CN113481220A - 一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1及其pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1及其pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种奶牛血液中与酮病相关的编码基因CYP1A1，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本发明还涉及了与酮病相关的编码基因CYP1A1的PCR检测试剂盒以及该试剂盒的用途。本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在CYP1A1基因，即酮病奶牛血液中含有93bp核苷酸序列的CYP1A1基因，以特异性引物通过PCR技术验证了CYP1A1基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中CYP1A1基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。

Description

一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1及其PCR检测试 剂盒
技术领域
本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1及其PCR检测试剂盒。
背景技术
奶牛酮病是围产期高产奶牛常见的一种以高酮血症、高酮乳症和高酮尿症为主要临床特征的糖脂代谢障碍性疾病。随着奶牛生产周期从妊娠期转变至泌乳期，奶牛能量需求急剧增加，而干物质摄入量减少，导致能量负平衡，引发脂肪动员，导致高非酯化脂肪酸(nonesterified fatty acids，NEFA)血症，引发酮病。酮病奶牛机体存在严重的代谢紊乱，在细胞水平上，代谢异常产物增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，导致奶牛系统性的氧化应激，并增加乳房炎和子宫内膜炎等感染性疾病的发病率，影响奶牛的整体健康状况，损害奶牛的繁殖性能，并显著降低产奶量，严重影响奶业健康发展。
细胞色素酶P450是一组含铁血红素超家族，因还原型P450与一氧化碳具有特殊的亲和力，二者的复合物在分光光度计的450nm处有特异吸收峰而得名。P450有三大家族:CYP1、CYP2、CYP3,是内源性、外源性物质转化酶系的主要成员。细胞色素P450 1A1(CYP1A1cytochrome P450,family 1,subfamily A,polypeptide 1)是细胞色素P450家族的一个亚型，是活性氧产生的重要调节因子，可通过过量产生ROS诱导氧化应激，当细胞内ROS过量产生时，抗氧化剂和氧化剂之间的平衡被打破，过剩的ROS从多不饱和脂肪酸中提取一个氢原子，形成4-羟基壬烯醛(HNE)和丙二醛(MDA)。HNE和MDA的半衰期比ROS长，它们可以从原来的位置扩散到远距离的细胞内和细胞外靶点，从而放大氧化应激的影响。因此对围产期疾病的奶牛血液中CYP1A1含量的变化进行检测，可以为进一步探讨奶牛围产期疾病的发病机制，预防奶牛围产期疾病提供更可靠的理论依据。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1的核苷酸序列。
本发明的第二目的是提供一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因CYP1A1的PCR检测试剂盒，解决分离血清蛋白、生化鉴定等传统方法繁琐、费力、耗时、外界影响因素多，结果不稳定的问题。
本发明的第三目的是提供上述PCR检测试剂盒的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二、一种与酮病相关的编码基因CYP1A1的PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中的引物序列如下：
正向引物：AGAGGCTGGACGAGAATGCC(SEQ ID NO.2)；
反向引物：TGACTGTGTCAAACCCGGCT(SEQ ID NO.3)。
进一步的，所述试剂盒还含有ddH2O、2XTaq Master Mix、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。
进一步的，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
进一步的，所述阳性对照为健康奶牛血液中CYP1A1基因表达的DNA样品。
进一步的，所述阴性对照为酮病奶牛血液中CYP1A1基因表达的DNA样品。
三、上述的PCR检测试剂盒在检测和鉴定酮病奶牛氧化应激中的应用。
采用上述技术方案的积极效果：本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在CYP1A1基因，即酮病奶牛血液中含有93bp核苷酸序列的CYP1A1基因，以特异性引物通过PCR技术验证了CYP1A1基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中CYP1A1基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。
附图说明
图1是PCR鉴定CYP1A1基因的图片，其中泳道M为：DL500 Marker，泳道1为奶牛CYP1A1基因片段(93bp处有目的条带)；
图2是PCR鉴定CYP1A1基因在奶牛血液中分布和片段大小图片；其中泳道M为：DL500 Marker；泳道1为健康奶牛CYP1A1基因片段(93bp处有目的条带)；泳道2为酮病奶牛CYP1A1基因片段(93bp处有目的条带)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明生物学信息学方法鉴定CYP1A1基因的分布。
在NCBI，使用Blastn在线比对软件(http：//blast.ncbinlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索CYP1A1基因，搜索结果表明奶牛机体中含有CYP1A1基因(SEQ IDNO.1)，且基因长度为93bp的核苷酸序列，在提取RNA检测浓度并定量后反转录为cDNA，其中健康奶牛血液中CYP1A1基因表达量较高；酮病奶牛血液中CYP1A1基因表达量极高；二者在93bp均可见条带。生物信息学鉴定结果显示CYP1A1特异性良好，可用于建立快速检测奶牛血液中CYP1A1的PCR方法方法(图1)。
实施例2
本实施例说明试剂盒的制备。
引物设计与合成：以CYP1A1基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳检测用引物，其核酸序列如下表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0003232850640000031
上述引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有双蒸水(ddH20)、2XTaq Master Mix等。
实施例3
本实施例说明试剂盒的使用。
(1)提取样品基因组RNA；检测提取样品中RNA浓度，定量后反转录为cDNA.。提取样品RNA步骤为：(a)取处理后的组织及粪便上清液和血液，加入Trizol裂解液进行裂解。将2mL EP管中的液体混匀后使用旋涡振荡器进行剧烈的震荡，置于冰上静置放置10min。(b)加入200uL氯仿，将EP管剧烈摇晃1min，使其能更好的萃取核酸，冰上静置10min。(c)12000r/min离心时间为15min，抽取试管中透明液体的三分之二上清液，加入等量的异丙醇轻轻的混匀。冰上静置10min。(d)12000r/min离心时间为10min，进行75％无水乙醇(用DEPC水配)的配置。(e)弃去上清，加入1mL配制好的75％无水乙醇，轻轻摇晃EP管。(f)8000r/min4℃离心6min，弃掉上清，EP管室温晾干10min以去除管中的75％无水乙醇。加入10uL DEPC无菌水溶解沉淀。(e)测得所提取RNA浓度后进行计算统一浓度(g)将RNA按照试剂盒说明书进行反转录成cDNA，放置于-20℃备用。
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述CYP1A1基因检测引物对；PCR检测液配置：双馏水(ddH2O)：9uL；上游引物：1uL；下有引物：1uL；DNA样品：1.5uL；2XTaq Master Mix：12.5uL；共25uL。
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；PCR反应条件设置为：(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。
(4)PCR反应结束后，分析结果。
实施例4
本实施例说明试剂盒检测奶牛血液中CYP1A1基因特异性鉴定。
采用实施例2所述试剂盒中的引物，以不同生理病理状态下奶牛血液组分别为模板，PCR方法鉴定CYP1A1基因在不同状态下奶牛血液的分布特点。
PCR反应体系为(25uL)：9uL双蒸水(ddH20)，12.5uL2XTaq Master Mix，CYP1A1-F1uL，CYP1A1-R 1μL，模板l.5uL。
PCR程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。
PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明所有以奶牛血液基因组为模板的泳道中均有143bp目的条带(图1)，表明以实施例2所述试剂盒中特定的CYP1A1扩增引物，可以通过PCR方法快速检测出酮病奶牛血液中CYP1A1基因。
实施例5
本实施例说明试剂盒在牛场的应用。
采用实施例2中试剂盒，检测5头健康奶牛血液和5头酮病奶牛血液。可快速准确检测出CYP1A1基因。具体步骤如下：
(1)样品采集
本样品采自黑龙江省某牛场。
(2)PCR方法检测样本中CYP1A1基因
将采集血液提取RNA定量后反转录为cDNA，PCR反应体系为(25uL)：9uL双蒸水(ddH20)，12.5uL 2XTaq Master Mix，CYP1A1-F 1uL，CYP1A1-R 1uL，模板l.5uL。PCR程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出93bp的CYP1A1条带。结果显示健康奶牛，酮病奶牛都有目的条带，分别为泳道1、2(图2)。
本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在CYP1A1基因，即酮病奶牛血液中含有93bp核苷酸序列的CYP1A1基因，以特异性引物通过PCR技术验证了CYP1A1基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中CYP1A1基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1及其PCR检测试剂盒
<141> 2021-08-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 431
<212> DNA
<213> 奶牛(Bos taurus)
<400> 1
gcccgnttgg aggtttttct cttcttggcc atcctgctgc atcaggtgga attctgtgtg 60
accccgggtg tgaaggtgga catgaccccc gtgtacgggc tgaccatgaa gcacgcccgc 120
tgtgagcact ttcaggcgca catgcgctct taggggacag gcagccctgn agcctagaca 180
gcccatgcgc tcttggggga cagacagccc tgtccctgtc tgggcagcca ggccaggggc 240
ctagcccagg ggagcctaaa acccacagac attgtcgggc tgactttttt gctgtctgag 300
ctgtgggcaa gcctgaggga tcatacctgc cccctaccct ggacttgtcc ttcttcacag 360
tgaccacaga tagtggacac atcaggggcc acacaggagc tgatggagcc cttccaaagt 420
tgtgctggaa g 431
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaggctgga cgagaatgcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgactgtgtc aaacccggct 20

Claims (7)

1.一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于快速检测奶牛血液中与酮病相关的编码基因CYP1A1的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的引物序列如下：
正向引物：AGAGGCTGGACGAGAATGCC(SEQ ID NO.2)；
反向引物：TGACTGTGTCAAACCCGGCT(SEQ ID NO.3)。
3.根据权利要求1所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有ddH2O、2XTaqMaster Mix、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为健康奶牛血液中CYP1A1基因表达的DNA样品。
6.根据权利要求4所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为酮病奶牛血液中CYP1A1基因表达的DNA样品。
7.权利要求1所述的PCR检测试剂盒在检测和鉴定酮病奶牛氧化应激中的应用。
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