μL，补充ddH2O至25μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的一组检测黄瓜花叶病毒的特异性引物是针对黄瓜花叶病毒的cp基因保守序列设计的，所述引物组中正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。适用于环介导等温扩增，能特异、灵敏、快速、简便地检测兰花中的CMV。基于上述引物组构建的黄瓜花叶病毒检测方法及其试剂盒用于黄瓜花叶病毒的扩增和检测分析，特异性好，灵敏度高，可通过反应体系颜色变化判读检测结果，不需要开盖进行产物的凝胶电泳；由于本反应在58～62℃均可进行，进行过程不需要变温，因此在条件简陋的实验室以及发展中国家都可以得到推广。
附图说明
图1为不同引物组的扩增产物，其中，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～3分别为第1套、第2套和第3套引物组。
图2为不同退火温度的扩增产物，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～5分别为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；N为阴性对照。
图3为不同扩增时间的扩增产物，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～7分别为30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min；N为阴性对照。
图4为RT-LAMP-HNB反应的特异性，泳道M为DL2000 DNA Marker，1～3分别为CymMV，ORSV和CMV，上部分为RT-LAMP结果，下部分为RT-LAMP-HNB结果。
图5为RT-LAMP-HNB扩增与RT-PCR扩增敏感性对比，上部分为RT-PCR结果，中间部分为RT-LAMP结果，下部分为RT-LAMP-HNB结果。泳道M为DL2000 DNA标记；1～8为RNA稀释倍数分别为100、101、102、103、104、105、106和107；N为阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物设计
1.实验方法
根据GenBank上的黄瓜花叶病毒的cp基因序列，找到保守的区域。登录号分别为：>lcl|MG200273.1_cds_AXK69523.1_1、>lcl|MG200272.1_cds_AXK69522.1_1、>lcl|MG251400.1_cds_AXK69528.1_1、>lcl|MG200267.1_cds_AXK69517.1_1、>lcl|MG200268.1_cds_AXK69518.1_1、>lcl|MG200269.1_cds_AXK69519.1_1、>lcl|AJ890464.2_cds_CAI68014.1_1、>lcl|AJ890465.2_cds_CAI68015.1_1。设计了3套RT-LAMP-HNB引物组。引物序列见表1，表1是LAMP引物列表。RT-PCR引物采用F3和B3引物。
提取黄瓜花叶病毒的RNA，病毒RNA使用RNA提取试剂盒(SteadyPure Virus DNA/RNA Extraction Kit，艾瑞科生物)提取，具体操作参照该试剂盒说明书。使用ddH2O作为阴性模板。
使用设计的1～3套引物组，针对黄瓜花叶病毒的引物组，进行RT-LAMP反应。
反应体系如表2所示：
在61℃的温度下，反应60min。
产物检测：反应结束后，各管分别取5μL LAMP扩增产物在GoldView染色，2％琼脂糖凝胶上电泳。
表1黄瓜花叶病毒RT-LAMP扩增引物序列
Figure BDA0003405341680000051
表2RT-LAMP反应体系
试剂 终浓度
Bst DNA聚合酶 8U
逆转录酶 7.5U
缓冲液 1×
dNTPs 1.4mM each
MgSO<sub>4</sub> 8mM
F3和B3引物 各0.2μM
FIP和BIP引物 各1.6μM
模板RNA 1μL
补充ddH<sub>2</sub>O 至25μL
2.试验结果
结果由图1所示，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～3分别为第1套、第2套和第3套引物组。可以看出，1为阳性，2、3为阴性，最后选择第1套核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物组，作为后续检测引物。
实施例2引物反应条件对扩增产物的影响
为了确定RT-LAMP反应时，引物反应条件对扩增产物的影响，设定在温度为58～62℃，反应时间30min～90min的范围内，对RT-LAMP反应温度和时间的条件确定。
一、反应温度(退火温度)对扩增产物的影响
1、实验操作
按照实施例1的方法提取黄瓜花叶病毒的RNA，在58～62℃的退火温度范围内进行RT-LAMP反应。
使用实施例1设计的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的，针对黄瓜花叶病毒的引物组，进行RT-LAMP反应。反应体系与实施例1相同。
分别在58℃、59℃、60℃、61℃、62℃的温度下，反应60min。
产物检测：反应结束后，各管分别取5μL LAMP扩增产物在GoldView染色，2％琼脂糖凝胶上电泳。
2、实验结果
结果如图2所示，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～5分别为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；N为阴性对照。RT-LAMP反应在58～62℃有明显扩增产物。根据电泳结果，选择61℃作为最佳反应温度。
二、反应时间对扩增产物的影响
1、实验操作
反应体系及产物检测与反应温度(退火温度)对扩增产物的影响实验相同。
在61℃温度下，分别反应30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min。
2、实验结果
结果如附图3所示，泳道M为DL2000 DNA Marker；1～7分别为30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min；N为阴性对照。黄瓜花叶病毒在30～90min均有明显扩增产物，在40～90min有明显扩增产物。根据电泳结果，选择60min作为RT-LAMP反应时间。
因此确定RT-LAMP反应温度和反应时间分别为61℃和60min。
实施例3特异性实验
为了检测实施例2方法的特异性，使用实施例1中的引物对黄瓜花叶病毒进行一步法可视化反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP-HNB)反应。
1、实验操作
使用针对实施例1设计的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物组，对黄瓜花叶病毒、建兰花叶病毒(CymMV)及齿舌兰轮状病毒(ORSV)的RNA进行RT-LAMP-HNB反应，检测该方法的特异性。黄瓜花叶病毒来自于美国Agdia公司，建兰花叶病毒及齿舌兰轮状病毒为东莞市农业科学研究中心兰花大棚保存。
将以上菌株分别提取RNA进行RT-LAMP-HNB反应检测，用200μMHNB染色。
反应体系及产物检测如实施例2。
RT-LAMP反应温度和反应时间分别为61℃和60min。
2、实验结果
结果如附图4所示，泳道M为DL2000 DNA Marker，1～3分别为CymMV，ORSV和CMV。上部分为RT-LAMP结果，下部分为RT-LAMP-HNB结果。实施例1设计的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物组，仅能够扩增出CMV的RNA片段，而CymMV和ORSV都未出现扩增条带。
RT-LAMP-HNB反应结束后，根据反应体系颜色变化，如果反应体系呈蓝色，则说明样本含有黄瓜花叶病毒；反应体系呈紫红色，则说明样本并不含有黄瓜花叶病毒。RT-LAMP-HNB结果也显示针对CymMV和ORSV的扩增体系颜色为紫红色，CMV扩增体系为蓝色，说明本方法具有特异性。
实施例4敏感性实验
1、实验操作
使用实施例1设计的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物组，进行RT-LAMP-HNB反应。
RT-LAMP-HNB反应体系及产物检测同实施例2，用200μMHNB染色。
RT-LAMP反应温度和反应时间分别为61℃和60min。
RT-PCR反应体系：One Step Enzyme Mix 1μL，2×One-step Reaction Solution12.5μL，F3和B3各5pmol，模板RNA 1μL，补充ddH2O至25μL。
RT-PCR反应条件：50℃30min，95℃30sec，(95℃30sec，54℃30sec，72℃15sec)×30cycles，72℃5min。
2、实验结果
黄瓜花叶病毒RT-PCR目的产物为199bp。产物检测见实施例2。
如图5所示，上部分为RT-PCR结果，中间部分为RT-LAMP结果，下部分为RT-LAMP-HNB结果。泳道M为DL2000 DNA标记；1～8为RNA稀释倍数分别为100、101、102、103、104、105、106和107；N为阴性对照。
可以看出RT-PCR扩增条带在RNA模板稀释102倍时隐约可见，至103倍不可见；RT-LAMP扩增产物凝胶电泳结果显示在RNA模板在稀释103倍时仍有明显扩增条带，较RT-PCR高10倍；可视化RT-LAMP-HNB在RNA模板在稀释103倍时，体系呈蓝紫色，表示发生扩增反应，产生扩增产物，与RT-LAMP凝胶电泳结果保持一致，灵敏性同样比RT-PCR高10倍。
在本实施例中，RT-LAMP-HNB检测技术的敏感度均比RT-PCR技术检出浓度高一个数量级。
实施例7一种检测黄瓜花叶病毒的试剂盒
基于实施例1设计的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物组和实施例2的检测方法，构建了一种检测黄瓜花叶病毒的试剂盒。
一、试剂盒组成
组分包括：检测引物、RT-LAMP-HNB试剂；
LAMP试剂为Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液、dNTPs混合物、MgSO4和HNB；
检测引物如SEQ ID NO：1～4所示：
其中，F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
二、试剂盒使用方法
(1)RT-LAMP-HNB反应
使用进行RT-LAMP-HNB反应，使用ddH2O作为阴性模板，
反应体系如下表所示：
表3 RT-LAMP-HNB反应体系
试剂 含量
Bst DNA聚合酶 8U
逆转录酶 7.5U
缓冲液 1×
dNTPs 1.4mM each
MgSO<sub>4</sub> 8mM
F3和B3引物 各0.2μM
FIP和BIP引物 各1.6μM
HNB 200μM
模板RNA 1μL
补充ddH<sub>2</sub>O 至25μL
RT-LAMP-HNB反应温度和反应时间分别为61℃和60min。
(2)RT-LAMP-HNB反应结果判读
LAMP反应结束后，根据体系颜色变化判断，反应体系呈蓝色，则说明样本含有黄瓜花叶病毒；反应体系呈紫红色，则说明样本并不含有黄瓜花叶病毒。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 东莞市农业科学研究中心
<120> 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcwaccgtgt gggtgaca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggsgkactt tctcatgtcr 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtccgcga acatagcaga ggtccgtaaa gttcctgcct c 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtatgcag catccggagt cccgcatcgc cgaaagatca 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagttcctgc ctcctcgg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgctcrak gtcracatga 20
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggactccrga tgcwgcrtac tgccgccatc tctgctatgt ty 42
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgscgatgcg cgctgatatw cgtctcrrgy gcatcgtc 38
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcgcatyca aatycgagtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggsgkactt tctcatgtcr 20
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggyaacgg ataagtccga ggtgaktcwa ccgtgtgggt ga 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagtaygcwg catcyggagt cccgcatcgs cgaaagatca 40

Claims (10)

1.一组基于可视化一步法反转录环介导等温扩增技术检测黄瓜花叶病毒的引物组，其特征在于，所述引物组中正向置换引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向置换引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种检测黄瓜花叶病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述引物组进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1所述引物组进行一步法反转录环介导等温扩增，根据扩增体系颜色变化判断待测样品中是否含有黄瓜花叶病毒；如果反应体系呈蓝色，则说明样本含有黄瓜花叶病毒；反应体系呈紫红色，则说明样本并不含有黄瓜花叶病毒。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述一步法反转录环介导等温扩增使用ddH2O作为阴性模板，反应体系的终浓度为：Bst DNA聚合酶5～15U、逆转录酶5～10U、缓冲液1×、dNTPs1～2mM each、MgSO44～10mM、F3和B3引物各1条，每条0.1～0.3μM、FIP和BIP引物各1条，每条0.8～2.4μM、模板RNA1～2μL，补充ddH2O至25μL。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应温度为58～62℃。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应温度为61℃。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应时间为40～90min。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应时间为60min。
9.权利要求1所述引物组在制备检测黄瓜花叶病毒或制备检测黄瓜花叶病毒试剂盒中的应用。
10.一种检测黄瓜花叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述引物组。
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