CN112176076B - 一种与山羊生长性状相关的nfat5基因分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与山羊生长性状相关的NFAT5基因分子标记及其应用，所述的分子标记位于山羊NFAT5基因5’侧翼序列中；所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为392bp，该序列包括部分5’侧翼序列(‑1～‑238bp)和部分5’非翻译区序列(+1～+154bp)组成，在该序列中第222bp处存在一处C>G碱基突变，将该突变命名为c.‑454C>G；本发明还提供了与山羊生长性状关联的SNP检测试剂盒，包括：如SEQ ID NO.2～3所示的引物对；如SEQ ID NO.4所示的SNaPshot单碱基延伸引物。本发明发掘了新的与山羊生长性状相关联分子标记，实现了对山羊生长性状进行早期选择，检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响。

Description

一种与山羊生长性状相关的NFAT5基因分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及山羊分子标记筛选技术领域，尤其涉及一种与山羊生长性状相关的NFAT5基因分子标记及其应用。

背景技术

我国山羊饲养历史悠久，是常见的居民肉食来源。近年来，全球山羊养殖规模不断扩大，尤其中国更是山羊养殖大国。随着消费者对于健康饮食要求的不断增长，由于羊肉具有健康、安全的营养特性，促使其在肉类消费中的比重不断上升。包括体重体尺在内的生长性状是山羊生产中最为重要的经济性状。因此，研究如何通过选育提高山羊的生长性状对于山羊产业和山羊育种研究来说都具有十分重要的意义。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)指的是由个体间基因组中同一位置单个核苷酸(A、T、C和G)发生变异所引起的DNA序列的多态性，主要包括碱基的转换、颠换、插入或缺失等四种形式。SNP具有数量多、分布广、杂合率低、遗传稳定性好、适用于高通量自动化检测等特点。因此，SNP可作为分子育种、基因定位、群体进化等研究的首选工具。分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种。具有快速、准确、不受环境影响的优点，从而加快育种速度，尤其对于低遗传力性状和难以测量的性状具有更大的优势。随着应用基因组学、分子生物学和分子遗传学理论技术的不断发展，MAS技术能有效的加快山羊重要经济性状的选择进展，可对我国山羊产业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

活化T细胞核因子5(Nuclear factor of activated T-cells 5,NFAT5)基因是转录因子蛋白Rel家族的一员，其在高渗透压情况下被磷酸化激活，发挥调节细胞内外的渗透压平衡。有研究发现，NFAT5可以显著促进小鼠卵泡颗粒细胞的增值，表明其可能调控卵泡的发育，从而影响产羔数。迄今为止，尚无有关山羊NFAT5基因做为山羊生长性状的分子标记的研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了与山羊生长性状关联的分子标记及其应用，本发明发掘了与山羊生长性状关联的分子标记，为山羊生长性状的分子标记辅助育种提供了一种新的分子标记。

本发明的目的之一在于提供一种与山羊生长性状关联的分子标记，所述的分子标记位于山羊NFAT5基因5’侧翼序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为392bp，在该序列中第222bp处存在一处C>G碱基突变。

优选地，所述序列中第222bp处的C或G的碱基多态性位点，表现为CC、CG或GG三种基因型，其中C优势等位基因。

本发明的目的之二在于提供所述的分子标记在山羊生长性状标记辅助选择中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种山羊NFAT5基因序列中与山羊生长性状关联SNP的检测试剂盒，包括：

用于扩增包含c.-454C>G位点的SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

以及一个用于检测c.-454C>G位点的SNaPshot单碱基延伸引物如SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测山羊NFAT5基因序列中与山羊生长性状相关SNP的方法，包括以下步骤：

步骤1、以从待测山羊血液样本中提取的基因组DNA为模板，利用选自所述SEQ IDNO.2～3所示PCR引物对构建PCR扩增体系进行扩增，并对PCR产物进行纯化处理；

步骤2、以所述纯化的PCR产物为模版，利用选自所述SEQ ID NO.4所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；

步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。

优选地，所述步骤1中PCR扩增体系还包括PCR Mix；所述PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，38个循环；72℃延伸5min。

优选地，所述步骤2中所述纯化的PCR产物为经SAP和ExoI酶处理后PCR产物；SNaPshot反应体系还包括Reaction Mix试剂；PCR扩增条件为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环。

本发明的目的之五在于提供所述的检测试剂盒在山羊生长性状标记辅助选择中的应用。

本发明的有益效果：

本发明发掘了与山羊生长性状关联的分子标记，位于山羊NFAT5基因5’侧翼序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为392bp，在该序列中第222bp处存在一处C>G碱基突变；本发明首次发掘了该分子标记，并与山羊生长性状相关联，实现了对山羊生长性状进行早期选择，检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响。

附图说明

图1是山羊NFAT5基因SEQ ID NO.1序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2是本发明中山羊NFAT5基因5’侧翼序列中c.-454C>G位点的GeneMapper V4.0软件读取结果图；A图：GG基因型；B图：CG基因型；C图：CC基因型。

具体实施方式

实施例1山羊NFAT5基因SNP检测片段的获得及检测方法的建立

1、山羊基因组DNA的提取

本发明的试验山羊品种为麻城黑山羊、波尔山羊和黑头羊(波尔山羊与麻城黑山羊杂交品种)，样本均来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。山羊基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP348)进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。

2、山羊NFAT5基因SNP遗传标记检测片段的获得

(1)PCR扩增

根据山羊NFAT5基因(Gene ID:102173116)的基因组序列中的SNP遗传标记检测序列(如SEQ ID NO.1所示)设计一对引物，扩增多态性位点的片段(图1)。扩增含有c.-454C>G位点的片段SEQ ID NO.1序列引物如下：

上游引物PF：5'GAGACACCTCGGTTCCCCTA 3'(SEQ ID NO.2所示)

下游引物PR：5'TCCTCTGCGAAAACTGACGG 3'(SEQ ID NO.3所示)

以波尔山羊、麻城黑山羊和黑头羊基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：PCR Mix为10μL，0.5μmol/L上游引物，0.5μmol/L下游引物，模板DNA2为50ng，加去离子水补充至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性4min；然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒(货号：B610353)进行纯化，具体步骤参见说明书。

3、SNaPshot方法检测分子标记

根据山羊NFAT5基因的基因组序列中的SNP遗传标记检测序列(如SEQ ID NO.1所示)设计c.-454C>G位点的SNaPshot延伸引物，引物序列如下：

5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACGTGACCCCTTCGGA 3'(SEQ ID NO.4所示)。

在15μL纯化后的PCR产物中加入5U SAP和2U Exo I，震荡混匀，37℃保温1h，然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶；使用Applied Biosystems公司的SNaPshot MultiplexKit将处理后的15μL PCR产物吸出3μL进行SNaPshot检测，PCR反应体系10μL，Reaction Mix试剂5μL，SAP和ExoI酶处理后PCR产物3μL，延伸引物各0.5μL，去离子水1μL，PCR扩增程序为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环，4℃保存；将SNaPshot产物稀释20倍，稀释体系为Hi-Di Formamide 9.25μL，GS-120LIZ 0.25μL,SNaPshot产物0.5μL，反应体系为95℃变性5min，冰浴4min；配制含有350μLHi-Di甲酰胺和50μL Matrix标准品的混合液，95℃变性5min，迅速冰冷5min，平分2管，分装至上机板后对3730XL DNA Analyzer仪器进行光谱校正；使用3730XL DNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号；最后使用GeneMapper V4.0软件对实验结果进行分析，获得c.-454C>G位点的基因型结果(如图2所示)。

实施例2本发明制备的分子标记在山羊群体中的多态性分布检测

本实施例分别在波尔山羊、黑头羊和麻城黑山羊群体中检测山羊NFAT5基因5’侧翼序列中c.-454C>G位点的多态性，检测结果如表1所示。

表1-山羊c.-454C>G位点在不同山羊群体中基因型频率和等位基因频率

由表1结果可知：c.-454C>G位点除了在麻城黑山羊中不存在GG基因型外，在波尔山羊、黑头羊群体中均表现为三种基因型，其中基因型以纯合型占据优势，GG基因型存在比例较低。在波尔山羊、黑头羊和麻城黑山羊群体中优势等位基因保持一致，c.-454C>G位点在三个山羊群体中等位基因C均为优势等位基因。

实施例3本发明制备的山羊NFAT5 c.-454C>G分子标记与周岁生长性状的关联分析及应用

为了确定山羊NFAT5基因5’侧翼序列中c.-454C>G位点与黑头羊周岁生长性状差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，分析山羊NFAT5基因中c.-454C>G位点的三种基因型与山羊周岁生长性状的相关性。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行c.-454C>G位点基因型与周岁生长性状的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ikjlm＝μ+G_i+F_k+A_j+S_l+P_m+e_ikjlm

Y为性状表型值，μ为单个性状的平均值，G_i为基因型效应，F_k为场次固定效应，A_j为年龄固定效应，S_l为性别固定效应，P_m为胎次固定效应，e为随机误差。

在100头黑头羊群体中进行c.-454C>G位点三种基因型与包括周岁体重、体尺等信息的生长性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示。

表2-c.-454C>G位点与黑头羊周岁生长性状的关联分析

注：a和b表示差异显著(P<0.05)，A和B表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异极显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

由表2可知，在黑头羊群体中，NFAT5基因c.-454C>G位点的CC基因型在山羊周岁体重、周岁体斜长和周岁胸围这三个重要生长指标中高于CG基因型，其中CC基因型的周岁体重指标极显著高于CG基因型(P<0.01)，周岁体斜长和周岁胸围指标则为显著差异(P<0.05)。上述分析说明，NFAT5基因c.-454C>G位点与上述周岁生长性状之间存在显著或极显著的关联。因此，CC纯合基因型个体在周岁体重、周岁体斜长和周岁胸围等生长性状方面表现更好，GG基因型个体的周岁生长性状较差。在育种过程中，可以通过早期检测进行留种选择，当个体在NFAT5基因c.-454C>G位点表现为CC基因型，则表明该个体具有较好的生长性状潜力。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1：

GAGACACCTCGGTTCCCCTAGGTTTGTGTCCTCCTGAGCTCAGCTTGGAGCTGGGCCGGCCGCCTCCGGCTTGCCGCCACCAGGTCGGTGCAAATACCTTTTCCCTCCCCGGGGCCCCAGGCGCGGACACCTCCCAGCCTCCCTCCCTCTCGGCAGGCGGGGCCGTTTCCCAGCTCATGAACAGCAGCCCGGGGCCGCGGCAGCAGGAAGCGGAGAGGAGCSCTTGTTGATGCTGTTCCGTGGCGCGCCTCCCCGCCCTCCGGCAGTCGCTTGGGCTATTCCCTGCTCTGGGCAGCTCCCCTCCGCGCCTGCGCAATGCCTCGCGGGAGGCGGGGCTCAGATTCCTGTCAGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGACCGTCAGTTTTCGCAGAGGA

说明：第222bp处的简并碱基S代表C或者G

SEQ ID NO.2：

GAGACACCTCGGTTCCCCTA

SEQ ID NO.3：

TCCTCTGCGAAAACTGACGG

SEQ ID NO.4：

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTGTTCTTAATAAACTCACTCC

序列表

<120> 一种与山羊生长性状相关的NFAT5基因分子标记及其应用

<141> 2020-10-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 392

<212> DNA

<213> Capra hircus

<400> 1

gagacacctc ggttccccta ggtttgtgtc ctcctgagct cagcttggag ctgggccggc 60

cgcctccggc ttgccgccac caggtcggtg caaatacctt ttccctcccc ggggccccag 120

gcgcggacac ctcccagcct ccctccctct cggcaggcgg ggccgtttcc cagctcatga 180

acagcagccc ggggccgcgg cagcaggaag cggagaggag cscttgttga tgctgttccg 240

tggcgcgcct ccccgccctc cggcagtcgc ttgggctatt ccctgctctg ggcagctccc 300

ctccgcgcct gcgcaatgcc tcgcgggagg cggggctcag attcctgtca gcggcggcgg 360

cggtggcggc gaccgtcagt tttcgcagag ga 392

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gagacacctc ggttccccta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcctctgcga aaactgacgg 20

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tttttttttt tttttttttt tttttttcct ttgttcttaa taaactcact cc 52

Claims (8)

1.一种与山羊生长性状相关的NFAT5基因分子标记，其特征在于：所述的分子标记位于山羊NFAT5基因5’侧翼序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为392bp，在该序列中第222bp处存在一处C>G碱基突变。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述序列中第222bp处的C或G的碱基多态性位点，表现为CC、CG或GG三种基因型，其中C为优势等位基因。

3.权利要求1-2任一所述的分子标记在山羊生长性状标记辅助选择中的应用。

4.一种与山羊生长性状相关联的NFAT5基因SNP的检测试剂盒，其特征在于，包括：

用于扩增包含c.-454C>G位点的SEQ ID NO.1所示序列的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

以及一个用于检测c.-454C>G位点的SNaPshot单碱基延伸引物如SEQ ID NO.4所示。

5.一种使用权利要求4所述检测试剂盒检测与山羊生长性状相关联的NFAT5基因SNP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以从待测山羊血液样本中提取的基因组DNA作为模板，合成选自所述SEQ IDNO.2～3所示PCR引物对进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；

步骤2、以所述纯化的PCR产物为模板，通过选自所述SEQ ID NO.4所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；

步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增体系还包括PCR Mix；所述PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，38个循环；72℃延伸5min。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述纯化的PCR产物为经SAP和ExoI酶处理后PCR产物；SNaPshot反应体系还包括Reaction Mix试剂；PCR扩增条件为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环。

8.权利要求4所述的检测试剂盒在山羊生长性状标记辅助选择中的应用。

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