CN108410997B - 一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种公猪StAR基因5‑bp重复缺失多态性的检测方法及其应用。该方法以待测公猪全基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增StAR基因片段，随后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定StAR基因在NC_010457.5:g.5524‑5528位点存在5‑bp重复缺失多态性。StAR基因5‑bp重复缺失多态性不同基因型分别与15日龄和40日龄大白猪公猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重等繁殖性状之间显著相关。本发明提供的检测公猪StAR基因插入/缺失的方法，可在公猪繁殖性状的标记辅助选择育种中应用，有利于快速建立繁殖性能优良的公猪遗传资源群体。

Description

一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失(indel)的检测，特别涉及一种快速、准确检测公猪StAR基因NC_010457.5:g.5524-5528位点5-bp重复缺失多态性的方法及其应用。

背景技术

随着人类生活水平的提高，对家畜尤其是猪(Sus scrofa)的消费需求越来越高，生猪养殖产业得以飞速发展。中国是猪肉消费大国，猪肉占肉类消费总量的60％以上。据相关数据统计，在中国，每一年人均猪肉消费量约59公斤，意味着中国消费者的猪肉消费量占全球一半以上。因此，培育出具有优良性状的种质资源是供给充足猪肉的保障。

随着生物技术的发展，使用分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术提高猪的经济性能成为了当前育种的研究热点。通过研究猪基因组遗传信息，寻找与繁殖性能、耐受力、肉品质、饲料转化率等性状相关基因的多态性，并将这些基因多态信息应用在猪分子育种领域，有利于培育和改良出更多具有优良经济性能的品种。

MAS技术是随着遗传学的发展而诞生的，利用DNA水平的选择来代替传统育种以表型为基础的选择，进行目标基因以及全基因组筛选，获得期望的个体。目前被广泛应用的DNA分子标记主要有限制性内切酶片段长度多态性、随机扩增多态性DNA标记、简单重复序列标记、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)、及插入-缺失(insertion-deletion，Indel)等。

Indel是指在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者缺失，其长度通常在50bp以下。Indel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记。Indel通过改变DNA序列影响相关因子与DNA的结合，或影响DNA转录后的mRNA序列，又或影响mRNA剪接位点等方式影响基因正常表达。在已知的Indel序列中，只有一小部分长度位于基因编码区域，这些序列大多会直接影响基因转录和翻译；有些位于启动子区的Indel则可以改变DNA序列的相位与间隔，影响相关因子的结合；而出现在转录因子结合区域或者增强子区域的Indel，可能会抑制甚至终止基因表达。

2008年，南京大学田大成教授课题组在《自然》杂志上发表的《真核生物中插入/缺失增加其周围序列的突变率》中提出了“Indel诱变假说”。他们通过生物信息学技术对人、黑猩猩、恒河猴、小鼠、果蝇、水稻和酿酒酵母等不同类别生物的基因组序列进行了比对分析，发现Indel两侧的碱基点突变出现的频率较其他区域要高的多，即Indel会引起其周围基因一系列的变异。该研究表明Indel是诱导生物遗传变异的源头，在生物进化中扮演重要角色。

与分型系统复杂的SNP标记相比，Indel检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行；与SSR标记相比，Indel标记的扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果均明显优于SSR标记。Indel作为新一代的分子标记，因其具有较好的稳定性、多态性丰富及成本低、技术简单等优点，被广泛应用于畜禽遗传育种的多态性分析。

类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)基因又称StARD1，是StAR相关脂质转运结构域蛋白家族(StAR-related lipidtransfer domain proteins)成员之一。猪StAR基因位于15号染色体上，基因全长7802bp，编码的蛋白含285个氨基酸残基，其中发挥生物学活性的StAR相关脂质转运结构域位于第70到第277位氨基酸残基。该基因编码的蛋白主要位于类固醇激素合成细胞的线粒体外膜，能将胆固醇从线粒体膜外向膜内运输，从而进行后续的合成反应。类固醇激素包括雄激素、雌激素和肾上腺皮质激素等，StAR作为重要的调节因素调控这些激素的合成。

睾酮(testosterone,T)是最主要的雄激素，主要由睾丸间质细胞(Leydig cells,LCs)生成，具有促进性别分化、生殖器官发育及调控精子发生等功能。在T合成过程中，垂体释放促黄体素，激活StAR，从而促进胆固醇转运进一步生成睾酮。Wang等通过抑制小鼠LCs表达StAR，结果发现T合成量大大减少(Wang et al.,2017)。此外，Caron等发现，敲除小鼠StAR基因后，其类固醇激素合成受损且外生殖器性别不明(Caron et al.,1997)。因此，StAR可能通过参与T合成影响雄性生殖。

目前，StAR基因的研究主要集中在人类相关疾病上，而对StAR基因遗传变异与公猪繁殖性状之间的关联研究十分匮乏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用，即利用PCR扩增方法检测公猪StAR基因的插入/缺失多态性，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测公猪全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增公猪StAR基因部分片段(具体位于基因的内含子区)；再对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳的结果鉴定公猪StAR基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；

所述引物对P1包括用于PCR扩增公猪StAR基因上5-bp重复缺失多态位点的上、下游引物：

上游引物：5’-GCAAAGGACACTCCCCTGAC-3’；

下游引物：5’-TCTTTGAGGGACTTCCAGCC-3’。

所述公猪StAR基因上的插入/缺失多态性是指NC_010457.5:g.5524-5528位点上5-bp重复缺失多态性。

所述PCR扩增的反应程序为：95.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，68℃退火30s，72.0℃延伸25s，2个循环；之后每2个循环降退火温度2～3℃；94.0℃变性30s，51℃退火30s，72.0℃延伸25s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，4℃保存扩增产物。

所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2～3％。

所述公猪StAR基因上的插入/缺失(Indel)多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：插入/插入基因型(II)表现为184bp一条带纹；缺失/缺失基因型(DD)表现179bp一条带纹；插入/缺失基因型(ID)表现为184bp和179bp两条带纹。

一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测试剂盒，包括上述引物对P1。

公猪StAR基因NC_010457.5:g.5524-5528位存在5-bp重复缺失多态性位点在公猪分子标记辅助选择育种中的应用。

所述的重复缺失(插入/缺失)多态性位点的缺失/缺失基因型(DD)可作为提高公猪睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重的分子标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明根据公猪StAR基因NC_010457.5:g.5524-5528位存在5-bp插入/缺失多态性设计引物，以公猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测公猪StAR基因第5524-5528位的重复缺失多态性。

本发明根据对公猪StAR基因第5524-5528位重复缺失多态性位点进行基因型和基因频率分析，及对上述重复缺失多态性位点与公猪相关繁殖性状(睾丸重、睾丸长轴长和睾丸短轴长)进行关联分析，结果表明该位点能够作为公猪睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重(P<0.05或P<0.01)的分子标记，选择具有缺失/缺失基因型(DD)的个体，有利于快速建立遗传资源优良的公猪种群，从而加快具有优良繁殖性状的公猪的良种选育速度。

附图说明

图1为引物对P1扩增公猪StAR基因产物用3％琼脂糖凝胶电泳的结果；M表示Marker。

图2为公猪StAR基因PCR扩增产物测序图；(A)II基因型，(B)DD基因型，实线方框标出的部分表示5-bp重复缺失序列：NC_010457.5:g.5524-5528del ACTTG；虚线方框标出的部分表示5-bp重复缺失序列的重复序列。

图3为公猪StAR基因5-bp Indel序列分析图；图中：实线方框中的序列分别为上、下游引物位置，灰色阴影部分的序列为5-bp重复缺失序列，虚线方框部分的序列为5-bp重复缺失的重复序列，中杠为缺失序列ACTTG；参考序列为NCBI网站上公布的猪StAR基因序列NC_010457.5。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用PCR扩增方法对公猪StAR基因在NC_010457.5:g.5524-5528位点突变可能产生的重复缺失多态性进行检测，并将其与公猪相关繁殖性状(睾丸重、睾丸长轴长和睾丸短轴长等等)进行关联分析，验证其是否可以作为公猪分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①2×Taq PCR Mastermix(含染料)(购自杭州宝赛生物科技有限公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。具体的溶液与缓冲液如下：

1)采集睾丸样品所用溶液(PBS缓冲液)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，及KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000mL，调整pH至7.4，高压灭菌，4℃保存。

2)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还需配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g NaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，及2mol/L NaCl5mL，定容至100mL。

3)琼脂糖电泳分析所用溶液:①0.5×TAE缓冲液：取10×TAE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，及40.0％(w/v)蔗糖的水溶液。

2.设计公猪StAR基因Indel引物

在NCBI上检索猪StAR基因的序列(猪StAR基因参考序列NC_010457.5)，并利用Primer-BLAST(NCBI)设计能够扩增包含公猪StAR基因第5524-5528位点的PCR引物对P1，其引物序列如下，参见图3(设计完成时间：2016年10月)：

上游引物：5’-GCAAAGGACACTCCCCTGAC-3’(20nt)；

下游引物：5’-TCTTTGAGGGACTTCCAGCC-3’(20nt)。

用上述引物对P1对公猪基因组进行PCR扩增，能够扩增包含公猪StAR基因(NC_010457.5:g.5524-5528序列)的片段。理论上，当5524nt与5528nt之间的序列缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条179bp大小的带纹；5524nt与5528nt之间的ACTTG存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条184bp大小的带纹。5524nt与5528nt之间的ACTTG同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现184bp和179bp两条带纹。如图1扩增后电泳结果所示，左起第1～3泳道为检测样本，第4泳道为Marker(由大到小依次是500bp，400bp，300bp，200bp，150bp和100bp)。根据理论分析结果，II基因型表现为一条184bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第1泳道，测序峰图为图2A所示；DD基因型表现为一条179bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第2泳道，测序峰图为图2B所示。ID基因型表现为184bp和179bp两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第3泳道。

3.引物对P1扩增公猪StAR基因片段

3.1公猪睾丸组织样本的采集

实验所用的组织样本最后完成采集时间截止到2015年4月。实验所用的动物为大白猪，共计263个样本。其中15日龄大白猪样品178份，40日龄大白猪样品85份，均采自陕西省安康市国家生猪养殖场。采用随机采样方式采取个体睾丸组织样品，样品放在70％乙醇中保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

3.2组织样品DNA的分离、提取

1)从-80℃冰箱中取出冻存的睾丸样本。剪取约10mg睾丸组织，放到2.0mL离心管中，用小剪刀尽量剪碎；

2)加入600μL组织DNA提取液，浓度为20mg/mL的蛋白酶K 20μL，口底颠倒混匀，37.0℃水浴消化过夜，最好保证组织较均匀地分布在组织提取液中；

3)第二天将2.0mL离心管从水浴锅中取出，待溶液冷却至室温，加入2mol/L的NaCl200μL充分混匀，随后加入1mL Tris饱和酚，盖紧管盖，放在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，随后4℃12000r/min离心10min；

4)取大约600μL上清液至一个新的2.0mL离心管中，随后加入Tris饱和酚和氯仿各0.5mL，盖紧管盖，在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，4℃12000r/min离心10min；

5)取上清液500μL左右加入到一个新的2.0mL离心管中，加入1mL氯仿，盖紧管盖，在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，随后4℃12000r/min离心10min；

6)取大约300μL上清液至一个新的1.5mL离心管中，加入1mL预冷的无水乙醇，盖紧管盖，缓慢地口底颠倒离心管数分钟，随后-20℃放置半小时，出现白色絮状DNA沉淀；

7)4℃12000r/min离心10min，弃掉上清。加入1mL 70％乙醇，盖紧管盖，在冰上缓慢地来回颠倒离心管10min，4℃12000r/min离心10min，小心倒掉乙醇；

8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地口底颠倒离心管，然后4℃12000r/min离心3-5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；

9)待干燥后，加入30～50μL灭菌超纯水溶解。从溶解后的原液中吸取1μL至PCR管中，用灭菌水稀释十倍，随后用核酸定量仪检测OD₂₆₀和OD₂₈₀比值，检测提取DNA的浓度和纯度。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将电泳槽洗干净，将干净的制胶底板放入胶盒中，插上梳子；

2)制作2％浓度的琼脂糖凝胶。称取0.80g琼脂糖，倒入三角瓶中，加入0.5×TAE40mL使其悬浮，微波炉中加热。待煮沸至溶液透明，没有半透明的颗粒存在时拿出，待其冷却至不烫手时(约60℃)加入终浓度为0.5μg/mL的EB，轻微摇动；

3)混匀后立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，用移液器枪头移出；

4)约20～30min后凝胶完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中；

5)向电泳槽中加入0.5×TAE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm；

6)取DNA样品6μL，统一上样，并将DNA Marker加在一边；

7)120V电压，电泳35min；

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的DNA。

3.4DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL，55℃保温10h左右；

2)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；

3)2000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

4)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

5)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-40℃。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR Mastermix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、优化的反应缓冲液和染料，浓度为2×)7.5μL；上游引物0.3μL；下游引物0.3μL(上、下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL)0.5μL；去离子水6.4μL；共15μL体积的PCR扩增体系。

3.7PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：95.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，68℃退火30s，72.0℃延伸25s，2个循环；之后每2个循环降退火温度2～3℃；94.0℃变性30s，51℃退火30s，72.0℃延伸25s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，4℃保存扩增产物。

4.扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：

1)制作3％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压，电泳60～80min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析Indel多态性。

利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断Indel的多态性：

参见图1，公猪基因组StAR基因的5-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：ID基因型表现为184bp和179bp两条带纹，II基因型表现为184bp一条带纹，DD基因型表现为179bp一条带纹。

5.公猪StAR基因Indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_nn＝N_nn/N，其中P_nn代表某一位点的nn基因型频率；N_nn表示群体中具有nn基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_n＝(2N_nn+N_na1+N_na2+N_na3+N_na4+……+N_nam)/2N

式中，P_n表示等位基因n频率，N_nn表示群体中具有nn基因型的个体数量，N_nai表示群体中具有nai基因型个体数量，a1-am为等位基因n的m个互不相同的复等位基因。

公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1所示。大白猪的等位基因“I”的频率为0.462，相应的等位基因“D”的频率为0.538，等位基因“I”和“D”的频率大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

表1.大白猪StAR基因5-bp重复缺失基因频率及基因型频率分布表

6.公猪StAR基因Indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后根据琼脂糖凝胶电泳判断的基因型。

繁殖数据：15日龄和40日龄大白猪的睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重等繁殖性状数据。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件来分析品种、不同因素与繁殖性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响睾丸长轴长、睾丸段轴长及睾丸重等指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；E：随机误差。

结果表明：公猪StAR基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对公猪相关繁殖性状(睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重)均有显著影响，对于其他繁殖性状未发现显著影响。

由表2可以看出，在对15日龄和40日龄大白猪的繁殖性状研究中，StAR基因5-bp重复缺失多态性对15日龄大白猪的睾丸长轴长(P＝0.028)有显著影响(P<0.05)，而对40日龄的大白猪的睾丸长轴长(P＝1.049E-04)、睾丸短轴长(P＝0.005)及其睾丸重(P＝1.783E-05)有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，DD基因型个体性状显著优于II基因型个体。

结论：DD基因型可以作为公猪繁殖性状(睾丸长轴长、睾丸短轴长和睾丸重)的遗传标记。

表2.StAR基因5-bp重复缺失位点与大白猪公猪繁殖性状关联分析

注：平均数±标准差右上角的不同字母(a，b或A,B)代表差异的显著性(P<0.05或P<0.01)

总之，本发明建立了一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法，为公猪繁殖性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践支撑。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gcaaaggaca ctcccctgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

tctttgaggg acttccagcc 20

Claims (2)

1.一种公猪StAR基因5-bp重复缺失多态性的检测方法在公猪分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：以公猪全基因组DNA为模板，引物对P1为引物，通过PCR扩增公猪StAR基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定公猪StAR基因的插入/缺失多态性位点NC_010457.5:g.48383120-48383124del的基因型；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’ - GCAAAGGACACTCCCCTGAC -3’；

下游引物：5’ - TCTTTGAGGGACTTCCAGCC -3’；

所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失基因型作为公猪繁殖性状的分子标记。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述公猪选自大白猪。

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