CN108841969B - 一种检测黄牛msrb3基因插入/缺失标记的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法：以待检黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3和P4为引物，分别PCR扩增黄牛个体MSRB3基因部分片段，通过电泳检测PCR扩增产物，根据电泳检测结果分别判定黄牛个体MSRB3基因上四个插入/缺失突变位点的基因型；本发明根据检测到的MSRB3基因indel突变位点NC_007303.6g.48797975‑48798004del、g.48816764ins、g.48896074‑48896095del、g.48903091ins的基因型，可应用于黄牛的分子标记辅助选择中，从而加快生长性状优良的地方黄牛种群的建立。

Description

一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，涉及黄牛MSRB3基因插入/缺失(indel)的检测。
背景技术
插入/缺失(insertion-deletion,Indel)突变是指在DNA序列水平上发生了不同长度核苷酸片段的插入或者缺失，即一段DNA序列上某一位点相比与其同源的另一段DNA序列发生了一个或多个碱基插入或缺失的情况，其发生频率仅次于残基替换的进化改变。相比于其他分子标记技术，Indel标记具有稳定性好、多态性高、分型系统简单的优点。就在基因组DNA中的分布密度而言，Indel仅次于SNP，但远高于SSR。Indel大致可分为以下5大类：1)单碱基对的插入/缺失；2)单一碱基的插入/缺失；3)重复单元为2-15个碱基的多碱基对插入/缺失；4)转座子插入/缺失；5)任意DNA序列的插入/缺失。在基因组DNA中，虽然Indel的分布频率很高，但其分布区域并不是均匀的，在不同的染色体上有着不同的分布密度。通过对19种哺乳动物的Indel模式的研究，发现插入和缺失的数目都与空位长度增加呈负相关，插入/缺失概率可通过相关方程计算得出。
2006年，第一个人类基因组Indel图谱由Mills等人创建，该图谱中有超过41万多个特异性的Indel位点。2011年又在人类基因组中发现了长度从1bp到10000bp不等的近200万个Indel标记，大部分长度集中在100bp以内。目前，对Indel的研究多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米)的基因组研究上，在畜禽上则集中于对鸡体尺性状的研究，在反刍动物上研究和应用非常少。2005年，Schnabel等人曾结合SSR标记和Indel标记对控制奶牛产奶量的相关基因多态性进行了研究，并成功进行了精细定位。
标记辅助选择(Marker assisted selection,MAS)是通过分析与目标基因所连锁的分子标记的基因型而进行育种的一种方法，其目的是提高育种效率。此法可以缩短育种年限，加快育种进程，从而提高育种效率，并可克服很多常规育种方法难以解决的困难。标记辅助选择可在品种内和品种间进行，既可对单个性状进行辅助选择，也可对多个性状进行综合选择，而且可同时实现对数量性状和质量性状的选择。与此同时，其并不引入外源基因，而是直接在DNA水平上选择差异。分子标记辅助育种的效率主要与性状的遗传力、标记与目标基因连锁程度及标记数目、与标记位点有关的加性遗传方差比例、基因型与环境互作，以及控制性状基因的效应和数目等5个因素有关。
甲硫氨酸亚砜还原酶B3(methionine sulfoxide reduetase B3,MSRB3)基因，其表达产物是内质网(ER)型酶。哺乳动物细胞编码单个MsrA和3个MsrB基因(MsrB1-B3)，MSRB3是三种MsrB之一。在组成蛋白质的氨基酸中，最易被氧化的氨基酸是甲硫氨酸，其极易被细胞代谢过程中产生的活性氧(ROS)氧化为甲硫氨酸硫氧化物(methioninesulfoxide,MetO)。这种Met到MetO的氧化反应，由于在化学结构上产生了一个不对称的硫原子，从而会生成两个对映异构体，即Met—R(O)和Met-S(O)。甲硫氨酸硫氧化物还原酶(methionine sulfoxide reduetase,Msr)则可将这种氧化逆转，将游离或与蛋白结合的MetO重新还原为Met。Msr目前可分为两型，即MsrA和MsrB，对底物有手性要求，SelR是主要的MsrB类型。MsrA还原Met—S(O)，MsrB还原Met—R(O)。据报道，一系列与人类疾病相关的蛋白都被证明是MsrA和MsrB的底物，比如钙调蛋白、HIV-2蛋白酶、Alpha-1蛋白酶抑制剂等等。
EujinLee等曾发现MSRB3在应激耐受中起关键作用。MSRB3过度表达提高了果蝇的抗氧化，抗寒和抗热应激能力。此外，MSRB3还可以保护果蝇和哺乳动物细胞免受ER应激。EujinLee等近期发现MSRB3也可能直接参与衰老过程的调控。人类MSRB3在果蝇中的过表达增加了其寿命，延缓了运动能力和繁殖力的下降。然而，关于MSRB3在老化过程中的作用机理尚未被描述。
目前，对MSRB3基因的相关研究主要集中在人、小鼠、猪等动物上，且研究方向多集中于抗氧化及抗应激方面。MSRB3基因对p53-p21和p27途径的细胞增殖有抑制作用，同时具有抑制细胞生长作用。因此，MSRB3可调节哺乳动物细胞周期和细胞增殖的生理。但对中国地方黄牛MSRB3基因遗传变异领域的研究相当匮乏，特别是该基因的功能研究及其遗传变异与经济性状(如生长性状)关联的研究更是空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法，加快建立遗传资源优良的地方黄牛种群。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
以待检黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3和P4为引物，分别PCR扩增黄牛个体MSRB3基因部分片段，通过电泳检测PCR扩增产物，根据电泳检测结果分别判定黄牛个体MSRB3基因上四个插入/缺失突变位点的基因型；
所述引物对P1为：
上游引物：5`-ACGCACTGTATGATTCCA-3`
下游引物：5`-ATAGGCCAAGATAGAGGC-3`
所述引物对P2为：
上游引物：5`-GGGTGTTCATTCATTCATT-3`
下游引物：5`-GTCTTACCTCAGTAGCCATG-3`
所述引物对P3为：
上游引物：5`-GCATAAGAAAGCCAACCT-3`
下游引物：5`-CAGCCTCATCATCTCATCCA-3`
所述引物对P4为：
上游引物：5`-GAGCCCTAATGGATAAAA-3`
下游引物：5`-AGTGTTGAAGTTGCCTGT-3`。
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃～54℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
所述电泳采用10％(质量浓度)聚丙烯酰胺凝胶电泳。
所述MSRB3基因上四个插入/缺失突变位点的基因型的判定依据为：对于由引物对P1扩增的插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48797975-48798004 delTGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA)，野生型(II型)表现为161bp条带，突变纯合型(DD型)表现为131bp条带，杂合型(ID型)表现为161bp和131bp两个条带；对于由引物对P2扩增的插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48816764 ins TTCTTTTGGCAACTGCAG)，野生型(DD型)表现为330bp条带，突变纯合型(II型)表现为348bp条带，杂合型(ID型)表现为330bp和348bp两个条带；对于由引物对P3扩增的插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48896074-48896095del TTTTTCTTTGTCTGGTACACTT)，野生型(II型)表现为221bp条带，突变纯合型(DD型)表现为199bp条带，杂合型(ID型)表现为221bp和199bp两个条带；对于由引物对P4扩增的插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48903091ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT)，野生型(DD型)表现为332bp条带，突变纯合型(II型)表现为369bp条带，杂合型(ID型)表现为332bp和369bp两个条带。
本发明的有益效果体现在：
本发明建立了一种检测中国地方黄牛MSRB3基因插入/缺失分子标记的方法，根据检测到的与黄牛生长性状关联的MSRB3基因插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48797975-48798004del TGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA、NC_007303.6g.48816764 insTTCTTTTGGCAACTGCAG、NC_007303.6g.48896074-48896095 del TTTTTCTTTGTCTGGTACACTT、NC_007303.6g.48903091 ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT)的基因型，可应用于黄牛的分子标记辅助选择中，从而加快生长性状优良的地方黄牛种群的建立。
附图说明
图1为中国地方黄牛MSRB3基因上四个插入/缺失突变位点的PCR产物电泳结果。
图2为中国地方黄牛MSRB3基因上插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48797975-48798004del TGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA)的PCR产物测序结果。
图3为中国地方黄牛MSRB3基因上插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48816764insTTCTTTTGGCAACTGCAG)的PCR产物测序结果。
图4为中国地方黄牛MSRB3基因上插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48896074-48896095del TTTTTCTTTGTCTGGTACACTT)的PCR产物测序结果。
图5为中国地方黄牛MSRB3基因上插入/缺失突变位点(NC_007303.6g.48903091ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT)的PCR产物测序结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。
本发明通过对中国地方黄牛MSRB3基因上与生长性状关联的潜在位点进行检测，以便于快速进行中国地方黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的地方黄牛种群，具体样本的检测和性状关联分析如下。
(1)中国地方黄牛MSRB3基因突变位点引物设计
根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公布的牛MSRB3(NC_007303.6)序列作为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含MSRB3基因Indel突变位点的特异性PCR引物，其引物序列如下(引物设计完成时间为2017年3月)：
引物对P1为：
上游引物：5`-ACGCACTGTATGATTCCA-3` 18nt
下游引物：5`-ATAGGCCAAGATAGAGGC-3` 18nt
引物对P2为：
上游引物：5`-GGGTGTTCATTCATTCATT-3` 19nt
下游引物：5`-GTCTTACCTCAGTAGCCATG-3` 20nt
引物对P3为：
上游引物：5`-GCATAAGAAAGCCAACCT-3` 18nt
下游引物：5`-CAGCCTCATCATCTCATCCA-3` 20nt
引物对P4为：
上游引物：5`-GAGCCCTAATGGATAAAA-3` 18nt
下游引物：5`-AGTGTTGAAGTTGCCTGT-3` 18nt
以上述引物对黄牛基因组进行PCR扩增，扩增产物为分别包含四个indel位点的特异性片段。
四个indel位点存在的插入/缺失多态性：对于突变位点一(即引物对P1扩增的位点：NC_007303.6g.48797975-48798004 del TGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA)，野生型(II型)表现为161bp条带，突变纯合型(DD型)表现为131bp条带，杂合型(ID型)表现为161bp和131bp条带；对于突变位点二(即引物对P2扩增的位点：NC_007303.6g.48816764 insTTCTTTTGGCAACTGCAG)，野生型(DD型)表现为330bp条带，突变纯合型(II型)表现为348bp条带，杂合型(ID型)表现为330bp和348bp条带；对于突变位点三(即引物对P3扩增的位点：NC_007303.6g.48896074-48896095 del TTTTTCTTTGTCTGGTACACTT)，野生型(II型)表现为221bp条带，突变纯合型(DD型)表现为199bp条带，杂合型(ID型)表现为221bp和199bp条带；对于突变位点四(即引物对P4扩增的位点：NC_007303.6g.48903091 ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT)，野生型(DD型)表现为332bp条带，突变纯合型(II型)表现为369bp条带，杂合型(ID型)表现为332bp和369bp条带。因此，利用PCR扩增和电泳检测，可对对应位点突变进行检测。
(2)以引物P1、P2、P3、P4 PCR扩增待检测黄牛的MSRB3基因片段
a、中国地方黄牛样本收集
本发明以秦川牛(n＝274)、鲁西牛(n＝113)、郏县红牛(n＝138)和南阳牛(n＝135)四个中国地方黄牛种群作为检测对象，具体采集样本见表1：
表1.黄牛样本的采集
Figure GDA0003300504560000051
b、血样基因组DNA的提取和均质化
使用北京艾德莱生物科技有限公司生产的小量全血基因组DNA快速提取试剂盒(目录号：DN01)进行黄牛全血基因组DNA的提取，具体操作步骤：
1)取200μL新鲜、冷冻或加入抗凝剂的血液，放入1.5mL离心管；
2)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟，溶液变清亮(但颜色偏黑色)；
3)冷却后加100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时会出现絮状沉淀；
4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液；
5)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液；
6)加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；
7)加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液；
8)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
9)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA；
10)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
11)吸取1μL DNA溶液，利用Tecan全波长酶标仪测定OD260和OD280，所有样品的OD260/OD280均需处于1.8-2.2之间，DNA浓度均需大于100μg/μL。不合格的样品做好标记，并进行重新提取。DNA检测完成后，取一定量DNA溶液，将其稀释至模板工作浓度10ng/μL，-20℃保存备用，其余未稀释DNA样品于-80℃冰箱中存放。
c、PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需要的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到2.0mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL PCR管中，然后加入模板DNA，震荡混匀，瞬时离心后进行PCR扩增；
PCR反应体系见表2：
表2.PCR反应体系
Figure GDA0003300504560000061
PCR反应程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，退火温度分别为54℃(P1)、50℃(P2)、54℃(P3)、51℃(P4)，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
对4个地方黄牛种群共计660个样本基因组DNA进行PCR扩增。
(3)收集采样个体的生长数据
收集660个中国地方黄牛的生长数据，为后续相关性分析做准备。所有采样个体年龄均在4-6岁之间。生长数据包括体高(Body height，BH)、体斜长(Body length，BL)、胸围(Chest circumference，CC)、腹围(Abdominal circumference，AC)、腰角宽(Hipbonewidth，HBW)、坐骨端宽(Hucklebone width，HW)、十字部髙(Hip height，HH)和体重(Bodyweight，BW)。其中，秦川牛体尺数据由秦川牛繁殖中心提供，南阳黄牛、郏县红牛的体尺数据由南阳黄牛保种场和郏县红牛保种场提供，鲁西牛的体尺数据由鲁西牛原种场提供。
(4)PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
a、制作10％聚丙烯酰胺凝胶，点样，200V电压电泳2h后，用DuRed染色30min；
b、在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
c、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析各个体indel类型，扩增后电泳结果如图1所示，其中，泳道M为Marker，其余泳道为不同基因型个体PCR后电泳检测片段。
d、不同基因型个体PCR产物测序验证
每个位点随机抽取各个基因型个体10个进行正反向测序；同时，进行Indel位置分析，确认插入/缺失序列及其位置，如图2、图3、图4及图5所示，结果表明电泳检测的结果与实际序列分型一致。
(5)中国地方黄牛MSRB3基因indel位点频率统计分析
a、群体遗传学参数
1)基因型频率：一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PJJ＝NJJ/N，其中PJJ代表某一位点的JJ基因型频率；NJJ表示群体中具有JJ基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
2)等位基因频率：一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PJ＝(2NJJ+NJi1+NJi2+NJi3+NJi4+……+NJin)/2N
式中，PJ表示等位基因J频率，NJJ表示群体中具有JJ基因型的个体数量，NJi1表示群体中具有Ji1基因型个体数量，i1－in为等位基因J的n个互不相同的复等位基因。
本发明所涉及的等位基因为I(插入)和D(缺失)，所以具体的基因频率计算公式为：
PI＝(2NII+NID)/2N
PD＝(2NDD+NID)/2N
式中，PI，PD分别表示等位基因I和等位基因D的频率，NII、NID和NDD分别表示II、ID和DD基因型的个体数量，N表示总群体数目。
3)多态信息含量(PIC)
PIC是衡量基因变异程度高低的一项指标。在一个群体中，PIC>0.5表示高度多态，PIC<0.25表示低度多态，PIC在两者之间表示中度多态。
Figure GDA0003300504560000071
式中:Pi、Pj分别指群体中第i、j个等位基因频率，m为等位基因数目。
4)遗传杂合度(He)
遗传杂合度是指特定位点等位基因不相同的可能性。
Figure GDA0003300504560000081
式中，Pi代表群体中第i个等位基因频率，n代表等位基因数目。
5)有效等位基因数(Ne)
有效等位基因数指一个基因座上产生与实际群体相同的纯合度所需的等位基因数。
Figure GDA0003300504560000082
式中：Pi代表群体中第i个等位基因频率，n为等位基因数目。
b、统计分析参见表3：
表3.中国地方黄牛MSRB3基因indel群体遗传学参数统计表
Figure GDA0003300504560000083
(6)Indel位点与中国地方黄牛生长性状的关联分析
a、关联分析模型：利用SPSS 18.0软件，分析MSRB3基因不同indel类型对体尺性状表现的影响。所用的线性模型：
Yijklmn＝μ+Ai+Ej+Ck+Ll+Gm+eijklmn
Yijklmn为性状观察值(SCS)，μ为总体均值，Ai为年龄的固定效应，Ej为季节的固定效应，Ck为产犊次数的固定效应，Ll为哺乳次数的固定效应，Gm为基因型(包括SNP)的固定效应，eijklmn为随机误差。
b、关联分析结果见表4：
表4.MSRB3基因indel位点与中国地方黄牛生长性状的关联分析
Figure GDA0003300504560000091
注：字母不同表示差异显著
表4结果表明：在突变位点一，南阳黄牛DD基因型个体体斜长显著高于II基因型个体，II基因型个体胸围和十字步高显著高于ID基因型个体；在突变位点三，秦川牛II基因型个体体重、胸长指数和胸围指数显著高于ID基因型个体；在突变位点四，鲁西牛II基因型个体坐骨端宽显著高于ID基因型和DD基因型。
总之，本发明提供的黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的检测方法，针对MSRB3基因内含子插入/缺失位点设计特异性引物，PCR扩增目的片段后用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳进行个体分型。对于突变位点一(NC_007303.6g.48797975-48798004 delTGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA)，当该位点发生缺失突变时，PCR扩增产物缺失TGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA序列，II基因型表现为161bp片段，ID基因型表现为161bp和131bp片段，DD基因型表现为131bp片段；对于突变位点二(NC_007303.6g.48816764ins TTCTTTTGGCAACTGCAG)，当该位点发生插入突变时，PCR扩增产物插入TTCTTTTGGCAACTGCAG序列，DD基因型表现为330bp条带，II基因型表现为348bp条带，ID基因型表现为330bp和348bp条带；对于突变位点三(NC_007303.6g.48896074-48896095 delTTTTTCTTTGTCTGGTACACTT)，当该位点发生缺失突变时，PCR扩增产物缺失TTTTTCTTTGTCTGGTACACTT序列，II基因型表现为221bp条带，DD基因型表现为199bp条带，ID基因型表现为221bp和199bp条带；对于突变位点四(NC_007303.6g.48903091ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT)，当该位点发生插入突变时，PCR扩增产物插入AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT序列，DD基因型表现为332bp条带，II基因型表现为369bp条带，ID基因型表现为332bp和369bp条带。通过对中国地方黄牛MSRB3基因以上4个indel位点基因型频率和等位基因频率进行检测，有助于快速建立遗传资源优良的地方黄牛种群。
<110> 西北农林科技大学
<120>一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法
<160> 12
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acgcactgta tgattcca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ataggccaag atagaggc 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gggtgttcat tcattcatt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtcttacctc agtagccatg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gcataagaaa gccaacct 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cagcctcatc atctcatcca 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gagccctaat ggataaaa 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
agtgttgaag ttgcctgt 18
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> NC_007303.6 g.48797975-48798004 del
<400> 9
tggggagtag ttactgactg aaggaaaaca 30
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> NC_007303.6 g.48816764 ins
<400> 10
ttcttttggc aactgcag 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> NC_007303.6 g.48896074-48896095 del
<400> 11
tttttctttg tctggtacac tt 22
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> NC_007303.6 g. 48903091 ins
<400> 12
agctgatgta taacctccat aacttgcttt cccccct 37

Claims (6)

1.一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待检黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P3、P4为引物，分别PCR扩增黄牛个体MSRB3基因部分片段，通过电泳检测PCR扩增产物，根据电泳检测结果分别判定黄牛个体MSRB3基因上三个插入/缺失突变位点的基因型；
所述引物对P1为：
上游引物：5’-ACGCACTGTATGATTCCA-3’
下游引物：5’-ATAGGCCAAGATAGAGGC-3’
所述引物对P3为：
上游引物：5’-GCATAAGAAAGCCAACCT-3’
下游引物：5’-CAGCCTCATCATCTCATCCA-3’
所述引物对P4为：
上游引物：5’-GAGCCCTAATGGATAAAA-3’
下游引物：5’-AGTGTTGAAGTTGCCTGT-3’；
引物对P1扩增的位点：NC_007303.6 g.48797975-48798004 delTGGGGAGTAGTTACTGACTGAAGGAAAACA；
引物对P3扩增的位点：NC_007303.6 g.48896074-48896095 delTTTTTCTTTGTCTGGTACACTT；
引物对P4扩增的位点：NC_007303.6 g. 48903091 ins AGCTGATGTATAACCTCCATAACTTGCTTTCCCCCCT；
对于由引物对P1扩增的插入/缺失突变位点，II基因型表现为161bp条带，DD基因型表现为131bp条带，ID基因型表现为161bp和131bp两个条带；对于由引物对P3扩增的插入/缺失突变位点，II基因型表现为221bp条带，DD基因型表现为199bp条带，ID基因型表现为221bp和199bp两个条带；对于由引物对P4扩增的插入/缺失突变位点，DD基因型表现为332bp条带，II基因型表现为369bp条带，ID基因型表现为332bp和369bp两个条带。
2.根据权利要求1所述一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法，其特征在于：还包括以下步骤：以待检黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，PCR扩增黄牛个体MSRB3基因部分片段，通过电泳检测PCR扩增产物，根据电泳检测结果判定黄牛个体MSRB3基因上插入/缺失突变位点的基因型；
所述引物对P2为：
上游引物：5’-GGGTGTTCATTCATTCATT-3’
下游引物：5’-GTCTTACCTCAGTAGCCATG-3’；
引物对P2扩增的位点：NC_007303.6 g.48816764 ins TTCTTTTGGCAACTGCAG；对于由引物对P2扩增的插入/缺失突变位点，DD基因型表现为330bp条带，II基因型表现为348bp条带，ID基因型表现为330bp和348bp两个条带。
3.根据权利要求1或2所述一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃~54℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
4.根据权利要求1或2所述一种检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法，其特征在于：所述电泳采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.一种如权利要求1所述的检测黄牛MSRB3基因插入/缺失标记的方法在黄牛分子标记辅助选择育种的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在由所述引物对P1扩增的插入/缺失突变位点，个体体斜长、胸围和十字步高对应的生长性状优势基因型为纯合基因型；在由所述引物对P3扩增的插入/缺失突变位点，个体体重、胸长指数和胸围指数对应的生长性状优势基因型为II基因型；在由所述引物对P4扩增的插入/缺失突变位点，个体坐骨端宽对应的生长性状优势等位基因为插入突变等位基因I。
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