CN109957614B - 一种山羊cmtm2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊CMTM2基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14‑bp插入/缺失多态性位点的基因型。相关分析结果发现，山羊CMTM2基因的14‑bp插入/缺失多态性的不同基因型与陕北白绒山羊的产羔数性状存在显著相关关系，存在提高山羊产羔数性状的DNA标记。本发明提供的检测山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的方法，可应用于山羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良山羊遗传资源群体。

Description

一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性(InDel)位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择(MAS)育种中的应用。

背景技术

近些年来随着生物技术的迅速发展，人们利用高通量测序、分子标记等先进生物技术和信息技术手段，建立起了常规育种与分子育种相结合的平台，使育种工作实现了由经验向科学的根本性转变，大幅度的提高了育种效率。自1950年以来，畜禽育种工作取得了巨大的进展，数量遗传理论逐步形成了主要育种手段，被应用到动物育种实践中，畜牧生产水平也得到了极大的提高。进入20世纪80年代以来，畜禽遗传改良的速度呈现了变慢的趋势，虽然经历了相对长期的选择，但是急需寻求一种突破性的育种方法。在这一时期中，以分子数量遗传学为理论基础的分析育种方法应运而生。随着分子生物学等技术的发展，DNA分子标记逐渐产生，使畜禽数量性状图谱越来越系统和完善，即分子遗传标记技术的成熟。一些数量性状位点的确定，为畜禽改良提供了新的有效手段，与经济性状关联的DNA分子标记和功能基因的挖掘，为如何利用分子遗传标记对数量性状基因型进行辅助选择提供了新思路。从基因型水平上，分子标记辅助育种通过寻找与重要性状紧密连锁的DNA分子标记，加快了育种进程，实现了对目标性状的直接选择，提高了育种效率。畜禽遗传改良的多数目标性状都是数量性状，标记辅助选择可以提高畜禽育种效率(薛梅2015)。

插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的改变，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的DNA片段。与SNP相比，InDel均是源于单突变事件，其突变频率较低，相对比较稳定，在结构上属于二等位基因多态性，能够通过很小的扩增子(<50bp)进行扩增。

InDel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15个碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，InDel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点。InDel多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，在畜禽上则集中在对鸡生长性状的研究，在反刍动物上研究和应用甚少。由此，对反刍家畜的功能性基因的InDel标记研究亟待开拓和深入。

随着人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但近年来羊肉、羊奶、羊绒等羊产品严重短缺。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，通过对在DNA水平上筛查的与山羊产羔数性状密切相关的DNA标记进行基因多态性的检测，以及基因多态性与产羔数性状的关联分析，从而利用MAS加快建立优良产羔数性状山羊种群一直是关注热点。

山羊CMTM2基因位于18号染色体上，具有4个外显子与3个内含子，长度约为2.2kb，其cDNA可以编码248个氨基酸的完整开放阅读框。CMTM2蛋白存在着跨膜与分泌两种形式，其结构与功能介于趋化因子与四次跨膜蛋白之间，具有极强的疏水性。此外还含有如LXXLL、FXXLY和FXXFF等可以与雄激素受体(Androgen Receptor，AR)相结合的模体结构(Liu et al.,2009)。CMTM2的异常表达与精子发生缺陷密切相关，随着精子发生缺陷的加重，支持细胞综合征(SCOS)患者睾丸CMTM2阳性细胞数量和mRNA水平明显下降，甚至无表达，组织学特征为睾丸小管生殖上皮完全丧失(Liu et al.,2007)。CMTM2基因的表达具有组织特异性，仅在少数几种组织中表达，如睾丸、卵巢、胎盘、外周血细胞等，其中在睾丸中可以高度表达(Shi et al.,2005)。但是，目前尚未见到关于CMTM2基因InDel位点及其与产羔数性状存在显著相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良性状的山羊遗传资源群体。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定待测山羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型。

优选的，所述插入/缺失多态性位点选自山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性位点。

优选的，所述引物对P1为：

上游引物：5'-AGTGCCCTTTTCTCCTCCTA-3'(20nt)；

下游引物：5'-TGACCCTCCACTACCTCTTT-3'(20nt)。

优选的，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为145bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为145bp和131bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为131bp一条带纹。

一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增上述山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态位点的引物对(例如，上述引物对P1)。

上述山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)可以作为提高山羊产羔数的DNA标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA)设计引物，以山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

本发明对山羊(例如，陕北白绒山羊)CMTM2基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与山羊生产性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为山羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立产羔数性状优良的山羊种群，提高良种选育速度。

附图说明

图1为山羊CMTM2基因扩增产物(引物对P1)的琼脂糖凝胶电泳结果；M表示Marker。

图2为山羊CMTM2基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示14-bp缺失序列：NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用PCR方法对所发现的山羊CMTM2基因第-861到-848位点(参考序列：NC_030825.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊产羔数性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》；

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌；②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)lmL、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL；

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL；②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计山羊CMTM2基因InDel位点扩增引物

在NCBI上检索山羊CMTM2基因的序列(NC_030825.1)，并利用Primer 5.0设计能够扩增CMTM2基因多个候选InDel位点DNA片段的引物，其中能够扩增山羊CMTM2基因启动子第-861到-848位区域InDel位点的PCR引物对为P1。引物对P1序列见表1(2018年11月设计完成)。

表1.山羊CMTM2基因InDel位点扩增引物表

参见图2，上述引物对P1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊CMTM2基因启动子区的候选InDel位点(NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA)的片段。理论上，当-861到-848位之间的序列TGGTAATGCCCCAA缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是131bp大小的带纹；当-861到-848位之间的序列TGGTAATGCCCCAA存在(插入)时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是145bp大小的带纹；当-861到-848位之间的序列TGGTAATGCCCCAA在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是大小分别为145bp和131bp的带纹。

3.以引物对P1PCR扩增待测山羊CMTM2基因片段

3.1山羊耳组织样品的采集

实验所用的动物共计1131个样本，具体信息见表2。产羔数性状数据由保种场或养殖场工作人员测量，采取个体耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表2.采样信息

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL山羊基因组DNA)0.6μL；去离子水4.9μL；共13μL。

3.7PCR反应的程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。

4.扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.5μL，点样后120V电压电泳1.0～1.2h；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析InDel多态性；

对于陕北白绒山羊CMTM2基因-861到-848位存在的14-bp插入/缺失多态性(14-bpInDel)位点(NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA)，其在不同山羊个体中的多态性分析结果参见图1，PCR的扩增产物(引物对P1)经琼脂糖凝胶电泳检测之后，所扩增的对应插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为145bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为145bp和131bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为131bp一条带纹。分析结果经测序进行了验证。

5.山羊CMTM2基因InDel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_YY＝N_YY/N，其中P_YY代表某一位点的YY基因型频率；N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_Y＝(2N_YY+N_Ya1+N_Ya2+N_Ya3+N_Ya4+……+N_Yan)/2N

式中，P_Y表示等位基因Y频率，N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数量，N_Yai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1～an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

陕北白绒山羊样本CMTM2基因14-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率及等位基因频率如表3所示。

表3.山羊CMTM2基因InDel位点基因频率分布表

6.山羊CMTM2基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；生产数据：陕北白绒山羊的头胎产羔数。

关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与产羔数性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型：Y_ijlm＝μ+S_i+HYS_j+G_l+e_ijlm；其中，Y_ijlm：个体表型记录；μ：总体均值；S_i：产仔年限效应；HYS_j：山羊群体均值；G_l：基因型的固定效应；e_ijlm：随机误差。关联分析结果如表4所示。

表4.山羊CMTM2基因InDel位点与陕北白绒山羊产羔数性状关联分析

注：平均值肩上字母不同表示差异显著

由表4可以看出，在对1131只陕北白绒山羊的产羔数性状研究中，CMTM2基因14-bpInDel多态性对产羔数有显著影响(P<0.05)，II基因型个体性状优于ID和DD基因型个体。因此，山羊CMTM2基因14-bp插入/缺失多态性位点(NC_030825.1:g.35582961_35582974delTGGTAATGCCCCAA)的II基因型可作为山羊产羔数的DNA分子标记。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测山羊CMTM2基因14-bp插入/缺失多态性位点(NC_030825.1:g.35582961_35582974del TGGTAATGCCCCAA)的基因型，并将其与陕北白绒山羊的头胎产羔数进行关联分析，发现了可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，为利用InDel实现山羊产羔数性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践依据。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agtgcccttt tctcctccta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgaccctcca ctacctcttt 20

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> NC_030825.1:g.35582961_35582974位插入/缺失序列

<400> 3

tggtaatgcc ccaa 14

Claims (5)

1.山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性位点在山羊分子标记辅助选择育种中应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型作为提高陕北白绒山羊头胎产羔数的DNA标记；

所述插入/缺失多态性位点的核苷酸序列为TGGTAATGCCCCAA。

2.一种山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：山羊CMTM2基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊CMTM2基因启动子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

所述插入/缺失多态性位点选自山羊CMTM2基因NC_030825.1:g.35582961_35582974位14-bp插入/缺失多态性位点；

所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型作为提高陕北白绒山羊头胎产羔数的DNA标记；

所述插入/缺失多态性位点的核苷酸序列为TGGTAATGCCCCAA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR采用的引物对为：

上游引物：5'- AGTGCCCTTTTCTCCTCCTA -3'；

下游引物：5'- TGACCCTCCACTACCTCTTT -3'。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95 ℃预变性5min；94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，25个循环；72 ℃延伸10 min；所述电泳采用质量浓度为3.5% 的琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为145bp一条带纹，插入/缺失基因型表现为145 bp和131 bp两条带纹，缺失/缺失基因型表现为131 bp一条带纹。

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