CN105779594B - 一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法及其应用。以待测公猪全基因组DNA为模板，以参照猪全基因组设计的引物对P1为引物，通过PCR技术扩增Oct4基因，再进行琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果鉴定Oct4基因在NC_010449:g.2759‑2760ins GGTTTTTGTCTA位点存在插入/缺失多态性。结果发现，Oct4基因12‑bp插入/缺失的不同类型与15日龄大白猪公猪睾丸重、睾丸长周长和睾丸短周长等繁殖性状之间存在显著相关，提示Oct4基因12‑bp插入/缺失的不同类型可作为提高公猪繁殖性状的DNA标记。本发明将有利于快速建立繁殖性状优良的公猪遗传资源群体。

Description

一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失(indel)的检测，特别涉及一种检测公猪Oct4基因12-bp插入/缺失(indel)的方法。

背景技术

动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态性为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态性与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。

在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和关键。作为分子遗传标记的重要方式之一，插入/缺失(indel)是一种新型分子标记。indel是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。随着对基因组研究的逐渐深入，基因组上的一种亚显微水平的结构变异即拷贝数变异(copy number variations,CNVS)被广泛报道，现已成为“基因组变异”到“表型变化”的另一研究热点。由于CNV涉及到更多的基因序列，甚至包含整个功能基因，因此能够通过基因剂量效应的改变，进而影响该基因控制的表型。在近年的科学研究杂志上，科学家们检测到了许多个与猪生长、肉质和繁殖相关的QTLs位于CNVs区域内，表明影响个体表型差异的CNVs广泛存在于基因组中。indel是指基因组中片段长度在1～50bp之间的插入或缺失，可能包括微小CNV，利用indel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。

在基因组中，CNV通常发生的区域含有大片段序列重复(homologous repeats)或SD序列(segmental duplications)。SD序列是指由于基因组重排产生的长度大于1kb串联重复的DNA片段，且序列之间具有90％以上的同源性(Redon et al 2006)。

CNV形成的变异机制主要有：非等位同源重组NAHR(non-allelic homologousrecombination)、非同源末端连接NHEJ(non-homologous end joining)、复制滑动(replication slippage)和反转录座(retro transposition)。

为探索从基因组CNVs到表型变化的作用机理，科研人员通过大量的假设和实验验证，认为CNVs影响表型的作用机制主要有以下几个方面：(1)小片段的重复、缺失/插入，改变单个基因或与其临近的几个基因，直接导致基因剂量的改变，使相关的蛋白质的表达量的减少或增加，进而引起表型的变化。(2)DNA片段的倒位，功能基因倒位至无活性异染色体区域，使基因不表达或表达量极少，从而导致表型的变化。(3)调控基因转录调控因子，间接影响基因表达量。

另外，有些CNVs具有一定的干扰效应，但涉及到的区域通长不会引起重要的功能基因改变。正常个体的一个基因发生拷贝数变异不一定会导致表型的相关改变，因为很多表型都是多基因控制的数量性状，该基因发生CNVs所产生的功能缺失会被其他功能类似的基因补偿，从而缓冲了这种不平衡作用。所以，在群体遗传研究中，微小CNV(插入/缺失)作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，indel在育种的研究中具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。

插入/缺失(indel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，indel多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA。indel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失(indel)；(2)单一碱基的插入/缺失(indel)；(3)重复单元为2～15碱基的多碱基对插入/缺失(indel)；(4)转座子插入/缺失(indel)；(5)任意DNA序列的插入/缺失(indel)多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点，与SNP相比均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10^-8，相对比较稳定。在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记，indel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于SNP，位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。分子生物学家最早将其用于基因表型相关的研究。2005年，Bhangale等报道了一种能够从目的基因中全面识别indel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中找到2393个indel变异位点，得出人类基因组中插入/缺失(indel)态出现的频率高于插入多态性的结论，同时提出indel和SNP的形成机制可能不同，但其进化史是相似的。然而相关的后续报道并不是很多，甚至在近几年有递减的趋势。

随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对畜产品的需求不断加强，但由于近年来猪肉价格一路飙升，所以猪育种专家期望更早、更好、更快地获得猪产品的优良品种。在高产、优质和高效的种公猪育种目标上，猪育种专家一直关注繁殖性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与猪繁殖性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与繁殖性状的关联分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。

Oct4基因是POU转录因子家族中的一员，在胚胎干细胞(embryonic stem,ES)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells,EC)以及胚胎生殖细胞(mbryonic germ cells,EG)等多能性细胞中特异性表达，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。哺乳动物在胚胎发育过程中受着多种基因的严密调控，以保证其有序地进行组织分化和个体发育。Oct4基因是影响动物繁殖性状的一个关键基因，也被称为Oct3、POU5F1、OTF3或OTF4。Nordhoff等(2001)的研究发现，多个物种的Oct4基因启动子序列有66％-94％的相似性，包括CR1、CR2、CR3和CR4这4个保守区。其中CR1相当于Oct4的基本启动子；CR2位于近端增强子区，参与原肠期外胚层Oct4的表达；CR3和CR4位于远端增强子区域，CR3主要增强Oct4在卵裂球至原肠期多能性细胞的表达，CR4则调控原始生殖细胞(PGCs)和卵子中Oct4的表达。生殖细胞是动物体内的一类特殊细胞，可以产生个体中各个谱系的干细胞。胚胎原始生殖细胞(PGCs)在形态上和发育上类似于胚胎干细胞，还可作为ES细胞的一个替代来源。Oct4是胚胎干细胞多能性的维持因子和生殖系细胞分化的调控因子，其表达对于哺乳动物生殖细胞的形成和维持是必需的，Oct4的缺失会引起原始生殖细胞的凋亡。

目前，对Oct4基因的研究主要集中在胚胎干细胞(embryonic stem,ES)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells,EC)以及胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG)等多能性细胞中特异性表达的研究上。对关于猪Oct4基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究更是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法及其应用，从而加快公猪良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法，包括以下步骤：以待测公猪全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增猪Oct4基因片段，该片段包含猪Oct4基因12-bp插入/缺失多态性位点；对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果确定待测公猪在所述12-bp插入/缺失多态性位点的多态性；所述引物对P1为：

上游引物：5’-CTTCCACTTGGCTACTTCTTT-3’；

下游引物：5’-GCTGTGGCATAGGTTTGAT-3’。

所述PCR的扩增反应程序为：

1)95.0℃预变性3min，然后进入步骤2)；

2)95.0℃变性30s，60℃复性60s，72.0℃延伸40s，共35个循环；

3)经过步骤2)后，72.0℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

所述12-bp插入/缺失多态性位点的多态性为：插入/插入基因型表现为一条344bp带纹，缺失/缺失基因型表现一条332bp带纹，插入/缺失基因型表现为344bp和332bp两条带纹。

一种猪Oct4基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增猪Oct4基因中12-bp插入/缺失多态性位点的引物对P1，所述引物对P1为：

上游引物：5’-CTTCCACTTGGCTACTTCTTT-3’；

下游引物：5’-GCTGTGGCATAGGTTTGAT-3’。

上述猪Oct4基因插入/缺失的检测方法在公猪分子标记辅助选择育种中的应用。

所述12-bp插入/缺失多态性位点可作为大白猪公猪睾丸繁殖性状的DNA标记。

所述公猪睾丸繁殖性状为睾丸重、睾丸长周长或睾丸短周长指数。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据猪Oct4基因的序列设计引物，以待测公猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后获得公猪的Oct4基因的(NC_010449:g.2759-2760ins GGTTTTTGTCTA)插入/缺失多态性。

本发明对2个公猪品种的插入/缺失多态性位点基因型进行了检测和基因频率分析，对上述插入/缺失多态性位点与公猪睾丸部分繁殖性状(如睾丸重、睾丸长周长、睾丸短周长)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高大白猪公猪睾丸重(P＝0.013)、睾丸长周长(P＝0.005)和睾丸短周长(P＝0.003)的分子标记。

本发明提供的针对该插入/缺失多态性位点的检测方法，通过设计的引物经PCR扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其插入/缺失的多态性，从而为公猪良种选育提供依据，有利于快速建立繁殖性状优良的公猪遗传资源群体，加快良种选育速度。

附图说明

图1为公猪Oct4基因扩增在NC_010449:g.2759-2760 ins GGTTTTTGTCTA位点的12-bp插入/缺失(indel)多态性位点的PCR产物电泳结果，M表示Marker I。

图2为公猪Oct4基因扩增在NC_010449:g.2759-2760 ins GGTTTTTGTCTA位点的12-bp插入/缺失(indel)多态性位点的测序图，其中，A表示基因型为插入/插入(II)，B表示基因型为缺失/缺失(DD)，带框的字母

表示该位点发生突变。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用PCR扩增方法对公猪Oct4基因在NC_010449:g.2759-2760 insGGTTTTTGTCTA位点突变可能产生的插入/缺失(indel)多态性进行检测，并将其与繁殖性状进行关联分析，验证其是否可以作为公猪分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

(一)实验药品与试剂

1.生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。具体的溶液与缓冲液如下：(1)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/LNaCl 5mL，定容至100mL。(2)琼脂糖电泳分析所用溶液:①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)公猪Oct4基因在NC_010449:g.2759-2760insGGTTTTTGTCTA位PCR引物的设计

在NCBI上检索公猪Oct4基因的序列，并利用Primer Premier 5.0设计能够扩增包含公猪Oct4基因第1内含子区域12-bp indel位点的PCR引物对P1，其引物序列如下：

上游引物：5’-CTTCCACTTGGCTACTTCTTT-3’(SEQ.ID.NO.1)；

下游引物：5’-GCTGTGGCATAGGTTTGAT-3’(SEQ.ID.NO.2)；

参见图1以及图2，上述引物对P1对公猪基因组扩增，能够扩增包含公猪Oct4基因在NC_010449：g.2759-2760ins GGTTTTTGTCTA位点的indel的不同的基因型片段。理论上，当2759nt与2760nt之间的GGTTTTTGTCTA缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是332bp大小的带纹；2759nt与2760nt之间的GGTTTTTGTCTA插入时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是344bp大小的一条带纹。2759nt与2760nt之间的GGTTTTTGTCTA插入/缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是332bp+344bp两条带纹。为此，根据理论分析结果，插入/插入基因型(II)表现为344bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为332bp+344bp两条带纹，缺失/缺失(DD)基因型表现为332bp一条带纹。

(三)以引物对P1进行PCR扩增待测公猪的Oct4基因片段

1、公猪组织样本的采集

实验所用的动物为2个公猪品种共计442个样本，其中：(1)长白猪公猪样品72份，采自陕西省安康市国家生猪养殖场。采用随机采样方式采取个体睾丸组织样品，这些样品放在70％乙醇中保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。其中，所采长白猪个体均为四十日龄。(2)大白猪公猪样品共370份，采自陕西省安康市国家生猪养殖场。采用随机采样方式采取个体睾丸组织样品，这些样品为放在70％乙醇中保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。其中，所采大白猪个体，含15日龄大白猪196头，四十日龄大白猪174头。

表1 公猪样本的采集

2、组织样品DNA的提取与分离

①取约10mg公猪睾丸组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎；②加入600μL组织DNA提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中；③将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；④取上清液，加入等体积的酚：氯仿(1：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；⑤取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；⑥取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA；⑦挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；⑧再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；⑨待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

①将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子；②称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE 30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB。然后快速将琼脂糖溶液倒入，轻微摇动，防止出现气泡；③混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出；④完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中；⑤向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm；⑥取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNA Marker加在一边；⑦80V电压电泳2h；⑧在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。

4、DNA的纯化

①500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL；②55℃保温10h左右；③等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次；④12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；⑤加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；⑥倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

5、分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

6、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)10.0μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL山羊基因组DNA)1.0μL；去离子水8.0μL；共20.0μL体积的PCR扩增体系。

7、PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：95.0℃，预变性3min；95.0℃，变性30s，60℃复性60s，72.0℃延伸40s，35个循环；之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存扩增产物。

(四)扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

①制作3.5％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳1.5～2h，电泳结束后EB染色；②待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；③根据琼脂糖凝胶电泳成像分析indel多态性。

利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断插入/缺失(indel)的多态性：

猪基因组的Oct4基因在NC_010449:g.2759-2760ins GGTTTTTGTCTA位点的插入/缺失(indel)的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：插入/缺失基因型(ID)表现为332bp和344bp两条条带，插入/插入基因型(II)表现为344bp一条条带，缺失/缺失基因型(DD)表现为344bp一条条带。

(五)公猪Oct4基因indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+……+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1～an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

在不同公猪品种Oct4基因12-bp插入/缺失(indel)位点中的等位基因型频率及等位基因频率如表2所示。长白猪、大白猪的等位基因“I”的频率分别为0.648和0.352，相应的等位基因“D”的频率为0.587和0.413，等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，故为稳定存在插入/缺失(indel)类型。

表2 公猪Oct4基因12bp indel基因频率分布表

(六)公猪Oct4基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型

生产数据：40日龄长白猪、15日龄和40日龄大白猪公猪的睾丸重、睾丸长周长、睾丸短周长繁殖性状数据。

关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；E：随机误差。

结果表明：公猪Oct4基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对猪某些繁殖性状(如睾丸重、睾丸长周长、睾丸短周长)的影响均有显著差异。

由表3可以看出，在对196头15日龄大白猪公猪群体的研究中，Oct4基因的12-bp插入/缺失(indel)多态性对15日龄大白猪公猪的睾丸重(P＝0.013)具有显著影响(P<0.05)，对15日龄大白猪公猪的睾丸短周长(P＝0.003和睾丸长周长(P＝0.005)均具有极显著影响(P<0.01)。

因此，Oct4基因12-bp插入/缺失(indel)是大白猪公猪繁殖性状的插入/缺失(indel)遗传标记。

表3 Oct4基因indel多态性对大白猪公猪繁殖性状的影响

注：生产性状不同的上标(a,b/A,B)，表示有显著性不同(P<0.01/P<0.05)。

Claims (6)

1.一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测大白猪公猪全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增猪Oct4基因片段，该片段包含猪Oct4基因12-bp插入/缺失多态性位点，所述12-bp插入/缺失多态性位点为大白猪公猪睾丸繁殖性状的DNA标记；对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果确定待测公猪在所述12-bp插入/缺失多态性位点的多态性；所述12-bp插入/缺失多态性位点的多态性为：插入/插入基因型表现为一条344bp带纹，缺失/缺失基因型表现一条332bp带纹，插入/缺失基因型表现为344bp和332bp两条带纹；

所述引物对P1为：

上游引物：5’-CTTCCACTTGGCTACTTCTTT-3’；

下游引物：5’-GCTGTGGCATAGGTTTGAT-3’。

2.根据权利要求1所述一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增反应程序为：

1)95.0℃预变性3min，然后进入步骤2)；

2)95.0℃变性30s，60℃复性60s，72.0℃延伸40s，共35个循环；

3)经过步骤2)后，72.0℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述一种猪Oct4基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

4.一种猪Oct4基因插入/缺失的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增猪Oct4基因中12-bp插入/缺失多态性位点的引物对P1，所述12-bp插入/缺失多态性位点为大白猪公猪睾丸繁殖性状的DNA标记，所述引物对P1为：

上游引物：5’-CTTCCACTTGGCTACTTCTTT-3’；

下游引物：5’-GCTGTGGCATAGGTTTGAT-3’；

所述12-bp插入/缺失多态性位点的多态性为：插入/插入基因型表现为一条344bp带纹，缺失/缺失基因型表现一条332bp带纹，插入/缺失基因型表现为344bp和332bp两条带纹。

5.一种如权利要求1所述猪Oct4基因插入/缺失的检测方法在公猪分子标记辅助选择育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述公猪睾丸繁殖性状为睾丸重、睾丸长周长或睾丸短周长指数。

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