CN108531659A - 一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒 - Google Patents

一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测牛流行热病毒的RT‑PCR引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述RT‑PCR引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测牛流行热病毒的RT‑PCR试剂盒。试剂盒提供的RT‑PCR检测方法实验结果显示，本发明提供的RT‑PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出牛流行热病毒，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，适合基层使用，可作为牛流行热病毒实验室快速鉴别和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒。
背景技术
牛流行热是由牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus, BEFV）引起牛的急性、热性的传染疾病。患病动物临床上表现为突然发热、精神沉郁、僵硬、流泪、跛行等。本病有明显的季节性，多发生于雨量多和气候炎热的6月~9月。该病的发病率高达80%，而在无并发症的情况下病死率较低，很少超过2%~3%，但是过度肥胖的牛病死率可高达30%。一般认为本病可经过呼吸道感染以及吸血昆虫的叮咬等进行传播。
Schwinfuth于1867首次在东非报道牛流行热，随后津巴布韦、印度尼西亚、日本等国都有报道。我国是1976年首次分离到BEFV。该病毒为单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科，暂时热病毒属。现诊断牛流行热的方法很多，可根据临床症状以及病理变化做出初步诊断，还可以通过ELISA、补体结合试验、中和试验等技术进行诊断，但是这些试验都存在缺点，即反应时间长、材料多、检测时间具有明显的滞后性。而且，血清学诊断方法存在着种间的交叉反应、非特异性反应，极大阻碍了血清学方法的应用，影响检测效果。
然而，RT-PCR这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。由于G蛋白是BEFV主要的免疫原性蛋白，因此，本发明以G基因为靶基因设计特异性引物，建立一种RT-PCR快速检测方法，为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。
发明内容
针对养牛业健康发展的实际需要，本发明的目的是建立一种低成本、快速、准确地检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
本发明提供一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物由具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。
优选的，所述RT-PCR引物是依据牛流行热病毒的G基因进行设计，扩增的目的片段大小为235 bp。
优选的，所述的RT-PCR引物在制备检测牛流行热病毒试剂盒的应用。
本发明还提供一种如以上所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，所述RT-PCR试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，所述RT-PCR试剂盒还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、cDNA模板和超纯水。
优选的，所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25pmol/μL。
优选的，所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mMTris-HCL。
优选的，所述RT-PCR试剂盒中RT-PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95℃ 30 s，50 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
优选的，所述RT-PCR试剂盒的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将RT-PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带；首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了235 bp的特异性条带，则说明该样品存在牛流行热病毒；如果样品没有扩增出235 bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛流行热病毒。
由于G蛋白是BEFV主要的免疫原性蛋白，因此，本发明以G基因为靶基因设计特异性引物，建立一种RT-PCR快速检测方法，为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法特异性检测出牛流行热病毒，所检测的阴性对照病原（溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型）和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高
本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法灵敏度高，最小检测限为8.01×10-4 ng/μL。
3）耗时少、成本低廉
与通过病原分离鉴定来检测相比，本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行RT-PCR，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的RT-PCR检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是最佳退火温度筛选试验结果，其中M：DNA marker DM2000、1：47 ℃、2：48℃、 3：49 ℃、4：50 ℃、 5：51 ℃、6：52 ℃、N：水对照；结果显示，所设计的引物对退火温度包容性强，在退火温度为47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带。
图2特异性检测结果，其中M：DNA marker DM2000、1：牛流行热病毒、2：溶血性曼氏杆菌、3：化脓性隐秘杆菌、4：多杀巴氏杆菌、5：大肠杆菌、6：肺炎克雷伯氏杆菌、7：牛传染性鼻气管炎病、8：牛副流感病毒3型、9：水对照。
图3是本发明敏感性检测结果：其中M：DNA marker DM2000、1：8.01×101 ng/μL、2： 8.01×100 ng/μL、3：8.01×10-1 ng/μL、4：8.01×10-2 ng/μL、5：8.01×10-3 ng/μL、 6：8.01×10-4 ng/μL 、7：8.01×10-5 ng/μL、8：8.01×10-6 ng/μL、 9：水对照。
图4是临床样品的RT-PCR检测结果，其中M：DNA marker DM2000、其中，泳道P：阳性对照；N：阴性对照；泳道3、4、7、8、9、13、15为阳性结果；泳道1、2、5、6、10、11、12、14、16、17、18、19为阴性结果。
具体实施方式
实施例1 建立快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法
1、材料的准备
牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、DNA/RNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit购自康为世纪生物科技有限公司。
2 、RT-PCR引物的设计与合成
根据GenBank 中的牛流行热病毒G基因序列进行同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，利用Oligo 7.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
Forward primer：5’- CTGTAGGTGCAATAGTCACAA-3’
Reverse primer：5’- AAGAACCTATCATCACCGATT-3’
扩增的目的基因片段大小为235 bp，
上、下游引物使用前稀释到25 pmol/μL 。
3、模板RNA的提取
使用DNA/RNA提取试剂盒提取试验毒株的RNA，以及疑似牛流行热病毒感染引起病变组织的RNA，再使用反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA。
4、PCR反应体系建立
所述的快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法，其反应体系建立以25 μL计
10×PCR Buffer 5 μL
dNTPs（10mM each ） 2 μL
ES-Taq DNA聚合酶（5U/μL） 1 μL
Forward primer（25 pmol/μL） 1 μL
Reverse primer（25 pmol/μL） 1 μL
cDNA模板 2 μL
超纯水 补足25 μL。
5、RT-PCR反应程序
所述的快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的所述的PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 30s，50 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了235 bp的特异性条带，则说明该样品存在牛流行热病毒；如果样品没有扩增出235 bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛流行热病毒。
7、特异性检测
以提取的试验株和对照株的基因组RNA/DNA（RNA先进行反转录为cDNA）进行PCR扩增，检验PCR方法的特异性。
8、敏感性检测
将牛流行热病毒的RT-PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测。
9、重复性检测
用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
10、临床样品检测
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组RNA，使用建立的RT-PCR方法进行扩增。
实施例2快速检测牛流行热病毒RT-PCR方法的退火温度试验
分别对退火温度47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃进行RT-PCR扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性大，在退火温度为47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。为此，本PCR方法使用的反应程序为： 95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 30 s，50 ℃ 35 s，72℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
实施例3 检测牛流行热病毒RT-PCR方法的特异性检测结果
提取牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型，使用优化好的反应体系和反应程序进行RT-PCR/PCR扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有牛流行热病毒样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，7株对照株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带，为阴性结果（图2），表明本方法具有很好的特异性。
实施例4检测牛流行热病毒RT-PCR方法的的敏感性检测结果
牛流行热病毒RT-PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的PCR检测方法最低检测限为8.01 ×10-4 ng/μL（图3）。
实施例5牛流行热病毒RT-PCR方法的准确性和稳定性检测结果
用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的RT-PCR检测方法重复性好、稳定性高。
实施例6 牛流行热病毒RT-PCR方法的初步应用
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用DNA/RNA提取试剂盒（CW0548S，北京康为世纪生物科技有限公司）提取组织样品的病原基因组RNA，再使用反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit（CW2569M，北京康为世纪生物科技有限公司）将RNA反转录为cDNA，按试剂盒说明书进行，以此为模板，使用建立的PCR方法进行扩增。结果显示，有7份样品检测出牛流行热病毒的特异性条带，为阳性结果（图4展示了19份样品的检测结果）。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒
<141> 2018-05-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
ctgtaggtgc aatagtcaca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 2
aagaacctat catcaccgat t 21

Claims (9)

1.一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述RT-PCR引物由具有SEQID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述RT-PCR引物是依据牛流行热病毒的G基因进行设计，扩增的目的片段大小为235 bp。
3.根据权利要求1所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述的RT-PCR引物在制备检测牛流行热病毒试剂盒的应用。
4.一种如权利要求1所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、cDNA模板和超纯水。
6.根据权利要求4或5所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol/μL。
7.根据权利要求5所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mM Tris-HCL。
8.根据权利要求4或5所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒中RT-PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 30 s，50 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
9.根据权利要求4或5所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将RT-PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带；首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了235 bp的特异性条带，则说明该样品存在牛流行热病毒；如果样品没有扩增出235 bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛流行热病毒。
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