CN107513579B - 一种快速检测黄牛crabp2基因单核苷酸多态性的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法及其专用试剂盒。以黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，PCR扩增黄牛CRABP2基因；PCR产物分别经限制性内切酶Apa I和Sal I消化后，进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛CRABP2基因第2458位和3878位的单核苷酸多态性。本发明所述的方法能够检测黄牛CRABP2基因的单核苷酸多态性，在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切的相关分子遗传标记，从而用于牛的辅助选择和分子育种，加快本地黄牛良种繁育速度。

Description

一种快速检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法及其专 用试剂盒

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及黄牛基因单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记的筛选与检测，特别涉及一种检测黄牛CRAABP2基因单核苷酸多态性的方法及应用。

背景技术

随着现代分子生物学和分子克隆技术的发展，使得遗传标记从形态学标记、细胞标记、生化标记发展到DNA分子标记。DNA分子标记能够直接反映DNA分子水平上的差异，再加之其多态性高、数量多，且标记表现为显性或共显性，因而其理论与应用价值不可估量。DNA分子标记辅助选择育种就是其应用的一个重要方面，因其不仅准确、高效，而且不受性别、年龄等因素的限制，被大量研究并运用到实践生产中。

在众多的分子标记中，SNP(single nucleotide polymorphism)标记是当前遗传标记研究中最多，也是最有前景的分子标记，SNP主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。一般而言，上述形式中最少1种等位基因在群体中的频率不小于1％，但在某种特殊情况下(如cDNA中)也可以小于1％。1个SNP在基因组某个位点上有单个核苷酸的变化，主要由两种形式出现：一种是单个碱基的转换所引起，即以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤；另外一种形式就是颠换，即嘌呤与嘧啶互换。因SNP具有基因组覆盖范围大、密度高、分辨率高、遗传稳定和易实现分析自动化等优越特点。因此被广泛地应用于生物学、植物学、医学、动物育种、生物进化等众多研究领域。

目前SNP的检测方法大致可以分为两大类：一大类是以单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法。另一大类是以直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。而PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)法，即利用限制性内切酶对目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳分析，进而鉴别SNP位点的基因型，是一种准确而又操作简便的方法，也是目前通用的方法。

细胞维甲酸绑定蛋白2(cellular retinoic acid-binding protein 2，CRABP2)属细胞脂质绑定蛋白家族，CRABP2蛋白具有136个氨基酸，分子量为15～16kDa，能将维甲酸RA从细胞浆转运入细胞核，具有高度的特异性和亲和力。维甲酸(RA)参与了多种生物学过程，如细胞增殖、分化、胚胎发生及凋亡等，RA与其受体RAR、RXR结合后通过类视黄醇信号通路调控了下游许多基因的转录。而CRABP2转运RA进入细胞核使其与RAR:RXR异二聚体结合，引起随后RA诱导的基因转录，目前发现在多种不同的癌症中均存在有CRABP2的异常调控，而对于家畜CRABP2基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法及其专用试剂盒，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，以黄牛的全血(基因组)DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，分别PCR扩增CRABP2基因的两个包含突变位点的区域，扩增产物经限制性内切酶Apa I(P1扩增产物)和Sal I(P2扩增产物)消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛CRABP2基因的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1序列为：

上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’ 21nt

下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’ 19nt

所述的引物对P2序列为：

上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’ 22nt

下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’ 21nt。

所述的CRABP2基因的单核苷酸突变位点分别是位于牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1的第2458位(位于引物对P1扩增的区域内)的G或T的单核苷酸多态性和第3878位(位于引物对P2扩增的区域内)的G或A的单核苷酸多态性位点。

所述的PCR所用的扩增体系为：10ng/μL模板DNA 1μL、10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×Taq PCR StarMix 5μL和ddH₂O 3μL。

所述的PCR的反应程序分别为：

以引物对P1进行扩增的程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；

以引物对P2进行扩增的程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min。

所述的限制性内切酶Apa I的10μL酶切体系为：PCR产物5μL、10×NEBuffer 1.5μL、Apa I(50U/μL)0.3μL，及ddH₂O 3.2μL，酶切消化条件：25℃恒温培养箱中消化12～16h；所述的限制性内切酶Sal I的10μL酶切体系为：PCR产物5μL、10×NEBuffer 1.5μL、Sal I(20U/μL)0.3μL，及ddH₂O 3.2μL，酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化12～16h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

根据琼脂糖凝胶电泳结果判定黄牛CRABP2基因第2458位(参照牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1)碱基多态性为：GG基因型表现为284bp和88bp的两条条带；GT基因型表现为284bp、88bp和372bp的三条条带；TT基因型表现为372bp的一条条带；第3878位的碱基多态性为：GG基因型表现为269bp和705bp的两条条带；GA基因型表现为269bp、705bp和974bp的三条条带；AA基因型表现为974bp的一条条带。

一种检测黄牛GRABP2基因单核苷酸多态性的试剂盒，包括基于上述检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法进行基因分型的PCR扩增引物对P1和P2，以及限制性内切酶Apa I和Sal I。

本发明的有益效果体现在：

针对上述两个位点的突变，本发明公开了其检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶进行酶切鉴定。该方法解决了传统的PCR-SSCP方法对DNA序列变异不能精确定位的、对实验条件要求严格的不足，同时将PCR与RFLP相结合，避免了RFLP检测周期长、成本额高昂、不适于大规模分子育种等缺陷，能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。

本发明对上述两个突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将其与三个黄牛品种的重要生长性状进行关联分析。结果表明该位点的特定基因型可作为提高黄牛(特别是秦川牛)生长性状的分子标记。

附图说明

图1-1为黄牛CRABP2基因第2458位的测序图；框内为该位点发生的突变。

图1-2为黄牛CRABP2基因第3878位的测序图；框内为该位点发生的突变。

图2-1为黄牛CRABP2基因第2458位PCR扩增的片段的电泳图；泳道M1为Marker。

图2-2为黄牛CRABP2基因第3878位PCR扩增的片段的电泳图；泳道M2为Marker。

图3-1为黄牛CRABP2基因第2458位PCR产物经Apa I酶切后电泳结果；泳道M1为Marker。

图3-2为黄牛CRABP2基因第3878位PCR产物经Sal I酶切后电泳结果；泳道M2为Marker。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛CRABP2基因第2458位和3878位的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实验室的黄牛基因组重测序、转录组测序和DNA甲基化组测序的结果表明，黄牛CRABP2基因中存在多态性，而且在秦川牛胎儿和成年牛肌肉组织中的mRNA和DNA甲基化水平存在差异。因此，推测该基因对黄牛的生长发育具有调控作用，对黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的研究至关重要，并且将该基因的多态性与黄牛生长性状关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，可为黄牛分子育种提供理论依据。

一、黄牛CRABP2基因部分序列的克隆及其多态性检测

1.样本采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集

本发明以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，共计202个个体，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示：

表1.实验动物情况

(2)血样DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000rpm离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④取出样品加入200μL的6mol/L NaCl，口底摇动15次使其充分混匀，在4℃下12000rpm离心10min，取上清液至2.0mL离心管中。

⑤加Tris-饱和酚1mL，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀；4℃，12000rpm离心10min，将上层水相用移液器转入另一灭菌2.0mL离心管中。

⑥加入0.5mL的Tris-饱和酚和0.5mL的氯仿，在冰上温和摇动20min；4℃，12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌2.0mL离心管中。

⑦加入1mL的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃，12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌1.5mL离心管中。

⑧加入1mL预冷无水乙醇(-20℃)，轻扣底部摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；取出后，4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇。

⑨加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；然后4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇，重复漂洗一次。

⑩室温下敞口放置15min，之后放入60℃烘箱30s使乙醇挥发干净；加入超纯水50μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

2.DNA池的构建

用紫外光分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值以及其DNA含量。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至10ng/μL，然后从3个黄牛群体中随机选择50个稀释后的样品，每个样品取5μL混合均匀构建DNA池。

二、扩增引物设计

以NCBI所公布的牛CRABP2基因序列(AC_000160.1)为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含黄牛CRABP2基因第一内含子的PCR引物，其引物序列如下：

引物对P1序列为：

上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’ 21nt

下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’ 19nt

引物对P2序列为：

上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’ 22nt

下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’ 21nt

三、PCR扩增

PCR反应体系如表2所示。

表2.PCR反应体系

PCR反应程序如表3、4所示。

表3.PCR反应程序(引物对P1)

表4.PCR反应程序(引物对P2)

四、PCR产物测序

将用以上混合的DNA池为模板扩增的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。对黄牛CRABP2基因目的片段测序结果与参考序列进行比对，发现在第1内含子区域存在一个G到T(AC_000160.1的第2458位，存在于引物对P1扩增区域内)和一个G到A(AC_000160.1的第3878位，存在于引物对P2扩增区域内)的突变，发现有自然酶切位点。

五、PCR产物酶切及RFLP检测

提取待测黄牛血样基因组DNA，对于PCR扩增后的产物(图2-1、图2-2)首先分别l利用限制酶Apa I和Sal I进行酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

10μL Apa I酶切体系为：PCR产物5μL，10×NEBuffer 1.5μL，Apa I(50U/μL)0.3μL，ddH₂O 3.2μL，25℃恒温培养箱中消化12～16h；

10μL Sal I酶切体系为：PCR产物5μL，10×NEBuffer 1.5μL，Sal I(20U/μL)0.3μL，ddH₂O 3.2μL，酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化12～16h；

制作2.5％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳40min，待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像。根据电泳条带的图像，判断基因型。

由于引物对P1和P2的扩增产物不含其它的酶切位点，因此，黄牛CRABP2基因第2458位碱基多态性为(图3-1)：GG基因型表现为284bp和88bp的两条条带；GT基因型表现为284bp、88bp和372bp的三条条带；TT基因型表现为372bp的一条条带。第3878位的碱基多态性为(图3-2)：GG基因型表现为269bp和705bp的两条条带；GA基因型表现为269bp、705bp和974bp的三条条带；AA基因型表现为974bp的一条条带。

六、黄牛CRABP2基因SNP位点的频率统计及其与生长性状的关联分析

1.基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一位点的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位点的BB基因型频率；N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

P_B＝(2N_BB+N_Bb1+N_Bb2+N_Bb3+N_Bb4+……+N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B频率，N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数量，NBbi表示群体中具有Bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。

各黄牛品种种群中的基因频率与基因型频率的统计结果如表5、表6所示。

表5.黄牛CRABP2基因第2458位群体遗传学分析

表6.黄牛CRABP2基因第3878位群体遗传学分析

2.相关分析统计模型

利用SPSS(20.0)软件分析基因位点与生长性状的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响体尺和体重等生长发育指标的因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的基因型效应；Eijk为随机误差。

利用上述方法对相关数据进行统计，结果如表7和表8。

表7.秦川牛CRABP2基因第2458位不同基因型与生长性状的关联性分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)

表8.秦川牛CRABP2基因第3878位不同基因型与生长性状的关联性分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)

结果表明，在黄牛CRABP2基因组序列的第2458位单核苷酸多态性位点上的不同基因型与秦川牛体尺和体重等生长性状关联分析表明：该位点G到T的碱基突变对体高和十字部高影响显著，且GT型和TT型显著高于GG型；同样，第3878位点突变也对体高和十字部高影响显著，且该突变对十字部高影响极显著，AA型极显著高于GG型，而AA型的体高也显著大于GG型。这说明CRABP2基因两个突变位点的等位基因T和A与秦川牛的生长性状(体高和十字部高)密切相关，因此，第2458位TT和GT以及第3878位AA基因型可作为黄牛体尺性状早期选择的分子育种基因标记。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种快速检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法及其专用试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ccagaggagc ctgtgggtta t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aatccccttt ccccttggc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggtggacaaa ggaccaaaag tg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agccaccgtt gttcttaaat t 21

Claims (8)

1.一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，分别扩增CRABP2基因的部分片段a和b，将片段a对应的扩增产物经限制性内切酶Apa I消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将片段b对应的扩增产物经限制性内切酶Sal I消化后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛CRABP2基因的单核苷酸多态性位点的基因型；

所述黄牛CRABP2基因的单核苷酸多态性位点分别为牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1的第2458位的G或T的单核苷酸突变位点和第3878位的G或A的单核苷酸突变位点；牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1的第2458位TT和GT以及第3878位AA基因型为秦川牛体高和十字部高早期选择的分子育种基因标记；

所述第2458位位于引物对P1扩增的区域内，引物对P1的序列为：

上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’

下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’

所述第3878位位于引物对P2扩增的区域内，引物对P2的序列为：

上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’

下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’。

2.如权利要求1所述一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述扩增采用的PCR反应体系包括10ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

3.如权利要求1所述一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述扩增采用的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30～60s，32个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

5.如权利要求1所述一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述限制性内切酶Apa I的酶切体系包括扩增产物5μL以及50U/μL Apa I 0.3μL，酶切条件为于25℃消化12～16h；限制性内切酶Sal I的酶切体系包括扩增产物5μL以及20U/μL SalI0.3μL，酶切条件为于37℃消化12～16h。

6.如权利要求1所述一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：根据限制性内切酶Apa I消化后进行的琼脂糖凝胶电泳的结果判定黄牛CRABP2基因与片段a对应区域内的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为284bp和88bp的两条条带，GT基因型表现为284bp、88bp和372bp的三条条带，TT基因型表现为372bp的一条条带；根据限制性内切酶Sal I消化后进行的琼脂糖凝胶电泳的结果判定黄牛CRABP2基因与片段b对应区域内的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为269bp和705bp的两条条带；GA基因型表现为269bp、705bp和974bp的三条条带；AA基因型表现为974bp的一条条带。

7.一种如权利要求1所述的检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1的第2458位TT和GT以及第3878位AA基因型为秦川牛体高和十字部高早期选择的分子育种基因标记。

8.一种检测黄牛CRABP2基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：包括基于PCR-RFLP法对作为秦川牛体高和十字部高早期选择的分子育种基因的位于牛CRABP2基因参考基因组序列AC_000160.1的第2458位的G或T的单核苷酸突变位点和第3878位的G或A的单核苷酸突变位点进行基因分型的PCR扩增引物对P1和P2，以及限制性内切酶Apa I和Sal I；

所述第2458位位于引物对P1扩增的区域内，引物对P1的序列为：

上游引物F1：5’-CCAGAGGAGCCTGTGGGTTAT-3’

下游引物R1：5’-AATCCCCTTTCCCCTTGGC-3’

所述第3878位位于引物对P2扩增的区域内，引物对P2的序列为：

上游引物F2：5’-GGTGGACAAAGGACCAAAAGTG-3’

下游引物R2：5’-AGCCACCGTTGTTCTTAAATT-3’。

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