CN110904247B

CN110904247B - 一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN110904247B
Application number: CN201911385215.9A
Authority: CN
Inventors: 何礼邦; 蓝贤勇; 毕谊; 王若兰; 李洁; 潘传英; 朱海鲸; 屈雷; 陈宏�
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN110904247A

Abstract

本发明公开了一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用。该方法是通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳鉴定山羊Sox9基因中的一个InDel位点的多态性，根据对InDel位点与山羊生长性状进行的关联性分析，发现该Sox9基因InDel位点的不同基因型与陕北白绒山羊胸围之间存在显著相关，提示所述InDel位点的基因型可作为提高山羊胸围的DNA标记，本发明的检测方法可以在山羊生长性状的标记辅助选择育种中应用，快速建立优良的山羊遗传资源群体。

Description

一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊Sox9基因NC_030826.1:g.58090106_58090109位4-bp插入/缺失多态性(InDel)位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择(MAS)育种中的应用。

背景技术

近年来随着生物技术的不断发展，人们利用高通量测序、分子标记等先进技术手段，建立起常规育种与分子育种相结合的渠道，使育种工作实现了由经验向科学的根本性转变，大幅度的提高了育种效率。在分子水平上以DNA多态为标记进行遗传分析，识别个体基因差异，从而产生了分子遗传标记，随着畜禽数量性状图谱越来越完善，为畜禽改良提供了有效手段。分子标记辅助选择通过寻找与重要性状紧密连锁的DNA分子标记，加快了育种进程，实现了对目标性状的直接选择，提高了育种效率。

在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是其应用的前提和关键。插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是一种DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性，其片段长度在1-50bp之间。利用InDel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行InDel检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。

插入和缺失是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，InDel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15个碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失。InDel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为遗传学鉴定标记，与SNP相比，均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10^-8，相对比较稳定：在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增被高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记，InDel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的InDel频率仅次于SNP位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。2005年Schnabel等人结合SSR标记和InDel标记对控制奶牛产奶量进行了研究，并成功进行了精细定位，同时提出InDel和SNP的形成机制可能不同。但对反刍家畜的功能性基因的InDel标记的研究亟待开拓和深入。

随着对山羊产品的需求不断加强，在高产、优质和高效的山羊育种目标上，如何提高山羊生长性状一直是关注热点。Sox(SRY-type HMG box)是在动物中发现的一类编码转录因子的基因家族，产物具有一个HMG基序保守区，参与诸如性别决定、骨组织的发育、血细胞生成、神经系统的发育等多种早期胚胎发育过程。Sox9基因是被报道的第一个含有内含子的Sox基因，其分布广泛，不论是在低等生物中还是高等生物中都存在。有研究表明：Sox9的HMG box可与DNA小沟上的特异序列结合，DNA链弯曲，解开双螺旋结构，激活靶基因的转录。研究证实Sox9蛋白在体内外均是一种有力的转录激活子，Sox9与Col2al(Ⅱ型胶原蛋白基因)内含子1上的特异位点结合，直接调控软骨细胞特异性标志Col2al的表达；另外，在软骨形成的初始阶段，未分化间充质干细胞向定向干细胞分化以及间充质细胞的聚集过程都需要Sox9的参与。目前在动物育种领域有关Sox9基因的多态性与动物生长性状之间关联的报道很少，同时，对于山羊育种而言，能够获得同时影响肉用、产奶品质的分子标记也是较为困难的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用，从而加快山羊良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊个体全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，利用PCR扩增包含山羊Sox9基因3’UTR区域插入/缺失多态性(InDel)位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定山羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型。

优选的，所述插入/缺失多态性位点选自山羊Sox9基因NC_030826.1:g.58090106_58090109位插入/缺失多态性位点。

优选的，所述PCR采用的引物对P1为：

上游引物：5’-GCGAATCAACAACCACCTTAGG-3’

下游引物：5’-TTCCTCACAAGCCACTGACTTC-3’。

优选的，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸15s，15个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型(ID)表现为162bp和166bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为162bp一条带纹。

一种山羊Sox9基因InDel标记的检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1。

上述山羊Sox9基因InDel标记的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型(ID)可以作为提高山羊(例如，陕北白绒山羊)胸围的DNA标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明针对山羊Sox9基因3’UTR区域4-bp的插入/缺失多态性位点，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定技术，在进行基因型和基因频率分析以及对所述插入/缺失多态性位点与山羊生长性状进行关联分析基础上，首次发现Sox9基因插入/缺失突变位点与山羊(例如，陕北白绒山羊)的重要选育性状(例如，胸围)显著相关，因此，可以通过简单、快速、低成本、精确地的检测与提高山羊生长性状相关的有效DNA标记，达到快速、精准建立优良山羊遗传资源种群的目的，从而加快山羊良种选育速度。

附图说明

图1为PCR扩增(引物对P1)山羊个体Sox9基因InDel位点的产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为山羊Sox9基因InDel位点PCR扩增产物测序图(基因型为ID的个体)；横线标出的部分表示3’UTR区4-bp缺失序列：NC_030826.1:g.58090106_58090109delTCGC。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR方法对山羊Sox9基因NC_030826.1:g.58090106_58090109位点的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊生长性状进行关联分析，发现其可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下溶液：①2mol/L NaCl：11.688gNaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，及40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计山羊Sox9基因InDel位点扩增引物

在NCBI上检索山羊Sox9基因的序列，并利用Primer 6.0设计能够扩增包含山羊Sox9基因第58090106-58090109位InDel位点的PCR引物对P1，其引物序列如下(2019年8月设计完成)：

所述的引物对P1为：

上游引物：5’-GCGAATCAACAACCACCTTAGG-3’(22bp)；

下游引物：5’-TTCCTCACAAGCCACTGACTTC-3’(22bp)。

利用上述引物对P1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊Sox9基因InDel位点(NC_030826.1:g.58090106_58090109位)的片段。理论上，当58090106与58090109位之间的TCGC缺失时(缺失/缺失基因型，DD)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是162bp大小的带纹；58090106与58090109位之间的TCGC存在时(插入/插入基因型，II)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是166bp大小的一条带纹。58090106与58090109位之间的TCGC在一个染色体上存在，在另一个染色体上出现缺失(插入/缺失基因型，ID)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是162bp和166bp两条带纹。

3.以引物对P1进行PCR扩增待测山羊Sox9基因片段

3.1山羊耳组织样品的采集

实验所用的动物为陕北白绒山羊，共计1109个个体的样本，于2018年7月采自陕西省榆林市子洲县绒山羊育种场。每个个体都具有完整的体尺数据记录。采用随机采样方式采取个体耳组织样品，采集的样品用70％乙醇保存于低温冰盒，带回实验室后置于-80℃冻存。

3.2组织样品基因组DNA的提取与分离

1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织DNA提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜。

3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3-5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3-5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。

2)称取1.2g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入0.5×TBE 40mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB。轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子。

5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2-5mm。

6)取DNA2-4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNA Marker加在一边。

7)80V电压电泳2h。

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的DNA。

3.4 DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6 PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

3.7 PCR扩增体系

PCR反应体系：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.5μL、下游引物0.5μL(上、下游引物浓度分别为10pmol/μL)；模板DNA(浓度为50ng/μL山羊基因组DNA)1.0μL；去离子水5.0μL；共13.5μL。

3.8 PCR反应的程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸15s，15个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸10min。

4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：

1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用EB核酸染料染色，点样4μL，后120V电压电泳1.0h；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析InDel多态性。

参见图1，山羊个体Sox9基因的InDel位点的琼脂糖凝胶电泳结果为：基因型ID表现为162bp+166bp两条带纹；基因型DD表现为162bp一条带纹。结果经测序验证，参见图2。根据分析结果，发现在陕北白绒山羊中，检测的InDel位点(NC_030826.1:g.58090106_58090109位)只存在两种基因型：ID和DD。

5.山羊Sox9基因InDel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率，计算的公式可以写成：

P_LL＝N_LL/N

式中，P_LL代表某一位点的LL基因型频率；N_LL表示群体中具有LL基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：

P_L＝(2N_LL+N_La1+N_La2+N_La3+N_La4+……+N_Lan)/2N

式中，P_L表示等位基因L频率，N_LL表示群体中具有LL基因型的个体数量，N_Lai表示群体中具有Lai基因型个体数量，ai＝a1，…，an为等位基因L的n个互不相同的复等位基因。

山羊个体Sox9基因InDel位点(NC_030826.1:g.58090106_58090109位)的基因型频率及等位基因频率如表1所示。

表1.山羊Sox9基因InDel位点基因频率分布表

6.山羊Sox9基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴别的基因型；

生长数据：陕北白绒山羊胸围、体高、体长等多个生长性状

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件来分析品种与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+e，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；e：随机误差。分析结果见表2。

表2.山羊Sox9基因InDel位点不同基因型与陕北白绒山羊胸围间的相关性分析

注：A和B表示差异极显著(P<0.01)

由表2可以看出，在对1109只陕北白绒山羊的关联分析中，Sox9基因的InDel位点(NC_030826.1:g.58090106_58090109位)多态性(参见其基因型频率分布)对育成羊胸围有极显著影响(P<0.01)，其中ID基因型个体的性状优于DD基因型的个体。结果表明：山羊Sox9基因InDel位点(NC_030826.1:g.58090106_58090109位)的ID基因型可以作为提高山羊胸围的有效遗传标记(InDel标记)。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcgaatcaac aaccacctta gg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttcctcacaa gccactgact tc 22

<210> 3

<211> 4

<212> DNA

<213> NC_030826.1: g.58090106_58090109位缺失序列

<400> 3

tcgc 4

Claims

1.检测山羊Sox9基因3’UTR区4-bp插入/缺失多态性位点的引物对在山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型可以作为提高山羊胸围的DNA标记；所述插入/缺失多态性位点的核苷酸序列为TCGC；

所述引物对为：

上游引物：5’- GCGAATCAACAACCACCTTAGG -3’

下游引物：5’-TTCCTCACAAGCCACTGACTTC -3’；

以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊Sox9基因3’UTR区域4-bp插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型表现为162 bp和166 bp两条带纹，缺失/缺失基因型表现为162 bp一条带纹；其中插入/缺失基因型个体的胸围性状优于缺失/缺失基因型的个体。