CN110669873B

CN110669873B - 一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重pcr体系的检测方法

Info

Publication number: CN110669873B
Application number: CN201911115378.5A
Authority: CN
Inventors: 黄涛; 石柯; 刘巧玲; 汤德元; 曾智勇
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2039-11-14
Also published as: CN110669873A

Abstract

本发明公开了一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，该方法的建立一方面可应用于临床样品的检测，另一方面为多重PCR诊断方法的建立奠定了基础，其技术方案如下：设计BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1特异性引物，提取病料DNA和RNA，并将RNA进行反转录，随后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确立最佳多重PCR反应体系及反应程序，按照最佳多重PCR反应条件进行试验，对该方法的特异性、敏感性及稳定性进行验证，同时进行临床样品检测以验证此方法操作的可行性，本发明不仅保留了单项PCR的高度特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种牛呼吸道综合征的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。

Description

一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法

技术领域

本发明涉及农业、畜牧业、动物防疫控制方面，特别是一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR诊断方法的建立，更具体地说，它涉及一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系及检测方法。

背景技术

随着贵州提出发展养牛业，规模化的牛场不断扩张壮大，据统计，养牛业中所发生疾病的65％是由于其感染牛呼吸道疾病综合征引起的，且该病的感染率甚至达到100％，死亡率也达到了35％或者更高，另外，牛单纯感染牛病毒性腹泻病(BVDV)等病毒也会导致其体重降低以及产奶量降低等，我国当前仍以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛合胞体病毒(BRSV)、牛副伤寒病毒(BPIV3)、牛冠状病毒(BCoV)和牛疱疹病毒(BHV1)造成的呼吸道疾病最为普遍和严重，现有的牛呼吸道综合征的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等，血清学方法包括中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验、血凝试验与血凝抑制试验，胶体金免疫层析，其中中和试验应用较为广泛，分子生物学方法灵敏度高、特异性好，该方法主要包括核酸探针、基因芯片、PCR检测等，而对于基因芯片来说，传统的芯片平台因依赖于荧光标记技术，需要昂贵的扫描设备进行扫描以及操作过程复杂，对技术要求较高，难以做到基层推广。

多重PCR即是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，与普通PCR相比，多重PCR具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低等优点，而且能够同时检测多种病原，利于对疾病作出快速、准确的诊断，适合大量临床病料中病原体的快速检测，适合推广。

发明内容

本发明要解决的主要技术问题在于提供一种快速检测六BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的多重PCR体系和多重PCR诊断方法，该PCR检测方法的建立克服了传统病原分离及常规血清学诊断方法费时费力、敏感性差及特异性差等缺点，该方法的建立为今后利用多重PCR检测方法开展物疫情临床诊断和研究提供理论依据，也为控制和消灭疫情奠定了基础，为此，本发明还提供一种用于上述方法的检测引物。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

利用生物学软件设计并合成特异性引物，用TE Buffer溶解并稀释合成好的特异性引物，按设定好的PCR反应体系及PCR反应程序进行引物扩增，并用琼脂糖凝胶电泳观察结果。

在本发明的一方面，提供一种BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的多重PCR检测方法，即

一种快速检测六种牛呼吸道综合症的多重PCR检测方法，具体步骤包括：

(1)BHV1病毒和MB的DNA的提取；

(2)BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病毒RNA的提取以及反转录；

(3)特异性引物设计与筛选；

(4)PCR反应条件优化；

(5)多重PCR扩增特异性验证；

(6)多重PCR敏感性验证；

(7)多重PCR稳定性验证；

(8)临床样品的检测；步骤(1)中，所述的BHV1病毒和支原体DNA的提取方法为：取适量BHV1和支原体病毒液，置于1.5mL Eppendorf管中，参照上海生物工程的DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

步骤(2)中，所述的)BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病毒RNA的提取以及反转录方法为：取BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病病毒液，参照Magen公司Hipure Viral RNA Spin Kit试剂盒说明书提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，按照Magen公司M-MLVH-FirstStandSynthesis Kit反转录试剂盒说明书进行，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

步骤(3)中，所述特异性引物设计与筛选具体为：采用DNAMAN软件对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1参考基因序列进行同源性分析，依据分析结果，应用PrimerPremier5.0软件针对各自保守区设计5对引物，并通过NCBI Blast对其特异性进行鉴定，筛选确定最终所用引物，确保所设计的引物能够扩增出相对应的目标产物，并且在实施多重PCR反应中，多对引物之间未出现任何交叉反应，即没有同源、互补，最终所确定的引物序列见表1。

表1 PCR特异性引物

步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择50μL的PCR反应体系，体系包含DNA与cDNA混合模板4μL，上下游引物浓度为6μmol/L，金牌(green)补足50μL，根据多重PCR条带的明亮，适当调整6对引物加入量的比例，退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、58.2℃、60.0℃，同时对循环次数的条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序，循环次数按照为30、35、40设置，等条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序。

步骤(5)中，所述的多重PCR扩增特异性验证具体方法为：同时用BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的6对特异性引物，分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1基因组为模板，同时以ddH2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应，以验证其特异性。

步骤(6)中，所述的多重PCR敏感性验证具体为：先将BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的标准DNA或者cDNA样品用超微量核酸蛋白测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续稀释分别将BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的模板稀释成数个浓度梯度，取每个稀释倍数的模板混匀后按照以上条件进行PCR扩增，测定多重PCR的敏感性。

步骤(7)中，所述的多重PCR稳定性试验验证具体为：以建立的多重PCR方法对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1重复检测6次，以验证结果的可靠性。

步骤(8)中，所述临床样品检测具体方法为：采集疑似病料，并按照上述(1)和(2)步骤进行处理，提取DNA或者RNA，按照已建立好的多重PCR体系进行扩增。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下的优点：

1.操作简单、结果明显：本发明设计的6对引物，Tm值相近，这就保证了在相同退火温度下，BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1都能得到很好的扩增，实验的操作过程简单只需要加入金牌MIX和上下游引物和DNA/cDNA模板即可，结果观察简单：出现139bp大小条带，则检测样品中含有BVDV；若出现239bp大小条带，则检测样品中含有BPIV3；若出现304bp大小条带，则检测样品中含有BRRV；若出现456bp大小条带，则检测样品中含有BCoV；若出现527bp大小条带，则检测样品中含有MB；若出现798bp大小条带，则检测样品中含有BHV1，若同时出现几条带，则检测样品中同时含相应的几种病毒，即表现为混合感染。

2.特异性强且反应快速，耗时短：本发明建立的检测方法显示，多重PCR均能特异性扩增出BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1条带与普通PCR检测方法相比，本实验采用的多重PCR灵敏度和准确性与单项PCR结果一样；与单项PCR及免疫学检测方法相比，多重PCR花费小、检测时间短、实验条件要求低。

3.一次能检查出疾病混合感染情况，减少漏诊几率，增加疾病治愈率。

附图说明

图1为本发明的不同退火温度进行的多重PCR反应的示意图；

其中：M:Marker DL1500；1-6退火温度分别为:50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、58.2℃、60.0℃；7:阴性对照。

图2为本发明的多重PCR敏感性试验结果的示意图；

其中：M:Marker DL1500；1:10^-1稀释；2:10^-2稀释；3:10^-3稀释；4:10^-4稀释；5:10^-5稀释；6:10^-6稀释；7:10^-7稀释；8:10^-8稀释；9:阴性对照。

图3为本发明中多重PCR的特异性试验结果的示意图；

其中：M:Marker DL1500；1:BVDV PCR产物；2:BPIV3PCR产物；3:BRSV PCR产物；4:BCoV PCR产物；5:MB PCR产物；6:BHV1PCR产物；7:BVDV、BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1多重PCR产物；8:PRV模板PCR产物；9:E.coli模板PCR产物；10:阴性对照。

具体实施方式

一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系体系及检测方法，包括以下步骤：(1)病毒DNA的提取：取BHV1病毒和支原体DNA的菌液150μL到离心管(1.5mL)中，分别加25μLOB Protease混合均匀后，于60℃水浴锅中水浴10min，期间进行震摇使之充分反应；水浴完成后，10000×g高速离心5min，弃去沉淀，取上清另置一新离心管中，加220μL Buffer BL混匀，水浴锅70℃水浴10min；后向离心管中加220μL无水乙醇溶液(室温)，快速混匀，然后将液体移入吸附柱并套上收集管，12000×g高速离心1min，弃去液体；更换收集管，向吸附柱中加入500μL Buffer HB，12000×g离心1min，弃液；再次更换收集管，吸附柱中加入DNAWash Buffer(预先加入酒精至终浓度为25mg/mL)700μL，10000×g高速离心1min，弃去液体；重复加入DNA Wash Buffer对DNA进行二次洗涤并离心，倒掉收集管中的液体，14000×g高速离心2min干燥吸附柱；用无菌离心管(1.5mL)替换收集管，在吸附柱内加入150μL的Elution Buffer，室温静置3min后，10000×g高速离心1min，将DNA从吸附柱中洗脱出来；再加150μL Elution Buffer对DNA进行二次洗脱，将溶液移至无菌离心管(1.5mL)-20℃保存备用。

(2)病毒RNA的提取及反转录：转移20μL Proteinase K至1.5mL离心管中；转移200μL样品，如唾液、肺部分泌物、培养液上清、或其它无细胞体液至装有Proteinase K的离心管中，振荡混匀5s，若样品不足200μL，用BufferPBS或Nuclease Free Water补足，固体组织样品先用Buffer PBS浸泡或匀浆后，离心取上清进行操作；转移200μL Buffer AL/CarrierRNA至样品中，涡旋混匀15s，使用前，按每1mL Buffer AL加入15μL Carrier RNA(1μg/μL)，该混合液室温可保存2d；56℃水浴10min；加入250μL无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀15s，室温静置3min；把HiPure Viral Micro Column装在2mL收集管中，转移混合液至柱子中，12000×g离心30-60s；倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入500μL Buffer VHB(已用无水乙醇稀释)至柱子中，12000×g离心30-60s，使用前Buffer VHB必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；倒弃滤液把柱子装回收集管中，加入500μL BufferRW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，12000×g离心30-60s，使用前Buffer RW2必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释；倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μL Buffer RW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，12000×g离心30-60s；倒弃滤液把柱子套回收集管，13000×g离心空柱3min甩干柱子；将柱子转移至新的1.5mL离心管，加入15-30μL Nuclease Free Water至柱子的膜中央，13000×g离心1min；弃去柱子，把RNA保存于-80℃备用；

利用Magen公司M-MLV H-First-Stand Synthesis Kit反转录试剂盒将提取的RNA进行反转录，反应体系为20μL，操作步骤如下：取RNA溶液6μL(RNA的量可根据其浓度进行适当调整)，Oligo(dT)20 1μL，d NTPs 1μL，Nuclease Free Water补足至13μL，将混合液置于65℃孵育5min，迅速取出置于冰上冷却1min；随后向反应液中加入5×M-MLV First StandBuffer 4μL，0.1M DTT 1μL，M-MLV RNase H-RT 1μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，轻柔吹打混匀后瞬间离心，经反应45℃30min，85℃10s后瞬间离心，将产物立即放置-20℃保存备用；

(3)特异性引物设计与筛选：根据Gene Bank中登录的BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的参考基因序列，采用DNAMAN软件对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1参考基因序列进行同源性分析，依据分析结果，应用Primer Premier5.0软件针对各自保守区设计6对引物，并通过NCBI Blast对其特异性进行鉴定，筛选确定最终所用引物，确保所设计的引物能够扩增出相对应的目标产物，并且在实施多重PCR反应中，多对引物之间未出现任何交叉反应，即没有同源、互补；

(4)PCR反应条件与体系：本发明所使用的PCR试剂为擎科生物生产，PCR反应条件优化具体方法为：选择50μL的PCR反应体系，体系包含DNA与cDNA混合模板4μL，上下游引物浓度为6μmol/L，金牌(green)补足50μL，根据多重PCR条带的明暗度，适当调整6对引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、58.2℃、60.0℃，同时对循环次数的条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序，循环次数按照为30、35、40设置，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序：多重PCR反应条件为：94℃5min；94℃45min，54.1℃45s，72℃30s，35个循环；72℃15min；

(5)多重PCR特异性验证：分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1基因组为模板，同时以ddH2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应，多重PCR扩增后，产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1分别扩增出139bp、239bp、304bp、456bp、527和798bp，与预期目的条带相符，6对引物对双蒸水、大肠杆菌(E.coli)、PRV均未出现任何扩增条带，结果显示与预期结果相一致，可见，多重PCR的特异性验证试验证实了这6对引物具有很强的特异性；

(6)多重PCR敏感性验证：首先利用超微量核酸蛋白测定仪测定BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1原始DNA/cDNA模板浓度，将DNA模板按10^-1-10^-8倍连续稀释成8个浓度梯度，按以上PCR反应体系与条件进行PCR扩增，结果显示，该mPCR BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV的最低核酸浓度检测量分别为：即最低核酸检测量分别为44pg、32pg、43pg、38pg、25pg和25pg，多重PCR敏感性试验验证了这6对引物对模板浓度的敏感性较高；

(7)多重PCR稳定性验证：以建立的多重PCR方法对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1重复检测6次，扩增结果均一致，表明建立的多重PCR方法具有较好的稳定性；

(8)临床样品检测：将采集好的样品经过研磨处理，按照上述(1)和(2)步骤进行DNA、RNA的提取，使用已经建立好的多重PCR反应体系对16份病料进行临床样品检测，结果显示16份样品中有12份为阳性病料，阳性率达75％，混合感染率达33.3％(4/12)，其中BVDV与BRSV的混合感染较为严重，达16.7％(2/12)，未见到3种以上的混合感染，该检测结果与单项PCR鉴定结果一致，符合率达100％，临床样品的检测验证了该方法的可行性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)BHV1病毒和MB的DNA的提取；

2)BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病毒RNA的提取以及反转录；

3)特异性引物设计与筛选；

4)对步骤3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化，从而建立最佳多重PCR反应体系；

5)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；

6)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；

7)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR重复性验证；

步骤3)中所述特异性引物的设计与筛选具体为：用DNAman对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1基因进行同源性分析，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应病毒的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，所述设计的引物序列为：

设计的BVDV病毒5’-UTR基因的上下游引物：

F:5′-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTTC-3′

R:5′-CTGTATTCGTAGCGGTTGGTTA-3′，片段139bp；

设计的BPIV3病毒gN基因上下游引物：

F:5′-GGAGTTATGCGATGGGTGTAG-3′

R:5′-TGTGGGTTTGTGAAAGGTTGT-3′，片段239bp；

设计的BRSB病毒gN基因上下游引物：

F:5′-AGGTAGCTCCAGAATACAGGC-3′

R:5′-GCAAAGATTCCTTCAACCCTA-3′，片段304bp；

设计的BCoV病毒gN基因上下游引物：

F:5′-AGCGATGAGGCTATTCCGA-3′

R:5′-TGTGGGTGCGAGTTCTGC-3′，片段456bp；

设计的MB上uvrC基因上下游引物：

F:5′-AGTAATATGCTTGATTCCTT-3′

R:5′-ATGTTTCTTAGTTTGCCTTC-3′，片段527bp；

设计的BHV1病毒gB基因上下游引物：

F:5′-CCCCGACAACAGCACAGAC-3′

R:5′-CAGTCCCAGGCTACCGTCA-3，片段798bp；

所述一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法不是以疾病诊断为目的。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的BHV1病毒和支原体DNA的提取方法为：取适量BHV1病毒和MB液，置于1.5mLEppendorf管中，然后提取DNA，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病毒RNA的提取以及反转录：取BVDV、BRSV、BPIV3和BCoV病毒液，然后提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择50μL的PCR反应体系，体系包含DNA与cDNA混合模板4μL，上下游引物浓度为6μmol/L，金牌(green)补足50μL，根据多重PCR条带的明暗度，适当调整6对引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、58.2℃、60.0℃，同时对循环次数的条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序，循环次数按照为30、35、40设置。

5.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中最佳多重PCR条件具体为：50μL反应体系中6对引物上下游混合引物6μL，DNA/cDNA混合模板4μL，金牌(green)补足50μL；多重PCR反应条件为：94℃5min；94℃45min，54.1℃45s，72℃30s，35个循环；72℃15min。

6.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中多重PCR扩增特异性验证具体为：同时用步骤3)中的6对特异性引物，分别以PRV、大肠杆菌(E.coli)、BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1基因组为模板，同时以ddH2O为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行PCR反应，以验证其特异性。

7.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤6)所述的多重PCR敏感性验证具体为：先将BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的标准纯化后的DNA或者cDNA样品用超微量核酸蛋白测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续稀释分别将BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1的模板稀释成数个浓度梯度，按照步骤4)中的最佳PCR反应条件进行扩增，测定多重PCR的敏感性。

8.根据权利要求1所述的一种快速检测六种牛呼吸道综合症多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤7)所述的多重PCR稳定性验证具体为：以步骤4)中建立的多重PCR方法对BVDV、BPIV3、BRSV、BCoV、MB和BHV1重复检测6次，以验证结果的可靠性。