CN113293236A

CN113293236A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-lamp检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN113293236A
Application number: CN202110724982.9A
Authority: CN
Inventors: 戴爱玲; 俞国华; 杨小燕; 范克伟; 刘建奎; 黄翠琴; 杨守深; 尹会方; 李晓华; 王鑫; 包银莉
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-08-24

Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT‑LAMP检测引物组及试剂盒，猪繁殖与呼吸综合征病毒RT‑LAMP检测引物组包括6条引物，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。猪繁殖与呼吸综合征病毒RT‑LAMP检测试剂盒包含上述引物组外，还包含AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10Ｘ LAMP反应缓冲液、HNB、阳性对照质粒等成分。本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点，不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称蓝耳病，是由病毒引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病，其特征为母猪厌食、发热、妊娠后期发生流产，产死胎和木乃伊胎；仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡。高致病性毒株可以引起成年猪发热、皮肤发红、呼吸困难和急性死亡。目前该病几乎存在于所有猪群，有最急性、急性和亚急性等多种临床表现类型，是影响我国养猪业健康发展的最严重疫病之一。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)属于动脉炎病毒科，有囊膜。其基因组为单股正链RNA，全长为15.1kb，编码7个阅读框(ORF)。本病毒分为欧洲型和美洲型两个血清型，随着该病的流行，同一血清型病毒又出现了多个基因亚型。

PRRSV的诊断方法有临床诊断、病毒分离鉴定、酶联免疫吸附实验(ELISA)、普通PCR 和荧光定量PCR等，其中：临床诊断无法确诊，病毒分离鉴定太过复杂繁琐，ELISA检测只有在动物产生抗体后才能检测出来从而导致检测时间延后而且血清学检测无法区分抗体是由于初次感染、再次感染还是疫苗免疫产生，普通PCR检测需要在扩增完成后通过电泳才能获得检测结果，而荧光定量PCR检测需要使用昂贵的荧光定量PCR仪从而限制了该方法的使用范围。

LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification，环介导等温基因扩增技术)和RT-LAMP (逆转录-环介导等温基因扩增技术)是一种新型的核酸扩增技术，在2000年由日本科学家发明。该技术具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。利用该技术开发的产品，具有以下两个优点：(1)配套仪器成本低：一个普通水浴锅即可完成检测反应；(2)结果可视化，产品使用范围大大扩展：不仅大型养殖单位和高端实验室可以使用，广大中小养殖单位和普通实验室也可以使用。

发明内容

为了克服传统PRRSV检测方法固有的缺点，本发明的目的在于提供猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测引物组及试剂盒。

本发明是通过如下技术方案实现的：

首先，选取PRRSV病毒基因组的保守序列，设计了针对PRRSV病毒的RT-LAMP检测引物组，该引物组包括6条引物，6条引物的具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1(PRRSV-F3):5′-gcagtagttgcactcctttg-3′

SEQ ID NO.2(PRRSV-B3):5′-agcttttctgccacccaac-3′

SEQ ID NO.3(PRRSV-FIP):5′-gggccagaatgtacttgcgttagaaacctggaaattcatcacc-3′

SEQ ID NO.4(PRRSV-BIP):5′-gattgcggcaaatgataaccacttttaacccgggcaccaatg-3′

SEQ ID NO.5(PRRSV-LF):5′-tagcaagcacaaacggcatc-3′

SEQ ID NO.6(PRRSV-LB):5′-gctccactacggtcaacgg-3′

其次，将以上6条PRRSV病毒的LAMP检测引物与以下试剂组合即构成可以检测PRRSV 病毒的试剂盒，具体该试剂盒包括以下成分：

PRRSV病毒的LAMP检测引物组3μL(其中PRRSV-F3和PRRSV-B3各20μM， PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各160μM，PRRSV-LF和PRRSV-LB各80μM)、10Units/μL AMV 逆转录酶0.5μL、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、 5M Betaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB 2.4μL、用去离子水补足到40μL；检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

试剂盒中的HNB也可以用其它对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料代替，比如：钙黄绿素、SYTO-9、SYBR Green、Eva Green等。

每次实验需要同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入含PRRSV病毒DNA片段的质粒、阴性对照加入去离子水。

反应条件：61℃,60min。反应可以在普通PCR仪上进行，也可以在普通水浴锅内进行。

反应结果的判断：阳性对照的反应结果为深蓝色，阴性对照的反应结果为紫红色。如果待测样品反应管的颜色与阳性对照相同(呈深蓝色)，则说明待测样品PRRSV的检测结果为阳性。如果待测样品反应管的颜色与阴性对照相同(呈紫红色)，则说明待测样品PRRSV的检测结果为阴性。

含PRRSV病毒DNA片段的质粒的制备：我们合成了PRRSV病毒LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-PRRSV，用作PRRSV病毒RT-LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(PRRSV病毒DNA部分片段)：

5’-ctcactatgggagcagtagttgcactcctttggggggtgtactcagccatagaaacctggaaattcatcacctccagatgccgtttgtgcttgctaggccgcaagtacattctg gcccctgcccaccacgttgaaagtgccgcacggtttcatccgattgcggcaaatgataaccacgcatttgtcgtccggcgtcccggctccactacggtcaacggcacattggtgc ccgggttaaaaagcctcgtgttgggtggcagaaaagctgttaaacagggag-3’

本发明利用RT-LAMP恒温扩增技术，结合指示剂HNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)，开发出了一款可视化的PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒具有灵敏度良好，配套仪器简单、结果可视化、操作容易等一系列优点。

附图说明

图1为PRRSV病毒RT-LAMP检测结果。阳性对照为pGH-PRRSV质粒，而阴性对照为去离子水。结果显示：经61℃反应60min后，阳性对照反应管呈深蓝色(左侧2个反应管)，而阴性对照管呈紫红色(右侧3个反应管)。

图2为PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒灵敏度测试结果。将pGH-PRRSV质粒做4倍系列稀释后，使用本试剂盒进行检测。测试结果显示：经61℃反应60min后，从4^(-1)-4^(-5)稀释度呈深蓝色，4^(-6)和4^(-7)稀释度则是一个反应管深蓝色而另一个反应管呈紫红色，4^(-8)- 4^(-10)稀释度呈紫红色。该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-7)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-PRRSV质粒拷贝数为45.7个拷贝。

图3为PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果，同时与普通PCR检测结果进行对比。结果显示：4个临床样品中，PRRSV病毒RT-LAMP试剂盒检测出了2个阳性样品，其余2个为阴性样品，该检测结果与普通PCR检测结果100％相符。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步详细说明，但其内容不构成对本发明的限制。

实施例1

PRRSV病毒RT-LAMP检测引物组的设计。

根据已公布的PRRSV病毒的核酸序列，设计了针对PRRSV病毒的RT-LAMP检测引物组，包括6条引物，具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1(PRRSV-F3):5′-gcagtagttgcactcctttg-3′

SEQ ID NO.2(PRRSV-B3):5′-agcttttctgccacccaac-3′

SEQ ID NO.3(PRRSV-FIP):5′-gggccagaatgtacttgcgttagaaacctggaaattcatcacc-3′

SEQ ID NO.4(PRRSV-BIP):5′-gattgcggcaaatgataaccacttttaacccgggcaccaatg-3′

SEQ ID NO.5(PRRSV-LF):5′-tagcaagcacaaacggcatc-3′

SEQ ID NO.6(PRRSV-LB):5′-gctccactacggtcaacgg-3′

PRRSV病毒RT-LAMP检测时的阳性对照质粒的制备:合成PRRSV病毒RT-LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-PRRSV，用作PRRSV病毒 RT-LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(PRRSV病毒DNA部分片段)：

试剂盒组成如下：PRRSV病毒的LAMP检测引物组3μL(其中PRRSV-F3和PRRSV-B3 各20μM，PRRSV-FIP和PRRSV-BIP各160μM，PRRSV-LF和PRRSV-LB各80μM)、10Units/μL AMV逆转录酶0.5μL、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、5MBetaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB 2.4μL、用去离子水补足到40μL；检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

每次实验需要同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入pGH-PRRSV的质粒、阴性对照加入去离子水。

反应结果的判断：阳性对照的反应结果为深蓝色，阴性对照的反应结果为紫红色。如果待测样品反应管的颜色与阳性对照相同(呈深蓝色)，则说明待测样品PRRSV病毒的检测结果为阳性。如果待测样品反应管的颜色与阴性对照相同(呈紫红色)，则说明待测样品PRRSV 病毒的检测结果为阴性。

阳性对照为pGH-PRRSV质粒而阴性对照为去离子水的PRRSV病毒RT-LAMP检测结果如图1所示。结果显示：经61℃反应60min后，阳性对照反应管呈深蓝色，而阴性对照管呈紫红色。该结果说明：所设计PRRSV病毒的RT-LAMP检测引物组可以检测出含PRRSV病毒相应DNA片段的样品。

实施例2

PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒灵敏度测试。

将pGH-PRRSV质粒做4倍系列稀释，稀释度从4^(-1)-4^(-9)，然后使用本试剂盒对各稀释度进行检测。结果如图2所示。

测试结果显示：经61℃反应60min后，从4^(-1)-4^(-5)稀释度呈深蓝色，4^(-6)和4^(-7) 稀释度则是一个反应管深蓝色而另一个反应管呈紫红色，4^(-8)-4^(-10)稀释度呈紫红色。该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-7)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-PRRSV 质粒拷贝数为45.7个拷贝。

以上结果说明：本发明的PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒灵敏度良好，其最高检测灵敏度可达45.7个拷贝的目标分子。

实施例3

PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒对临床样品的检测。

利用本发明的PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒对4个临床样品进行检测，同时与普通 PCR检测结果进行对比。结果如图3所示。

结果显示：4个临床样品中，PRRSV病毒RT-LAMP试剂盒检测出了2个阳性样品，其余2个为阴性样品，该检测结果与普通PCR检测结果100％相符。该结果说明本发明的PRRSV 病毒RT-LAMP检测试剂盒可用于临床样品的PRRSV病毒检测。

总之，本发明的PRRSV病毒RT-LAMP检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。该试剂盒不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测引物组及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcagtagttg cactcctttg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

agcttttctg ccacccaac 19

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gggccagaat gtacttgcgt tagaaacctg gaaattcatc acc 43

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gattgcggca aatgataacc acttttaacc cgggcaccaa tg 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tagcaagcac aaacggcatc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gctccactac ggtcaacgg 19

<210> 7

<211> 280

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ctcactatgg gagcagtagt tgcactcctt tggggggtgt actcagccat agaaacctgg 60

aaattcatca cctccagatg ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat tctggcccct 120

gcccaccacg ttgaaagtgc cgcacggttt catccgattg cggcaaatga taaccacgca 180

tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc cgggttaaaa 240

agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag 280

Claims

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于，该引物组包括6条引物，6条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，具体如下：

SEQ ID NO.1(PRRSV-F3):5′-gcagtagttgcactcctttg-3′

SEQ ID NO.2(PRRSV-B3):5′-agcttttctgccacccaac-3′

SEQ ID NO.3(PRRSV-FIP):5′-gggccagaatgtacttgcgttagaaacctggaaattcatcacc-3′

SEQ ID NO.4(PRRSV-BIP):5′-gattgcggcaaatgataaccacttttaacccgggcaccaatg-3′

SEQ ID NO.5(PRRSV-LF):5′-tagcaagcacaaacggcatc-3′

SEQ ID NO.6(PRRSV-LB):5′-gctccactacggtcaacgg-3′。

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10X LAMP反应缓冲液、对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料。

4.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料为HNB、钙黄绿素、SYTO-9、SYBR Green或Eva Green。

5.根据权利要求4所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的各组分及其含量如下：引物组3μL、10Units/μL AMV逆转录酶0.5μL、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、5M Betaine 10μL、10 X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB 2.4μL、用去离子水补足到40μL；

所述引物组中，各引物的摩尔浓度如下：PRRSV-F3和PRRSV-B3的摩尔浓度均为20μM，PRRSV-FIP和PRRSV-BIP的摩尔浓度均为160μM，PRRSV-LF和PRRSV-LB的摩尔浓度均为80μM。

6.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照质粒。

7.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：61℃,60min。