CN111118179B - 一种检测鲁西黑公羊胸深性状的dna检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法及其应用，以待测鲁西黑公羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果筛选具有优良胸深性状的鲁西黑公羊，该方法不仅可以利用IGF2BP1基因建立快速鉴定具有优良胸深性状的鲁西黑公羊遗传资源的群体，同时也可以筛选具有优良胸深性状的绵羊遗传资源群体。

Description

一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的体高，人们在肉质食品的选择更加趋于多元化，逐渐将关注热点集中在其是否具有高营养的特征上来。羊肉因而以其肉质鲜美、高蛋白、低脂肪等优点被人们所关注。在动物科学研究领域，为了提高绵羊的出肉率而如何选育出具有更加优良生长性状的绵羊个体一直是动物遗传育种中的一个关键问题。

随着各物种的遗传图谱的进一步完善和基因组的测序工作的完成以及分子生物学的飞速发展，分子育种的方式将会和传统的育种方法相结合，共同解决动物的遗传育种问题。

标记辅助选择(Marker-assisted Selection，MAS)技术是指根据某个遗传标记对其在DNA水平上进行检测从而快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，提高对畜禽优势新品种选育的准确性和效率。插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)作为一种第三代遗传标记，其广泛存在于基因组中且具有双等位基因的特点；相比于SNP，其具有突变频率低，稳定性较好，而且由于具有长度多态性的特点可以直接通过简单的PCR方法进行快速检测。InDel标记作为一种长度多态性标记，现已经广泛用于图位克隆、基因定位、遗传图谱构建等领域，尤其是在标记辅助选育中具有很大的潜力。

随着基因组学、比较基因组学以及全基因组关联性分析(GWAS)的深入研究，已经有大量的InDel位点被发现，其为理论研究和遗传选育应用研究提供了大量的生物信息。然而，对于其具有什么样的功能仍然是未知的，并且对于这些InDel位点与动物生长、繁殖性状的关联分析的研究仍然比较少。因此，在培育具有优良生长性状的绵羊育种目标上，通过对在分子水平上筛选与绵羊生长性状密切相关的DNA标记进行基因多态性的检测，以及基因多态性与生长性状的关联分析，从而利用MAS加快建立具有优良生长性状绵羊种群一直是关注热点。

绵羊IGF2BP1基因位于11号染色体上，具有15个外显子和14个内含子，长度约为39.9kb，其具有三种转录变体，对应编码三种蛋白质亚型。该IGF2BP1基因(又称IMP1、CRD-BP)是IGF2BP家族的重要一员，其可编码一种RNA结合蛋白，在IGF信号通路中起着重要的作用。IGF2BP1在多个物种中高度保守，对其蛋白质结构的研究发现，其含有四个KH(K同源)结构域和两个RRMs(RNA识别基序)。IGF2BP1可通过KH结构域与经m6A修饰的靶mRNA分子结合，而调节其稳定性、分布区域和翻译能力。现有研究已表明，IGF2BP1可结合IGF2、PTEN、ACTB、MAPK4、MKI67、c-MYC和CD44等与生长增殖有关的mRNA分子而调节其表达水平，进而影响细胞的生长和增殖。另外，表观遗传学方面的研究表明诸多非编码RNA，包括miRNA、lncRNA以及circRNA，可以通过结合IGF2BP1来间接调控靶mRNA分子的稳定性、翻译能力和分布区域。IGF2BP1还可通过与YBX1顺式结合在位于核孔处的mRNA，进而形成mRNP(mRNA-蛋白质复合体)。对IGF2BP1的诸多研究表明，其高表达于早期胚胎以及至少16种癌细胞中，然而在成人组织的表达则仅局限于生殖细胞中。由于其不仅能够影响细胞的生长和增殖，而且能够促进胚胎的发育，因而在对人类以及动物的早期胚胎发育过程的机制研究也具有重要的意义。综上所述，由于其对细胞的生长、增殖的促进作用以及对早期胚胎发育的影响，IGF2BP1很有可能对家畜的生长性状有着一定的影响。然而，目前尚未见到关于IGF2BP1基因InDel位点与绵羊胸深生长性状存在显著相关的报道。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法及其应用，该方法不仅可以利用IGF2BP1基因建立快速鉴定具有优良胸深性状的鲁西黑公羊遗传资源的群体，同时也可以筛选具有优良胸深性状的绵羊遗传资源群体。

一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法，包括如下步骤：

以待测鲁西黑公羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断，只有97bp带纹的为插入/插入基因型，即II基因型；只有88bp带纹的为缺失/缺失基因型，即DD基因型；两者都有的为插入/缺失基因型，即ID基因型；ID基因型的个体公羊胸深性状优于其他基因型个体。

进一步的，上述插入/缺失多态性位点选自绵羊IGF2BP1基因NC_019468.1:g.37072382-37072390位9-bp插入/缺失多态性位点。

进一步的，上述引物对P1包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ.ID.NO1所示，所述下游引物序列如SEQ.ID.NO2所示。

进一步的，上述PCR扩增的反应体系和程序为：

PCR体系为13μL，包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液)6.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为10ng/μL绵羊基因组DNA)0.6μL；去离子水4.9μL。

PCR程序为95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸12s，14个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，34个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供一种用于检测鲁西黑公羊胸深性状的试剂盒，含有所述引物对P1。

上述检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。

上述试剂盒在快速鉴定具有优良胸深性状的绵羊遗传资源的群体中的应用。

有益效果：

(1)本发明根据绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域插入/缺失多态性位点(参考序列NC_019468.1:g.37072382-37072390)设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

(2)本发明对绵羊(例如，鲁西黑头羊)IGF2BP1基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_019468.1:g.37072382-37072390)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与绵羊胸深性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为绵羊公羊胸深性状的分子标记位点，从而加快建立具有优良生长性状的绵羊种群，提高良种选育速度

附图说明

图1为绵羊IGF2BP1基因扩增产物(引物对P1)的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为绵羊IGF2BP1基因PCR扩增产物测序图。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

本发明利用PCR方法对所发现的绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域(参考序列：NC_019468.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与绵羊公羊胸深性状进行关联分析，验证其是否存在可以作为绵羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：Tris、EDTA、NaCl、HCl、NaOH、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、硼酸、琼脂糖等，普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×102KPa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》；

1)提取组织样DNA所用溶液

①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌；

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL；

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL；

②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲基苯氰FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计绵羊IGF2BP1基因InDel位点扩增引物

在NCBI上检索绵羊IGF2BP1基因的序列(NC_019468.1)，并利用Primer 5.0设计能够扩增IGF2BP1基因多个候选InDel位点DNA片段的引物，其中能够扩增绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域InDel位点的PCR引物对为P1(引物设计完成时间2019年9月30日)。引物对P1序列见表1。

表1.绵羊IGF2BP1基因InDel位点扩增引物表

上述引物对P1对绵羊基因组扩增，能够扩增包含绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域的候选InDel位点(NC_019468.1:g.37072382-37072390)的片段。理论上，当IGF2BP1基因第4个内含子区域g.37072382-37072390之间的序列AGCGTAATA缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是88bp大小的带纹；当序列AGCGTAATA存在(插入)时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是97bp大小的带纹；当序列AGCGTAATA在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是大小分别为97bp和88bp的带纹。

3.以引物对P1 PCR扩增待测绵羊IGF2BP1基因片段

3.1绵羊组织样品的采集

实验所用的动物共计345个样本，具体信息见表2。生长性状数据由原种场工作人员测量，采取个体耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表2.鲁西黑头羊采样信息

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.绵羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至10ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液)6.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为10ng/μL绵羊基因组DNA)0.6μL；去离子水4.9μL；共13μL。

3.7PCR反应的程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸12s，14个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，34个循环；72℃延伸10min。

4.扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样6μL，点样后120V电压电泳40～50min；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD GelDoc 2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析位点多态性；

对于鲁西黑头羊IGF2BP1基因第4个内含子区域存在的9-bp插入/缺失多态性(9-bp InDel)位点(NC_019468.1:g.37072382-37072390)，其在不同绵羊个体中的多态性分析结果参见图1(M表示Marker)，PCR的扩增产物(引物对P1)经琼脂糖凝胶电泳检测之后，所扩增的对应插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(即II基因型)表现为97bp一条带纹，插入/缺失基因型(即ID基因型)表现为97bp和88bp两条带纹，缺失/缺失基因型(即DD基因型)表现为88bp一条带纹。分析结果经测序进行了验证(参见图2)，图2中的上面为II基因型，其下面为DD基因型，其中：黑色方框标出的部分表示9-bp缺失序列(如SEQ.ID.NO.3所示)：NC_019468.1:g.37072382-37072390delAGCGTAATA；rs590848099。

5.绵羊IGF2BP1基因InDel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PYY＝NYY/N，其中PYY代表某一位点的YY基因型频率；NYY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PY＝(2NYY+NYa1+NYa2+NYa3+NYa4+……+NYan)/2N

式中，PY表示等位基因Y频率，NYY表示群体中具有YY基因型的个体数量，NYai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1～an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

2)统计结果

鲁西黑头羊样本IGF2BP1基因9-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率及等位基因频率如表3所示。

表3.鲁西黑头羊(LXBH)IGF2BP1基因InDel位点基因频率分布表

6.绵羊IGF2BP1基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

生产数据：鲁西黑头羊的生长性状。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件来分析该品种中基因型与生长性状的相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型：Yijkl＝μ+Si+DESj+Gk+eijkl；其中，Yijkl：个体表型记录；μ：总体均值；Si：性别效应；DESj：不同群体的均值；Gk：基因型的固定效应；eijkl：随机误差。关联分析结果如表4所示。

表4.IGF2BP1基因9-bp InDel位点与鲁西黑头羊生长性状关联分析

注：平均值肩上字母不同表示差异显著；没有显著相关性的性状未展示出来。

由表4可以看出，在对345只鲁西黑头羊的生长性状研究中，IGF2BP1基因9-bpInDel多态性对胸深性状有显著影响(P<0.05)。其中，ID基因型个体公羊胸深性状优于其他基因型个体。因此，绵羊IGF2BP1基因9-bp插入/缺失多态性位点(NC_019468.1:g.37072382-37072390)的ID基因型可作为绵羊公羊胸深性状的DNA分子标记。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测绵羊IGF2BP1基因9-bp插入/缺失多态性位点(NC_019468.1:g.37072382-37072390)的基因型，并将其与鲁西黑头羊公羊的生长性状进行关联分析，发现了可以作为绵羊公羊胸深分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的绵羊IGF2BP1基因插入/缺失多态性的检测方法，为利用InDel实现绵羊公羊胸深性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践依据。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttttttagat ttctcatggg tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attttcagag atgtggatgg ac 22

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 序列

<400> 3

agcgtaata 9

Claims (4)

1.一种检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测鲁西黑公羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊IGF2BP1基因第4个内含子区域插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断，只有97bp带纹的为插入/插入基因型，即II基因型；只有88bp带纹的为缺失/缺失基因型，即DD基因型；两者都有的为插入/缺失基因型，即ID基因型；ID基因型的个体公羊胸深性状优于其他基因型个体；

所述插入/缺失多态性位点选自绵羊IGF2BP1基因NC_019468.1 :g.37072382-37072390位9-bp插入/缺失多态性位点，其中9-bp插入/缺失的序列如SEQ.ID.NO3所示；

所述引物对P1包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ.ID.NO1所示，所述下游引物序列如SEQ.ID.NO2所示。

2.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系如下所述：

PCR体系为13μL，包括2×Taq PCR SuperMix 6.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；基因组DNA 0.6μL；去离子水4.9μL。

3.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR程序如下所述：

95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，14个循环，每循环后退火温度减1 ℃；50 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。

4.如权利要求1-3任一项所述的检测鲁西黑公羊胸深性状的DNA检测方法在鲁西黑公羊分子标记辅助选择育种中的应用。

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