CN117887864A - 奶山羊产奶性状相关的分子标记及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术与家畜育种领域，具体涉及奶山羊产奶性状相关的分子标记及其产品和应用；本发明以奶山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增奶山羊TIMP1基因部分片段，直接测序鉴定该基因g.62954946G>A突变位点基因型。根据其与产奶性状关联分析结果，TIMP1基因的这一单核苷酸多态性位点的不同基因型与奶山羊产奶量显著关联，可作为奶山羊分子标记辅助开展早期选择育种，快速建立高产奶山羊种群。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与家畜育种领域，具体涉及奶山羊产奶性状相关的分子标记及其产品和应用。
背景技术
当涉及动物品种改良和新品种选育过程时，遗传标记作为一种重要的选择手段在分子育种中起着不可或缺的作用。目前，单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)作为一个有效的第三代遗传标记被广泛采用。目前我们可以通过全基因组重测序的方法，获取个体的基因组信息，进而通过比对和质控得到不同个体之间的SNP等遗传变异信息。进一步通过研究和分析SNP位点，我们可以追踪和识别与特定性状相关的基因或基因组区域。这为我们提供了一种快速而准确的方式来选择具有所需性状的个体，从而加速动物品种改良和新品种选育的进程。SNP作为一种高效、准确的遗传标记，可以帮助我们理解基因组的特点，并加速优良性状的选择和培育过程。
尤其是全基因组关联分析方法的使用，可以通过基因组信息与表型数据相结合，用统计学的回归分析的方法进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，从而发现影响复杂性状的基因变异，从而对动物选种选育进行指导。再通过芯片等方法进行早期选择，可以实现加快选择速率，提高遗传进展的目的。
TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1)基因位于山羊18号染色体，又称TIMP金属肽酶抑制剂1。该基因属于TIMP基因家族。该基因家族编码的蛋白质是基质金属蛋白酶(MMP)的天然抑制剂，MMP是一组参与细胞外基质降解的肽酶。除了对大多数已知的MMP的抑制作用外，编码的蛋白质还能够促进多种细胞类型的细胞增殖，并且还可能具有抗凋亡功能。该基因的转录对许多细胞因子和激素的反应是高度诱导的。乳脂是哺乳动物所分泌的乳汁中必要的成分之一，哺乳动物在泌乳期间，从循环系统中摄取脂质前体物质，如脂肪酸、甘油等，并在细胞内酶的参与下合成、转运和分泌。此外还作为一种生长因子，调节细胞分化、迁移和细胞死亡，并通过CD63和ITGB1激活细胞信号级联。在整合素信号传导中起作用。乳腺在每个妊娠阶段发育过程中，经历大量的细胞凋亡和更新，TIMP1基因作为具有促进细胞增殖功能的蛋白质编码基因，在其中有着潜在的功能作用。结合其功能和全基因组关联的结果来看，TIMP1基因可作为潜在的影响奶山羊泌乳性能的候选基因。
目前，国内外尚未见报道奶山羊TIMP1基因的多态性研究及其与奶山羊产奶性状的遗传相关性。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了奶山羊产奶性状相关的分子标记及其产品和应用，具体涉及奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性(SNP)的分型检测及其在分子标记辅助早期选择育种中的应用。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种奶山羊产奶性状相关的分子标记，所述分子标记为单核苷酸多态性位点，选自奶山羊TIMP1基因突变位点g.62954946G>A。
进一步的，上述一种奶山羊产奶性状相关的分子标记，所述单核苷酸多态性位点包括3种基因型，包括GG、AG、AA。
进一步的，上述一种奶山羊产奶性状相关的分子标记，所述奶山羊TIMP1基因序列第62954946位突变位点g.62954946G>A的AA基因型为提高产奶量水平的DNA标记。
本发明还公开了上述奶山羊产奶性状相关的分子标记的检测方法，包括以下步骤：
以奶山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增奶山羊TIMP1基因的部分片段，然后对扩增产物直接测序，根据测序结果鉴定奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点选自奶山羊TIMP1基因突变位点g.62954946G>A。
进一步的，上述奶山羊产奶性状相关的分子标记的检测方法，所述PCR的扩增引物对为：
上游引物：5’-ATGGAACAGCTTCACCAACCA-3’
下游引物：5’-ACGCCTCTTCGAGACAGAAC-3’。
进一步的，上述奶山羊产奶性状相关的分子标记的检测方法，所述PCR采用的反应程序为：94.0℃预变性5min；98.0℃变性10s，65.0℃复性15min，进行30个循环；72.0℃终延伸7min。
本发明还公开了上述奶山羊产奶性状相关的分子标记或其检测方法在奶山羊分子标记辅助选择育种中的应用
进一步的，上述应用中，所述奶山羊优选为西农萨能奶山羊。
本发明还公开了一种奶山羊产奶性状相关的分子标记的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性位点的引物对，所述单核苷酸多态性位点选自山羊TIMP1基因序列第62954946位突变位点g.62954946G>A。
进一步的，上述检测试剂盒中，所述引物对为：
上游引物：5’-ATGGAACAGCTTCACCAACCA-3’
下游引物：5’-ACGCCTCTTCGAGACAGAAC-3’
与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明以奶山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增奶山羊TIMP1基因部分片段，直接测序鉴定该基因g.62954946G>A突变位点基因型。根据其与产奶性状关联分析结果，TIMP1基因的这一单核苷酸多态性位点的不同基因型与奶山羊产奶量显著关联，可作为奶山羊分子标记辅助开展早期选择育种，快速建立高产奶山羊种群。
进一步的，本发明提供的试剂盒以奶山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增和直接测序，可以简便、准确地检测奶山羊TIMP1基因外显子区SNP位点(g.62954946G>A)在奶山羊(如，西农萨能奶山羊)群体中的不同基因型。根据对奶山羊TIMP1基因的上述SNP位点与奶山羊产奶经济性状进行关联分析的结果，本发明检测的奶山羊TIMP1基因SNP位点存在作为提高奶山羊产奶量性状的DNA分子标记(SNP标记)，可在产奶量性状的早期选择中应用，以快速建立高产奶性状的奶山羊遗传资源群体。
附图说明
图1为奶山羊TIMP1基因片段(含g.62954946G>A位点)扩增产物测序图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
本实施例利用PCR扩增及直接测序方法对奶山羊TIMP1基因(GenBank登录号NC_030828.1)g.62954946G>A突变位点在西农萨能奶山羊群体中可能产生的多态性进行检测，并将其不同基因型与奶山羊产奶性状进行关联分析，揭示其可以作为奶山羊分子育种辅助选择的分子标记，具体说明如下。
1.试验动物
本试验以298只西北农林科技大学萨能羊原种场和浙江省杭州市建德市大慈岩镇湖塘自然村葆元牧业有限公司萨能奶山羊为检测对象，选用足月正常分娩、健康的泌乳母羊进行血样的采集以及产奶量的收集。
2.实验药品与试剂
2.1.血样DNA提取使用血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，购自天根生化科技有限公司。
2.2.琼脂糖凝胶电泳所需试剂：①DL2,000DNA Marker，购自TAKARA宝生物工程有限公司；②10,000×GeneGreen Nucleic Acid Dye，购自天根生化科技有限公司；③10×Loading Buffer，购自TAKARA宝生物工程有限公司；⑤琼脂糖，购自基因生物技术国际贸易有限公司。
2.3.PCR扩增所需试剂：TaKaRa LA Taq(5U/μL)、10×LA Taq BufferⅡ(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(2.5mM each)，均购自TAKARA宝生物工程有限公司。
2.4.本实例中所有试剂配制方法均参考TAKARA宝生物工程有限公司PCR扩增说明书，用水均使用去离子超净水。高温灭菌条件为120℃、
30min。
3.合成TIMP1基因SNP位点引物
本实例所需引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，根据NCBI序列设计的可扩增包含奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A突变位点的引物，具体序列如下：
上游引物：5’-ATGGAACAGCTTCACCAACCA-3’＝SEQ ID No.1
下游引物：5’-ACGCCTCTTCGAGACAGAAC-3’＝SEQ ID No.2。
以上述引物进行PCR扩增，其扩增产物包含奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A突变位点，可直接送公司测序分型。
4.表型值的获取与数据统计
4.1.西农萨能奶山羊产奶量表型值的获取
产奶量基础数据来自2022年～2023年西北农林科技大学萨能羊原种场和浙江省杭州市建德市大慈岩镇湖塘自然村葆元牧业有限公司通过测定、记录获得的表型数据。剔除表型数据3倍标准差外的极端值，保存供后续关联分析使用。
5.PCR扩增奶山羊TIMP1基因目的片段
5.1.西农萨能奶山羊血样采集
在2022年～2023年间，从西北农林科技大学萨能羊原种场和浙江省杭州市建德市大慈岩镇湖塘自然村葆元牧业有限公司对298只西农萨能奶山羊进行血样采集。每只静脉取血5mL于DETA-K2抗凝采血管(PET)，快速带回实验室，-80℃冻存。
5.2.血样基因组DNA的提取及检测
血样DNA的提取方法，参照天根生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书，提取完成的样品于-80℃保存。DNA样品使用紫外分光光度计(NanoDrop1000，Thermo)检测浓度(μg/mL)和260nm和280nm处的吸光值；使用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性。
5.3.奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点检测及基因分型
PCR扩增具体反应体系见表1，反应程序见表2。PCR产物的浓度以及特异性利用1％的琼脂糖凝胶电泳30min(120V)检测，结果显示PCR产物符合质量要求，遂送往北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。
利用Snapgene软件分析送回的测序结果(图1)，可直接进行基因分型，获得TIMP1基因SNP位点的基因型数据。
表1PCR反应体系(25μL)
表2 PCR反应程序
6.奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点的遗传多态性指标
通过对TIMP1基因g.62954946G>A位点的分型数据直接计算，获得其基因频率、有效等位基因数(number of effective alleles,Ne)、基因纯合度(homozygosity,Ho)、基因杂合度(heterozygosity,He)和多态信息含量(polymorphisminformation content,PIC)等数据；并且利用卡方适应性检验测定Hardy-Weinberg平衡状态。结果可见，西农萨能奶山羊TIMP1基因第62954946位突变位点(g.62954946G>A)为一个SNP位点，具体信息如表3所示：
表3奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点的遗传多态性指标
7.奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点的遗传效应关联分析
奶山羊TIMP1基因的g.62954946G>A位点与产奶及乳成分性状关联分析中，基因型数据来自PCR扩增后直接测序获得的基因型，奶山羊产奶及乳成分性状数据包括300d产奶量(kg)，分析结果如表4所示。
具体分析过程，采用GMAT软件进行进行关联分析，模型如公式1：
y＝Xβ+Zkγk+ξ+p+e(1)
公式中，y为表型向量，Xβ为群体结构效应和场、胎次等固定效应，Zkγk为待检验标记效应，ξ～N(0,Kφ2)为多基因效应，p～N(0,Iσp2)为系统环境效应,e～N(0,Iσ2)为残差效应。多基因效应中的K为标记推断的亲缘关系矩阵。
表4奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点的多态性与产奶性状的关联分析
注：P-value表示奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点与产奶性状关联程度；P<0.05黑体标粗表示差异显著，不同基因型间用肩标小写字母表示。
由表4可知，g.62954946G>A突变位点与产奶量关联显著(P＜0.05)，GG基因型产奶量最高，优于AG、AA基因型个体。可见，奶山羊TIMP1基因g.62954946G>A位点突变对西农萨能奶山羊产奶性状有较大的遗传效应，可作分子标记辅助选择的候选标记，为选育优良西农萨能奶山羊提供科学资料。
综上可知，本发明提供了一种PCR-直接测序法检测奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性标记(g.62954946G>A位点)的方法，并将其与产奶性状进行关联分析，发现其不同基因型与奶山羊产奶性状显著关联，存在可用于开展奶山羊早期选择育种的辅助分子标记，可快速建立羊乳品质遗传资源优良的奶山羊种群，加快良种选育。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明专利的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种奶山羊产奶性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为单核苷酸多态性位点，选自奶山羊TIMP1基因突变位点g.62954946G>A。
2.根据权利要求1所述的奶山羊产奶性状相关的分子标记，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点包括3种基因型，包括GG、AG、AA。
3.根据权利要求1所述的山羊产奶性状相关的分子标记，其特征在于，所述奶山羊TIMP1基因序列第62954946位突变位点g.62954946G>A的AA基因型为提高产奶量水平的DNA标记。
4.如权利要求1所述的分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
以奶山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增奶山羊TIMP1基因的部分片段，然后对扩增产物直接测序，根据测序结果鉴定奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点选自奶山羊TIMP1基因突变位点g.62954946G>A。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR的扩增引物对为：
上游引物：5’-ATGGAACAGCTTCACCAACCA-3’
下游引物：5’-ACGCCTCTTCGAGACAGAAC-3’。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR采用的反应程序为：94.0℃预变性5min；98.0℃变性10s，65.0℃复性15min，进行30个循环；72.0℃终延伸7min。
7.如权利要求1-3任一项所述的分子标记或如权利要求4-6任一项所述的检测方法在奶山羊分子标记辅助选择育种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述奶山羊为西农萨能奶山羊。
9.一种奶山羊产奶性状相关的分子标记的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增奶山羊TIMP1基因单核苷酸多态性位点的引物对，所述单核苷酸多态性位点选自山羊TIMP1基因序列第62954946位突变位点g.62954946G>A。
10.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为：
上游引物：5’-ATGGAACAGCTTCACCAACCA-3’
下游引物：5’-ACGCCTCTTCGAGACAGAAC-3’。
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