CN112899373A

CN112899373A - 与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的snp标记及其应用

Info

Publication number: CN112899373A
Application number: CN202110118706.8A
Authority: CN
Inventors: 陈洪波; 张晶; 刘青
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN112899373B

Abstract

本发明涉及三个与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记及其应用，第一SNP标记位于奶牛第4号染色体正链的第38631379bp处，碱基是G或A，第一SNP标记的AG基因型和AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率均极显著高于GG基因型；第二SNP标记位于奶牛第20号染色体正链的第35233378bp处，碱基是C或T，第二SNP标记的CC基因型个体的乳脂率显著高于TT基因型；第三SNP标记位于奶牛第7号染色体正链的第43518518bp处，第三SNP标记CC基因型个体的乳脂率极显著高于CT基因型和TT基因型。本发明应用以上三个SNP标记进行联合选育，大大增加了对乳品质性状选择的准确性和有效性，可使牛奶的乳脂率和乳蛋白率同时提升，且不会使体细胞数升高，不会增加奶牛患乳房炎的风险。

Description

与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及三个与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记及其应用。

背景技术

牛奶的品质决定了其营养价值和收购价格。乳脂不仅是牛奶的重要成分，还是食用黄油和奶油的主要成分。因此，乳脂率作为衡量牛奶中乳脂含量的指标，其值的高低直接关系到奶企和相关副产品加工企业的经济效益。目前，想要提高牛奶的乳脂率需要从生产管理和遗传改良两个方面入手。通过生产管理提高乳脂率的方法对饲料原料品质、饲料加工水平和饲喂方法都有较高的要求，从而导致饲料和人工成本的增加。通过遗传改良的方式来提高牛奶中的乳脂率的方法目前在实际生产中应用较少，这是因为该性状是一种典型的数量性状，具有个体差异大、受多基因控制且对环境影响敏感等特点。通过表型对该性状状直接选择会因为个体和环境差异的干扰而效果不明显，而通过单个基因或单个SNP位点进行标记辅助选择在实际生产中进展缓慢，这是因为单个基因或SNP的效应对数量性状的影响有限。

Snapshot技术是一种新型的测序技术。该技术基于荧光标记单碱基延伸原理，使用引物扩增目标SNPs所在的片段，扩增产物经纯化后作为单碱基延伸的模板，使用测序酶、四种具有荧光标记的ddNTP和5’-端紧靠SNP位点的延伸引物进行PCR反应，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。该技术具有分型准确、通量高、检测速度快、不受SNP位点多态性特性限制和样本个数限制等优点，适用于同时检测和分析多个SNP位点的多态性。

在奶牛育种的过程中，通过现代分子生物学技术以及统计学的方法，寻找与奶牛乳脂率相关的基因，筛选与提高乳脂率性状密切相关的多个SNP分子标记进行育种，可以提高育种准确性，加快遗传育种进程，从根本上提高奶牛的乳品质，促进我国奶业的持续健康发展。

乳脂率是衡量乳质优劣的重要指标。按照我国现有标准，收购原料奶时乳脂率不得低于3.1％，而优质奶源的乳脂率不得低于3.5％。西方发达国家则对牛奶的乳脂率提出了更高的要求，如意大利要求生牛乳中的乳脂率不得低于3.7％，法国则要求生牛乳中的乳脂率不得低于3.8％。通过比较这些标准不难看出，我国牛奶的品质想要追上世界发达水平，乳脂率仍需进一步提高。

发明内容

本发明提供三个与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记及其应用，以提高高乳脂率奶牛育种的准确性，从根本上提高奶牛的乳品质。

第一方面，本发明提供了与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记，为第一SNP标记、第二SNP标记或第三SNP标记；第一SNP标记位于奶牛第4号染色体正链的第38631379bp处，碱基是G或A，第一SNP标记的AG基因型和AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率均极显著高于GG基因型；第二SNP标记位于奶牛第20号染色体正链的第35233378bp处，碱基是C或T，第二SNP标记的CC基因型个体的乳脂率显著高于TT基因型；第三SNP标记位于奶牛第7号染色体正链的第43518518bp处，第三SNP标记CC基因型个体的乳脂率极显著高于CT基因型和TT基因型。

第二方面，本发明提供了用于检测上述SNP标记的引物对，包括第一SNP标记、第二SNP标记或第三SNP标记的引物对，其中：

第一SNP标记的引物对：

正向引物：5’-ATGTGTTTCAATTTAGGATGAAWGTCTATG-3’，如SEQ ID NO：1所示；

反向引物：5’-CAGTYACCACCTGATCCCCAAGT-3’，如SEQ ID NO：2所示；

第二SNP标记的引物对：

正向引物：5’-AGCCACCCATGAATACAGAGGA-3’，如SEQ ID NO：3所示；

反向引物：5’-CCAGGAAAAGGAGATACTGACGTCTC-3’，如SEQ ID NO：4所示；

第三SNP标记的引物对：

正向引物：5’-GGACTTCACCAKCCCTTTCTTC-3’，如SEQ ID NO：5所示；

反向引物：5’-GTCCAAAGAGGATGGCATAGCAG-3’，如SEQ ID NO：6所示；

其中，核苷酸序列中W、Y和K均为简并碱基，W代表A或T，Y代表C或T，K代表G或T。

第三方面，本发明提供了一种用于检测上述SNP标记的试剂盒，该试剂盒含有上述引物对，还含有以下单碱基延伸引物中的一种或几种：

第一SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGATTCAGAAACTCTGAAACC-3’，如SEQ ID NO：7所示；

第二SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-TTTTTGMGAGCCCCACCAAGACTG-3’，如SEQ ID NO：8所示；

第三SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-AGTGCAGCGGCCACATGAAG-3’，如SEQ ID NO：9所示。

其中，核苷酸序列中M为简并碱基，代表A或C。

第四方面，本发明提供了上述SNP标记、上述引物对、上述试剂盒在辅助鉴定中国南方荷斯坦奶牛乳脂率性状中的用途。

第五方面，本发明提供了一种选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，通过对待测中国南方荷斯坦奶牛进行上述SNP标记的检测，评估待测中国南方荷斯坦奶牛的乳脂率性状，选育高乳脂率的优势品种。

在上述技术方案的基础上，选育中国南方荷斯坦奶牛的方法包括以下步骤：

提取待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA；

以待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行多重PCR扩增反应；

利用上述单碱基延伸引物对PCR扩增产物进行单碱基延伸反应，延伸产物测序，确定第一标记、第二标记或第三标记基因型，选择目标基因型的个体用于培育高乳脂率优势品种。

在上述技术方案的基础上，用于杂交育种的亲本之一至少符合以下条件中的一种：(i)第一SNP标记含有等位基因A、(ii)第二SNP标记含有等位基因C、(iii)第三SNP标记含有等位基因C。从而使优势等位基因在群体中快速扩散，加快培育高乳脂率优势后代群体的进程。

优选地，选择至少符合以下条件中的一种的个体作为高乳脂率的优势个体：(i)第一SNP标记为AA基因型，(ii)第二SNP标记为CC基因型，(iii)第三SNP标记为CC基因型。更优选地，选择同时满足(i)第一SNP标记为AA基因型，(ii)第二SNP标记为CC基因型和(iii)第三SNP标记为CC基因型的个体作为高乳脂率的优势个体。优选地，中国南方荷斯坦奶牛为武汉地区荷斯坦奶牛。

本发明提供的技术方案带来的有益效果包括：

1.本发明提供的三个与中国南方荷斯坦奶牛的乳品质显著相关的SNP标记，第一SNP标记rs41649823位点位于CACNA2D1基因上，第二SNP标记rs109262355位点位于FYB1基因上，第三SNP标记rs110304043位点位于GRIN3B基因上，这些SNP标记为中国南方地区荷斯坦奶牛高乳品质群体的标记辅助选择提供了科学依据，同时也丰富了奶牛育种的分子标记遗传资源库。

2.本发明通过对CACNA2D1基因的rs41649823位点、FYB1基因的rs109262355位点和GRIN3B基因的rs110304043位点进行标记辅助选择，让提高乳脂率和乳蛋白率的这些优势基因型在奶牛群体内快速扩散，进而提升奶牛群体的乳品质。

3.本发明对以上三个SNP分子标记进行联合选育，大大增加了对乳品质性状选择的准确性和有效性，可使牛奶的乳脂率提升10％，同时乳蛋白率也提升3％，且不会使体细胞数升高，不会增加奶牛患乳房炎的风险。通过标记辅助技术进行乳品质性状的早期选择，可以加快改善中国南方地区荷斯坦牛群的泌乳性能，培育更加优质的奶牛品种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1～图3为rs41649823位点分型结果图；

图4～图6为rs109262355位点分型结果图；

图7～图9为rs110304043位点分型结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过现代分子生物学技术以及统计学的方法，寻找到三个与提高乳脂率密切相关的SNP分子标记，第一SNP标记rs41649823位点位于CACNA2D1基因上，第二SNP标记rs109262355位点位于FYB1基因上，第三SNP标记rs110304043位点位于GRIN3B基因上。

CACNA2D1基因：该基因位于奶牛第4号染色体正链的38152730-38673177bp区间内。

FYB1基因：该基因位于奶牛第20号染色体正链的35232726-35331223bp区间内。

GRIN3B基因：该基因位于奶牛第7号染色体正链的43514607-43523552bp区间内。

三个SNP标记信息如下。

表1用于进行关联分析的3个SNP标记的信息

注：SNP标记所处的位置用“所处染色体号：在染色体上的位置”的形式进行标注。

钙电压门控通道辅助亚基α2δ1基因(Calcium Voltage-Gated ChannelAuxiliary Subunit Alpha 2Delta 1，CACNA2D1)编码了电压依赖性钙通道复合物的α2δ1亚基。该复合物可通过提高膜钙离子通道的表达功能、增加本体结合位点、改变钙流的依电压和动力学活性等途径，增强钙通道复合物的通过能力。该基因的SNP丰富，绝大多数SNP位于内含子中。已有研究证明该基因的突变可导致乳腺炎、Brugada综合征和短QT综合征等疾病。由于钙离子能够作为第二信使影响动物脂肪细胞和肌肉细胞中的脂肪代谢和能量分配过程，该基因的突变极有可能与动物脂肪的代谢和利用相关，但相关报道至今尚未出现。

FYN结合蛋白1基因(FYN Binding Protein1，FYB1)是编码的蛋白是T细胞FYN蛋白和LCP2信号通路的控制器，其相关通路包括TCR信号通路和Ras信号通路。该基因负责调控血小板激活并控制白细胞介素2的表达。FYB1基因的突变可能会引起包括3型血小板减少和先天性常染色体隐性小血小板减少。有关该基因上的突变对动物生理和病理行为影响的研究较为罕见，其对奶牛生产性状的影响更是尚未报道。

谷氨酸离子通道N-甲基-D-天冬氨酸受体3B亚基基因(Glutamate IonotropicReceptor N-Methyl-D-Aspartate Type Subunit 3B，GRIN3B)编码的蛋白质是N-甲基-D-天冬氨酸受体的3B亚基。这种蛋白质主要存在于运动神经元中，是构成谷氨酸传输系统的重要成员，协助调控了中枢神经系统的兴奋性。该基因的突变已被证明与包括精神分裂症、智力障碍在内的一系列精神疾病有关，还有可能会影响包括运动和睡眠等生理行为，但其对奶牛生产性状的影响尚未见报道。

需要说明的是，以下实施例中涉及到的核苷酸序列中K、W、Y、M均为简并碱基，其中K代表G或T，W代表A或T，Y代表C或T，M代表A或C。

实施例1：与乳脂率密切相关的SNP标记的获得和验证

1.血液样品和表型数据的收集

以湖北武汉地区某规模化奶牛场的785头中国荷斯坦奶牛为实验对象，尾静脉采血，EDTA抗凝，-20℃保存。采集这些奶牛的乳汁，监测乳汁中的乳脂率、乳蛋白率和体细胞数，共获得相关数据1255个，其中一胎数据777个，二胎牛数据386个，三胎数据92个。

2.总DNA的提取和检测

用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒从785头中国荷斯坦奶牛的血液样品中提取全基因组DNA。在200μL全血中加入200μL缓冲液GB和20μL蛋白酶K后充分颠倒混匀，56℃充分静置后加入350μL缓冲液BD，充分颠倒混匀后过吸附柱。向吸附柱中分别加入500μL缓冲液GDB和600μL漂洗液PWB离心后，室温晾干吸附柱中残余的漂洗液。最后将吸附柱转入离心管，滴加洗脱缓冲液TB，室温静置离心后收集溶液。1μL的DNA样品用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度，然后将其稀释到工作浓度5-10ng/μL。

3.PCR反应

根据NCBI提供的参考序列，用Primer3.0在线软件设计PCR扩增引物，三个SNP位点的PCR扩增引物对如下：

rs41649823位点的引物对：

正向引物：5’-ATGTGTTTCAATTTAGGATGAAWGTCTATG-3’；

反向引物：5’-CAGTYACCACCTGATCCCCAAGT-3’；

rs109262355位点的引物对：

正向引物：5’-AGCCACCCATGAATACAGAGGA-3’；

反向引物：5’-CCAGGAAAAGGAGATACTGACGTCTC-3’；

rs110304043位点的引物对：

正向引物：5’-GGACTTCACCAKCCCTTTCTTC-3’；

反向引物：5’-GTCCAAAGAGGATGGCATAGCAG-3’。

PCR反应体系(20μL)包含1×GC-I缓冲液(购于Takara公司)，3.0mM Mg²⁺，0.3mMdNTP，1U热启动Taq酶(购于Qiagen公司)，1μL样本DNA和正反向引物各0.5μL，其中rs41649823位点的引物浓度为3μM，rs109262355位点的引物浓度3μM，rs110304043位点的引物浓度为1μM。反应过程为：(1)95℃2min；(2)依次进行94℃20s、65℃40s(-0.5℃/循环)、72℃1.5min，三步共11个循环；(3)依次进行94℃20s、59℃30s、72℃1.5min，三步共24个循环；(4)72℃2 min。rs41649823位点的扩增产物长度428 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示：

rs109262355位点的扩增产物长度181 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示：

rs110304043位点的扩增产物长度263 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示：

1.4 PCR产物纯化

在10μLPCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。

1.5 Snapshot单碱基延伸反应

纯化后的PCR产物用ABI公司的Snapshot Multiplex kit进行单碱基延伸反应，其中：

rs41649823位点的单碱基延伸引物(SF)为：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGATTCAGAAACTCTGAAACC-3’；

rs109262355位点的单碱基延伸引物(SF)为：

5’-TTTTTGMGAGCCCCACCAAGACTG-3’；

rs110304043位点的单碱基延伸引物(SR)为：

5’-AGTGCAGCGGCCACATGAAG-3’；

延伸反应体系(10μL)包括5μL Snapshot Multiplex Kit(ABI)，2μL纯化后多重PCR产物，2μL超纯水，1μL延伸引物混合物，rs41649823位点的引物浓度为1.6μM，rs109262355位点的引物浓度为2.4μM，rs110304043位点的引物浓度为0.8μM。反应过程为：(1)96℃1min；(2)96℃10s、55℃5s，60℃30s，三步共28个循环。

1.6延伸产物纯化

在10μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1h，然后75℃灭活15min。

1.7延伸产物测序

取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD，9μLHi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3730XL测序仪，获得的原始数据用GeneMapper 4.1(美国应用生物系统公司，USA)来分析。用Excel分别计算两个位点的基因型频率和等位基因频率，用卡方检验分析两个位点的哈代-温伯格平衡情况。

实施例2：SNP标记与生产性状的关联分析

用Excel计算每个位点的基因型频率和等位基因频率，利用卡方检验分析每个位点的哈代-温伯格平衡情况。用SAS在线程序(https://welcome.oda.sas.com/)的univariate过程对乳脂率、乳蛋白率和体细胞数进行正态性检验，用BOX-COX法进行数据转化，用“平均值±3倍标准差”剔除异常值。用GLM过程检验基因型对校正后的各项性状的影响，检验模型为Y＝μ+P+S+G+e，其中Y为个体性状表型值，μ为群体均值，P为胎次的固定效应，S为产犊季节的固定效应，G为基因型的固定效应，e为随机误差效应。用DUNCAN法对不同基因型的个体性状表型值进行多重比较。

2.1基因和基因型频率

奶牛血液DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带明亮，无蛋白污染。采用NanoDrop2000核酸浓度仪测定，95％以上样本质量浓度大于10ng/μL，浓度和纯度可以满足Snapshot分型实验要求。

经检测，rs41649823位点、rs109262355位点和rs110304043位点的基因频率和基因型频率如表2所示，两个基因均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。

表2三个SNP位点的基因型频率和基因频率

2.2表型数据统计

试验选用的中国南方荷斯坦奶牛群体3个乳品质性状的测定结果如表3所示。实验群体总体生产水平较高，但个体间差异也比较大，存在较大的选育空间。

表3乳品质性状的统计结果

2.3关联分析

关联分析显示了3个位点的不同基因型对乳品质的影响，结果如表4所示。CACNA2D1基因的rs41649823位点对乳脂率和乳蛋白率的效应极显著(P<0.01)，对体细胞数的效应不显著(P>0.05)；FYB1基因的rs109262355位点对乳脂率的效应显著(P<0.05)，对乳蛋白率和体细胞数的效应不显著(P>0.05)；GRIN3B基因的rs110304043位点对乳脂率的效应极显著(P<0.01)，对体细胞数的效应不显著(P>0.05)。多重比较结果表明：CACNA2D1基因的rs41649823位点AG基因型和AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率均显著高于GG基因型，两个性状的平均增幅分别为5.42％和3.13％；FYB1基因的rs109262355位点的CC基因型个体的乳脂率显著高于TT基因型，增幅为2.95％；GRIN3B基因的rs110304043位点的CC基因型个体的乳脂率极显著高于CT基因型和TT基因型，增幅为2.98％。

表4 SNP标记与乳品质性状间的关联分析

注：不同小写字母表示同一位点同一性状的不同基因型相比，差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一位点同一性状的不同基因型相比，差异极显著(P<0.01)，下同。

本发明研究结果显示，CACNA2D1基因的rs41649823位点，FYB1基因的rs109262355位点和GRIN3B基因的rs110304043位点可以作为影响中国南方地区荷斯坦奶牛乳品质的重要候选基因。在生产实践中，可以通过选择第一SNP标记含有等位基因A、第二SNP标记含有等位基因C和/或第三SNP标记含有等位基因C的个体作为亲本之一，通过杂交育种的方法使三个位点的优势等位基因在群体中快速扩散，加快乳品质性状的新品种培育进程。也可以通过选择第一SNP标记为AA基因型、第二SNP标记为CC基因型和第三SNP标记为CC基因型的个体作为高乳脂率、高乳蛋白率的优势个体进行育种，提升后代群体乳脂率的同时，也提高群体的乳蛋白率，且不会使牛奶中的体细胞数增加。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgtttca atttaggatg aawgtctatg 30

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtyaccac ctgatcccca agt 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agccacccat gaatacagag ga 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaggaaaag gagatactga cgtctc 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacttcacc akccctttct tc 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtccaaagag gatggcatag cag 23

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttttttttt tttttttttc agattcagaa actctgaaac c 41

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttttgmgag ccccaccaag actg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtgcagcgg ccacatgaag 20

<210> 10

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtgtttca atttaggatg aaagtctatg tttttcctta ttaggttatc tttctaacgc 60

cttattgaca tcaaatatca ggatgcatat tctgattctt atctaaccct ataatattgt 120

attttcagat tcagaaactc tgaaaccrga taattttgaa gagtctggct atacgttcat 180

agcaccaagg taggttttgt ttggttttct tttttaaggc tcattgtgga tgtataggcc 240

ttcaagaata ggtcagagtt gggggtcaag actgctctgg gttatgccat gtctaattat 300

ggaaccaaag gaaacagtaa gtttaaaact gaaggagaat tctgttcgtt cagtcattca 360

cccattcagg tacttagctg ctgcattgtg ctaaacagga tgccgacttg gggatcaggt 420

ggtgactg 428

<210> 11

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agccacccat gaatacagag gatccccagg aagatgagag ccccaccaag actgyggctc 60

cacagagagg gcccctggtc cccctggcag ccaaggccaa gtctggccct ttgaaaccag 120

ccagggaaga gccagagaat aaagagcacg gaggtgagac gtcagtatct ccttttcctg 180

g 181

<210> 12

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggacttcacc agccctttct tctccaccag cctgggcatc atggtgcgcg cacgcgacac 60

ggcgtcgccc attggcgyct tcatgtggcc gctgcactgg tccatgtggc tgggcgtctt 120

cgctgcgctg cacctgaccg cactcttcct caccctctac gagtggcgca gccccttcgg 180

cctaacaccc cgcggacgca accgggacac cgtgttctcc tactcctctg ccctcaacct 240

ctgctatgcc atcctctttg gac 263

Claims

1.与中国南方荷斯坦奶牛乳脂率相关的SNP标记，其特征在于：为第一SNP标记、第二SNP标记或第三SNP标记；第一SNP标记位于奶牛第4号染色体正链的第38631379bp处，碱基是G或A，第一SNP标记的AG基因型和AA基因型个体的乳脂率和乳蛋白率均极显著高于GG基因型；第二SNP标记位于奶牛第20号染色体正链的第35233378bp处，碱基是C或T，第二SNP标记的CC基因型个体的乳脂率显著高于TT基因型；第三SNP标记位于奶牛第7号染色体正链的第43518518bp处，碱基是C或T，第三SNP标记CC基因型个体的乳脂率极显著高于CT基因型和TT基因型。

2.用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于：所述引物对为第一SNP标记、第二SNP标记、第三SNP标记的引物对中的一种或几种；其中：

第一SNP标记的引物对：

正向引物：5’-ATGTGTTTCAATTTAGGATGAAWGTCTATG-3’，

反向引物：5’-CAGTYACCACCTGATCCCCAAGT-3’；

第二SNP标记的引物对：

正向引物：5’-AGCCACCCATGAATACAGAGGA-3’，

反向引物：5’-CCAGGAAAAGGAGATACTGACGTCTC-3’；

第三SNP标记的引物对：

正向引物：5’-GGACTTCACCAKCCCTTTCTTC-3’，

反向引物：5’-GTCCAAAGAGGATGGCATAGCAG-3’；

3.一种用于检测权利要求1所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有以下单碱基延伸引物中的一种或几种：：

第一SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGATTCAGAAACTCTGAAACC-3’；

第二SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-TTTTTGMGAGCCCCACCAAGACTG-3’；

第三SNP标记的单碱基延伸引物：

5’-AGTGCAGCGGCCACATGAAG-3’；

其中，核苷酸序列中M为简并碱基，代表A或C。

5.权利要求1所述的SNP标记、权利要求2所述的引物对、权利要求3或4所述的试剂盒在辅助鉴定中国南方荷斯坦奶牛乳脂率性状中的用途。

6.一种选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：通过对待测中国南方荷斯坦奶牛进行权利要求1所述的SNP标记的检测，评估所述待测中国南方荷斯坦奶牛的乳脂率性状，选育高乳脂率优势品种。

7.根据权利要求6所述的选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA；

以待测中国南方荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行多重PCR扩增反应；

利用权利要求4所述的单碱基延伸引物对PCR扩增产物进行单碱基延伸反应，延伸产物测序，确定第一SNP标记、第二SNP标记或第三SNP标记基因型，选择目标基因型的个体用于培育高乳脂率优势品种。

8.根据权利要求7所述的选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：用于杂交育种的亲本之一至少符合以下条件中的一种：(i)第一SNP标记含有等位基因A、(ii)第二SNP标记含有等位基因C、(iii)第三SNP标记含有等位基因C。

9.根据权利要求8所述的选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：选择同时满足(i)第一SNP标记为AA基因型、(ii)第二SNP标记为CC基因型和(iii)第三SNP标记为CC基因型的个体作为高乳脂率优势个体。

10.根据权利要求6～9所述的选育中国南方荷斯坦奶牛的方法，其特征在于：所述中国南方荷斯坦奶牛为武汉地区荷斯坦奶牛。